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Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Laboratorio de Citogenética General. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones -UNaM-IBS-CONICET - Universidad Nacional de Córdoba. 2014 126 h. con Anexos. tabls.; grafs.; maps. Contiene Referencia Bibliográfica.

En la presente tesis se estudió la factibilidad de caracterizar y modelar la tecnología de ahumado aplicada a una especie pesquera pelágica de Argentina, buscando a partir de las experiencias realizadas obtener un producto de alta calidad final. Se trabajó sobre la especie Scomber japonicus, teleósteo de acuerdo a la clasificación científica por tener un esqueleto óseo, por su tipo de hábitat marino se considera pelágico y por su contenido lipídico una especie grasa. Aproximadamente el 76% de las capturas en el Océano Atlántico Sudoccidental, donde se ubican los principales puertos de Argentina, están destinadas a su elaboración como conserva, siendo apreciada por la excelencia del producto que se obtiene. El porcentaje restante se exporta como pescado entero congelado, siendo, por lo tanto este producto y la conserva, los dos productos que se elaboran en Argentina con esta especie. Las estadísticas indican la posibilidad de expansión del mercado incluyendo productos diferentes. Es por ello que la aplicación de tecnologías tradicionales de procesamiento de pescado, como es el ahumado, se presentan como alternativas para el desarrollo de productos alimenticios de alta calidad nutricional. El presente trabajo de tesis fue desarrollado en la ciudad de Mar del Plata, caracterizada por su actividad portuaria permitiendo la disposición del recurso pesquero, de infraestructura y equipos para realizarla, con el objetivo de transferir a la industria los conocimientos aportados por el mismo. En este contexto, se analizaron experimentalmente las distintas etapas que componen el proceso de ahumado sobre la especie, desde la materia prima hasta el producto final listo para consumir, considerando tanto los aspectos fisicoquímicos y nutricionales como sensoriales y microbiológicos implicados.

Increased size exclusion limit 2 (ISE2) codifica una presunta helicasa de ARN de tipo DEVH-box originalmente identificada a partir de una búsqueda de mutantes de Arabidopsis con alteraciones en la apertura de los plasmodesmos (PD). La deleción de ISE2 afecta también la actividad de los cloroplastos, disminuye la acumulación de pigmentos fotosintéticos y altera la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis. En este trabajo demostramos la localización cloroplástica de ISE2 y estudiamos su rol en el procesamiento del ARN plastídico y, consecuentemente, en las funciones de los PD. Los ARN cloroplásticos de tipo II conteniendo intrones muestran un empalme defectuoso en las mutantes ise2 y en plantas con ISE2 silenciado, lo que compromete la viabilidad del plástido. Además, ensayos de inmunoprecipitación de ARN sugieren que ISE2 interactúa in vivo con varios ARNs regulados por empalme. Finalmente, mostramos que la mutante clpr2 (con defectos en una subunidad del complejo de proteasas Clp en el cloroplasto) también exhibe un funcionamiento anormal de los PD durante la embriogénesis, apoyando la idea de que el procesamiento de ARN cloroplástico es requerido para regular la comunicación célula a célula en las plantas.

Las enfermedades producidas por patógenos virales generan cuantiosas pérdidas en la producción de cultivos de importancia agropecuaria. El impacto de los virus en la alteración de la expresión génica explica, en parte, las reducciones en el rendimiento de estos cultivos. Por este motivo, entender los mecanismos por los cuales los virus modulan la expresión de genes del hospedante es de vital importancia para proponer estrategias antivirales efectivas o perfeccionar las que se están utilizando en la actualidad. En este estudio, se empleó una línea transgénica de Arabidopsis thaliana que expresa la proteína de cápside del virus TMV-Cg (CgCP) con el objetivo de estudiar el efecto de esta proteína en las alteraciones de la expresión génica y su concomitante impacto sobre los mecanismos de defensa. Inicialmente, se analizó el efecto de la CgCP sobre la expresión de genes implicados en vías de defensa, observándose que la CgCP modula negativamente la expresión de genes que participan de la vía de defensa mediada por ácido salicílico (SA, por sus siglás en inglés) y que, además, tienen un rol reportado frente a defensa antiviral. A continuación, se procedió a analizar el impacto global de la CgCp sobre el transcriptoma de A. thaliana por medio de un microarreglo realizado en plantas que expresan la CgCP. Los resultados indicaron que la CPCg altera la expresión de genes que están implicados en una amplia variedad de procesos. El uso de herramientas bio-informáticas permitió determinar que la CgCP regula negativamente la expresión de una red de genes que presentan en sus regiones promotoras motivos de respuesta a los factores de transcripción W-BOX y al factor Non-Expressor of PR 1(NPR1), un factor central en la vía del SA. Paralelamente, se observó que durante la infección con el virus TMV-Cg los genes dependientes de la vía de SA son incrementados a tiempos tempranos de infección, mientras que su expresión disminuye a tiempos tardíos. Por otra parte, se observó que la expresión de la CgCP en plantas de A. thaliana produce un retraso en el crecimiento. En base a estas observaciones, se procedió a estudiar la capacidad de la CgCP de alterar la estabilidad de las proteínas DELLA, las cuales están implicadas en la regulación de vías de desarrollo, como también en la supresión de la vía de defensa mediada por SA. Se observó que la proteína CgCP altera la estabilidad de la proteína RGA, una de las cinco proteínas DELLAs codificadas por el genoma de A. thaliana. Por otra parte, ensayos realizados con el virus TMV-Cg mostraron que el virus altera la estabilidad de otra proteína DELLA, la proteína GAI. Además, plantas mutantes para cuatro de los cinco genes que codifican proteínas DELLAs acumularon menores niveles del virus TMV-Cg que las plantas salvajes. En conclusión, los resultados de esta tesis muestran que la CgCP altera la expresión de un amplio conjunto de genes de A. thaliana. En particular, esta proteína modula negativamente un grupo de genes de defensa, dependientes de la vía de SA, a través de la estabilización de las proteínas DELLA. Estos resultados sugieren que la CgCP alteraría la estabilidad de las proteínas DELLAs como un mecanismo para modular negativamente las respuestas de defensa antivirales.

Anadenanthera colubrina var. cebil constituye un recurso forestal nativo Sudamericano el cual presenta una distribución discontinua en Argentina, restringiéndose su presencia a las provincias biogeográficas paranaense y de las Yungas. La hipótesis sobre la cual se sustentó el presente trabajo sostiene que el flujo génico homogeneiza las frecuencias génicas entre las poblaciones contrarrestando los efectos de la deriva genética provocados por la fragmentación. Los objetivos generales de este trabajo fueron: indagar acerca del rol evolutivo del flujo génico y de la deriva genética como fuerzas modeladoras de las frecuencias génicas en las poblaciones fragmentadas y determinar la importancia del movimiento de los alelos a través de la dispersión de las semillas y del polen. Se emplearon marcadores moleculares selectivamente neutros de herencia biparental, microsatélites nucleares, y de herencia uniparental, microsatélites cloroplásticos.

La SUMOilación es una modificación post-traduccional de proteínas exclusiva de eucariotas, intensamente estudiada en la actualidad. Esta modificación consiste en la unión covalente de una proteína con homología estructural a ubiquitina, llamada SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), a un residuo de lisina de la proteína blanco, alterando su superficie de interacción y afectando así su localización, estabilidad, actividad y/o interacción con otras proteínas. Normalmente sólo un bajo porcentaje de una proteína se encuentra SUMOilada en un momento dado y el efecto que esta modificación ejerce en ella no puede ser predicho a priori. La SUMOilación es una modificación dinámica y reversible, asociada a muchos procesos celulares como replicación y reparación del ADN, remodelación de la cromatina, segregación cromosómica, metabolismo del ARN, transporte núcleo-citoplasma, etc. De hecho, la SUMOilación ha demostrado ser esencial en muchos organismos, incluyendo nuestro modelo de estudio, Trypanosoma brucei. T. brucei es un parásito extracelular de la familia Trypanosomatidae responsable de la tripanosomiasis africana o enfermedad del sueño en humanos y del Nagana en ganado. Estas enfermedades son endémicas del continente africano, lugar de residencia de su insecto vector: la mosca del género Glossina (tse-tse). El ciclo de vida de este kinetoplástido alterna entre formas replicativas y no replicativas ya sea dentro del hospedador mamífero como del insecto vector, pero sólo dos de ellas, la forma procíclica (intestino de la mosca) y sanguínea alargada (sangre/líquidos tisulares del mamífero) son cultivables de manera axénica en el laboratorio. T. brucei presenta un mecanismo sofisticado de variación antigénica que le permite evadir la respuesta inmune humoral montada por el hospedador contra su principal glicoproteína de superficie (VSG). Recientemente, este proceso ha sido asociado de manera directa con la SUMOilación de proteínas aún no caracterizadas. Considerando la relevancia de esta modificación post-traduccional en este trabajo de Tesis nos propusimos identificar de manera global proteínas SUMOiladas en el parásito. Para llevar esto a cabo, desarrollamos líneas transgénicas de parásitos procíclicos y sanguíneos en las que los dos alelos que codifican para TbSUMO fueron reemplazados por variantes etiquetadas para permitir la purificación de proteínas SUMOiladas en base a diferentes principios de afinidad y posterior identificación por espectrometría de masas. Estas líneas celulares nos permitieron validar la funcionalidad de las etiquetas empleadas pero las proteínas SUMOiladas no pudieron ser enriquecidas significativamente por sobre los contaminantes de la purificación. Las líneas transgénicas desarrolladas a continuación expresaron exclusivamente una versión de TbSUMO etiquetada en su extremo N-terminal y deficiente en residuos de lisina, reduciendo la co-purificación de proteínas contaminantes tras digestión con la endoproteasa Lys-C. Esta estrategia permitió la identificación de un número reducido de proteínas SUMOiladas. Sin embargo resultó de utilidad para demostrar que las cadenas de poliSUMO no serían esenciales para la viabilidad del parásito. Para optimizar los resultados obtenidos implementamos finalmente una estrategia recientemente descripta en la que expresamos una variante de TbSUMO que posee etiquetas para la detección y purificación de conjugados en su extremo N-terminal y una mutación cercana a su extremo C-terminal T106K. Esta modificación genera un sitio de clivado para la enzima Lys-C permitiendo que un fragmento de TbSUMO de solo 114 Da (motivo diglicina) permanezca unido al péptido modificado tras la digestión con la enzima. Tras un paso de enriquecimiento con anticuerpos anti diglicina, estos péptidos pequeños en forma de T pueden ser identificados por espectrometría de masas. De esta manera es posible realizar la identificación de las proteínas SUMOiladas y sus sitios de SUMOilación en un mismo experimento de proteómica. Siguiendo esta metodología pudimos identificar en parásitos procíclicos 52 sitios de SUMOilación en 44 proteínas de manera confiable, muchas de ellas asociadas a procesos de replicación y reparación del ADN, procesamiento y degradación del ARN, etc. Estos resultados en conjunto permiten evidenciar el rol de este modificador en la regulación de muchos `procesos fisiológicos relevantes para T. brucei. Para el estudio posterior de las proteínas SUMOiladas de interés desarrollamos también un sistema de SUMOilación específico para T. brucei en un sistema heterólogo bacteriano. Dado que la maquinaria de SUMOilación se encuentra ausente en procariotas, co-expresamos en E. coli las enzimas TbE1a, TbE1b, TbE2 y TbSUMO con etiquetas apropiadas en dos vectores compatibles de la serie Duet (pCDFDuet-1-TbSUMO-TbE2 y pACYCDuet-1-TbE1a-TbE1b). La proteína a SUMOilar fue co-expresada en el sistema completo con una etiqueta en su extremo C-terminal, para evaluar su patrón de modificación por Western blot en extractos bacterianos solubles. Esta estrategia nos permitió describir la formación de cadenas de poliSUMO in vitro y evaluar la SUMOilación de un sustrato modelo, como PCNA de Saccharomyces cerevisiae. Para validar la modificación de esta proteína blanco realizamos ensayos de deconjugación in vitro empleando la proteasa recombinante TbSENP. Esta proteasa específica de T. brucei permite revertir el patrón de SUMOilación del sustrato observado por Western blot. Este sistema sencillo y versátil constituye una herramienta fundamental para la validación de potenciales sustratos de SUMOilación, generación de mutantes, estudios funcionales y determinación de sitios de SUMOilación.

Mediante técnicas de microscopía óptica, electrónica de transmisión y electrónica de barrido y de inyección intraneural de colorantes, se estudió la morfología, ultraestructura, desarrollo postembrionario y conexiones nerviosas de los ocelos de T. infestans, así como su adaptación a la luz-oscuridad. pudo constatarse que estos órganos exhiben un nivel de complejidad no descripto para otros insectos. El rabdoma retinular involucra todas las caras laterales de las células fotorreceptoras. Se observaron gránulas de pigmento en el interior de las células fotosensibles, en células de la glía y en células pigmentarias. Los primeros se desplazan alrededor del rabdoma durante la adaptación a la luz y se retiran a la porción proximal de la célula en el acelo adaptado a la oscuridad. Se describen diversas estructuras membranosas subcelulares y organelas citoplasmáticas. El plexo acelar exhibe todas las formas de uniones sinápticas (i.e. axo-dendríticas, axo-axónicas, dendro-axónicas y dendro-dendríticas). El estudio de las vías acelares reveló conexiones directas, vía interneuronas de primer orden con centros nerviosos localizados en el cerebro, y diversos neurómeros de la cadena ganglionar ventral. También se describen las proyecciones centrales y se discute la función de sensilias mecanorreceptoras localizadas en la región acelar.

El complejo I es el punto de entrada principal de los electrones en la cadena respiratoria mitocondrial. En varios organismos eucariotas, exceptuando animales y hongos, el complejo I posee un dominio extra (dominio CA) compuesto por trímeros de proteínas con alta similitud a anhidrasas carbónicas de tipo gamma (γ-CAs). En Arabidopsis thaliana existen cinco genes nucleares que codifican para estas γ-CAs. Tres de las proteínas codificadas son denominadas CA (Carbonic Anhidrase) 1, CA2 y CA3. Las restantes poseen una estructura primaria menos conservada y se las denomina CAL (Carbonic Anhidrase Like) 1 y CAL2. Estudios realizados utilizando mutantes simples de Arabidopsis para cada una de estas subunidades CA no lograron esclarecer el rol fisiológico funcional del dominio CA. Ha sido sugerido que este dominio es importante en el contexto de la fotorrespiración por su participación en el reciclado de CO2 mitocondrial que permite el mantenimiento de una tasa normal de fijación de carbono en plantas. En este trabajo, se reportan evidencias experimentales que apoyan esta hipótesis utilizando mutantes de Arabidopsis carentes de dos subunidades CA que muestran fenotipos alterados. Mutantes dobles crecidas en condiciones ambientales normales presentan un retardo en el crecimiento en comparación con plantas salvajes. Este fenotipo puede ser rescatado cultivando dichas plantas en atmósferas con altas concentraciones de CO2. Adicionalmente, bajo condiciones fotorrespiratorias, la asimilación de carbono se ve disminuida y la glicina se acumula en las dobles mutantes, sugiriendo un desequilibrio relacionado con la fotorrespiración. Sumado a esto, los niveles de transcriptos de los genes que codifican para las subunidades CA se encuentran reducidos en plantas salvajes crecidas bajo condiciones no fotorrespiratorias. Estos resultados permiten vincular el rol funcional del dominio CA con la vía fotorrespiratoria. Por otro lado, también se reportan mutantes dobles que presentan un fenotipo de letalidad del embrión, presentando semillas inmaduras incoloras que colapsan al secarse. Esto muestra que la falta de dos subunidades CA puede dar lugar también a un fenotipo letal. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo permitieron generar conocimiento acerca del rol fisiológico de las anhidrasas carbónicas de tipo gamma (γ-CAs) que conforman el dominio CA del complejo I mitocondrial de plantas; mostrando que este dominio resulta esencial para la viabilidad de los embriones y contribuye a sostener una fotosíntesis eficiente bajo las condiciones ambientales actuales.

Las plantas son el sistemas más económico y seguro de producción de proteínas recombinantes. Entre las estrategias utilizadas con esta finalidad, los sistemas de expresión transitoria en hojas se han posicionado como uno de los métodos de elección. Para el caso de moléculas que requieren modificaciones post-traduccionales la expresión se realiza dentro la vía secretoria. A fin de explorar una estrategia para mejorar la acumulación de proteínas dentro de la célula vegetal evitando la degradación típica del apoplasto, en este plan se propone evaluar las posibles aplicaciones de direccionar proteínas cago a vacuolas para mejorar sus rendimientos y, a su vez, estudiar si la sobreexpresión de factores de transcripción involucrados en el desarrollo de la semilla tendrían la capacidad de estimular el desarrollo de la vía secretoria, lo que permitiría mejorar el plegamiento de las proteínas foráneas, su transporte a lo largo de la vía secretoria y también incrementar su estabilidad.

Tesis para obtener el grado de Magíster en Producción Vegetal, de la Universidad Nacional del Nordeste, en 2017