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Los canales de calcio dependientes del voltaje (CaV) acoplan la despolarización de la membrana al influjo de calcio, desencadenando una diversidad de procesos celulares dependientes del calcio. Los CaV son, por lo tanto, críticos en la configuración de la actividad y función neuronal. Existen al menos diez genes que codifican para distintos subtipos de CaV, los cuales poseen características biofísicas particulares que les permiten cumplir fun-ciones muy diversas como el control de la excitabilidad neuronal (CaV3), la liberación de neurotransmisores (CaV2) y la transcripción (CaV1). Muchos neurotransmisores y fármacos que actúan a través de receptores acoplados a proteína G (GPCR) modulan la actividad neuronal al alterar la expresión, el tráfico o la función de los CaV. Los mecanismos depen-dientes de GPCR que regulan la densidad de los CaV en la superficie celular se observan en muchas neuronas pero están menos estudiados que otros efectos celulares de los GPCR. En el primer capítulo de esta tesis mostramos que la actividad constitutiva del re-ceptor de la hormona ghrelina (GHSR) puede inhibir el tráfico hacia la membrana plasmática de varios subtipos de CaV (CaV1.2, CaV1.3, CaV2.2, CaV3.2 y CaV3.3) en ausencia de ghre-lina utilizando como sistema experimental células HEK293T transfectadas en forma transitoria. Además mostramos que las corrientes CaV1 nativas en cultivos primarios de neuronas hipotalámicas son moduladas por la actividad constitutiva de GHSR. Esta forma basal de inhibición de los CaV depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Dicha proteína promueve que la subunidad principal CaVα1 sea exportada desde el retículo endo-plásmico hacia la superficie celular. De este modo, las acciones de GHSR en el tráfico de los CaV sugieren un nuevo papel para esta vía de señalización en áreas del cerebro que controlan la ingesta de alimentos, la recompensa, el aprendizaje y la memoria. Por otro lado, observamos que la aplicación aguda de ghrelina a células coexpresando GHSR y CaV3.3 inhibía la corriente macroscópica registrada, efecto que no se observaba al coex-presar el subtipo CaV3.2. Este hallazgo originó el segundo capítulo de esta tesis donde exploramos el efecto de ghrelina en los tres subtipos de CaV3 de expresión neuronal. Pudi-mos demostrar que ghrelina inhibe las corrientes T nativas en neuronas hipotalámicas y mediante la expresión heteróloga en células HEK293T determinamos que el subtipo Cav3.3 resultó ser el único sensible a dicha modulación. La modulación de CaV3.3 por ghrelina comprende una reducción en la conductancia máxima, un desplazamiento a voltajes hiper-polarizados de la curva corriente voltaje (curva I-V) y de la curva del estado estacionario de inactivación, y una aceleración de la cinética de activación e inactivación. Además nuestra predicción basada en modelado indica que la inhibición de CaV3.3 atenuaría la estimulación de los disparos de potenciales de acción originados por la inhibición de las corrientes de potasio por parte de ghrelina. En resumen, descubrimos un nuevo blanco de ghrelina en las neuronas: los CaV3.3. Este mecanismo implicaría una regulación negativa de la activación neuronal ejercida por la ghrelina. En conjunto nuestro trabajo contribuye al conocimiento de la amplia gama de acciones de GHSR, un receptor potencialmente útil para el desarrollo de fármacos para tratar desórdenes alimenticios.

Tesis (Magister en Ciencia y Tecnología de los alimentos) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017

Las subpoblaciones de linfocitos Th17 y T regulatorios (Treg) han sido relacionados con la progresión a enfermedad en el contexto de la infección por HIV-1. Sin embargo, su relación con la respuesta adaptativa T CD8+ antiviral durante la infección aguda/temprana por HIV (PHI, primary HIV infection) no ha sido aún estudiada. En este contexto, el primer objetivo general de este trabajo de tesis consistió en analizar las subpoblaciones Th17 y Treg y su relación con la respuesta celular T CD8+ específica frente a HIV y parámetros de seguimiento de la infección durante la infección aguda/temprana y hasta un año postinfección (p.i). Para ello se utilizaron muestras de sangre de 14 dadores sanos (DSs), 40 PHI, 17 Crónicos y 13 controladores elite (ECs, Elite Controllers). Los porcentajes de células Th17 y Treg se encontraban severamente alterados en individuos Crónicos, mientras que todos los pacientes infectados con HIV evidenciaron un desbalance Th17/Treg comparados con DSs (incluso ECs), en concordancia con sus mayores proporciones de células T CD8+ activadas (HLA-DR+/CD38+). Un mejor estatus clínico (evidenciado por mayores recuentos de células T CD4+ y menores cargas virales y activación inmune) se asoció con mayores niveles de Th17 y menores niveles de Treg. Notablemente, se encontraron correlaciones positivas entre los niveles basales de Th17 y la funcionalidad de la respuesta T CD8+ específica frente a HIV: la capacidad de suprimir la replicación viral (VIA, viral inhibitory activity) y la proporción de células polifuncionales (IFN-γ+/CD107A/B +) tanto a tiempos tempranos como tardíos p.i, resaltando el valor pronóstico de la subpoblación Th17 en la preservación de una inmunidad celular antiviral más eficiente. La relación Th17/Treg y la intensidad media de fluorescencia relativa (IMFr) de IL-17 también se correlacionaron positivamente con VIA. Debido a la importancia del tratamiento antirretroviral (TARV) en la reconstitución inmune de individuos infectados, a continuación se decidió caracterizar las subpoblaciones Th17, Treg y su balance en sangre periférica y mucosa cervical y su implicancia en la inmunopatogénesis de HIV-1 en ausencia o presencia de TARV. Para ello se utilizaron muestras de 19 individuos TARV+ (más de 2 años con supresión efectiva de la CV), 22 pacientes crónicamente infectados naïve de tratamiento (TARV-) y 20 DSs. Tras el tratamiento, tanto la frecuencia de Th17 como la relación Th17/Treg en periferia alcanzaron valores similares a los observados en DSs, en contraste a lo observado en células Treg cuyos niveles se mantuvieron altos. Asimismo, en individuos TARV+ se observó una disminución de los niveles de activación inmune a pesar de lo cual no se alcanzaron valores normales, hallándose correlaciones negativas entre los niveles de activación celular y el balance Th17/Treg. Por otro lado, mayores niveles de la citoquina proinflamatoria IL-1β en exocervix se correlacionaron positivamente con los niveles de activación celular periféricos, sugiriendo que existiría una relación entre los niveles de inflamación sistémicos y lo observado en sitios de mucosas. Es importante destacar que el tratamiento no indujo un incremento de los recuentos de células T CD4+ CD161+ (subpoblación de células precursoras de Th17 que migran a intestino) los cuales resultaron significativamente menores a los observados en DSs. Asimismo, al estudiar el patrón de secreción de citoquinas por parte de células mononucleares de cérvix (CMCs) estimuladas, se observó que las CMCs provenientes de individuos TARV+ secretan menores niveles de IL-17A e IL-10 en relación a las de DSs. En conjunto, los resultados de la presente tesis sugieren, por un lado, la existencia de una potencial relación entre la subpoblación Th17 y el balance Th17/Treg con respuestas T CD8+ HIV-específicas que juegan un rol clave en la contención de la infección. Por otro lado, aunque el tratamiento antirretroviral parece tener un impacto positivo sobre la restauración de las funciones inmunes a nivel sistémico, tanto los niveles de precursores de células Th17 que migran a intestino como la secreción de IL-17A e IL-10 por CMCs no alcanzaron valores normales, sugiriendo que en sitios de mucosas la restauración inmune es incompleta.

Los antibióticos β-lactámicos son la clase de antibiótico más utilizada. Sin embargo, el uso indiscriminado de antibióticos propulsó la generación de mecanismos de resistencia bacterianos. La diseminación global de esas estrategias entre bacterias de diferentes especies hace que los antibióticos conocidos se tornen ineficientes. Para restablecer la efectividad de los compuestos conocidos, se propone incorporar a los tratamientos inhibidores de los mecanismos de resistencia. El mecanismo más potente y mayormente empleado por las bacterias para hacer frente a la acción de antibióticos β-lactámicos es la producción de β-lactamasas. Estas enzimas hidrolizan el anillo β-lactama, dejando al compuesto inefectivo. Dentro de estas enzimas se encuentran las metalo-β-lactamasas (MβLs), que son enzimas dependientes de Zn(II), cuya relevancia clínica se debe a su capacidad para hidrolizar eficientemente los antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso, los carbapenemes. Al momento, no se cuenta con inhibidores de uso clínico para estas enzimas. Dentro de las MβLs, las enzimas de subclase B1 son las de mayor relevancia clínica. La enzima B1 New Dheli Metallo-β-Lactamase-1 (NDM-1), es una de MβLs de mayor relevancia clínica debido a su rápida diseminación y eficiente actividad carbapenemasa. Esta enzima posee dos iones metálicos en su sitio activo, ocupando los sitios conocidos como sitios 3H o 1 y DCH o 2. En el presente trabajo se propuso estudiar las características bioquímicas y biofísicas de esta enzima, el mecanismo por el cual cataliza la hidrólisis de carbapenemes y la relación entre la estructura su mecanismo catalítico.Se logró purificar a NDM-1 en forma soluble con buen rendimiento y contenido metálico. Esta enzima mostró ser eficiente al hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. La capacidad de unir Zn(II) fue medida por ensayos de competencia frente al quelante colorimétrico PAR. Estos ensayos mostraron que la incorporación de metal ocurre de manera secuencial, siendo mayor la afinidad por el primer ion metálico que por el segundo. Luego de la remoción del metal nativo, la enzima pudo incorporar Co(II) y Cd(II) en ambos sitios metálicos. Ambas proteínas metalo-sustituídas fueron activas, demostrando que estos metales pueden utilizarse como sondas espectroscópicas funcionales en esta enzima. El espectro de absorbancia de la proteína bi-Co(II)-NDM-1 mostró un patrón de 5 bandas de campo ligando (bandas d-d), propias de la coordinación de los iones metálicos en el sitio 3H, y una banda de transferencia de carga metal-ligando, producto de la interacción del Co(II) en el sitio DCH con la cisteína. La incorporación de Cd(II) a NDM-1 fue examinada por RMN de 113Cd(II). En el espectro se visualizaron dos bandas principales y cada una fue asignada a un sitio metálico. Estas señales fueron alteradas al incubar la enzima con el inhibidor de MβLs diseñado por el grupo, L-CS319, denotando que el compuesto interacciona con ambos metales al momento de su unión. Por lo tanto, estas enzimas pueden ser empleadas para estudiar cambios en la coordinación de los metales en el sitio activo durante procesos catalíticos o de unión de ligandos. En una segunda etapa, se estudió el mecanismo de hidrolisis de carbapenemes por NDM-1, utilizando técnicas de cinética rápida y diversas espectroscopias. Los datos obtenidos al estudiar el proceso de hidrólisis catalizado por bi-Zn(II)-NDM- y bi-Co(II)-NDM-1, revelaron que ambas enzimas emplean el mismo mecanismo de reacción. Este mecanismo es ramificado e incluye dos intermediarios de reacción productivos (EI1 y EI2). Sólo EI2 puede dar origen a un complejo EP estable. La formación de este complejo fue estudiada por titulación con sustrato hidrolizado en la enzima sustituida con Co(II). Los productos generados durante la hidrólisis de imipenem se estudiaron por RMN de 1H. En estos ensayos, se evidenció que la protonación era estereoselectiva y se concluyó que cada intermediario de reacción tendría que dar lugar a productos diferentes. La identidad de estas especies fue estudiada por cálculos computacionales. Por esta técnica, se comprobó que podría producirse la acumulación de especies intermediarias con carga negativa, cuya estabilidad dependería de la deslocalización de la carga y de interacciones con los iones metálicos. El pasaje de un intermediario a otro estaría marcado por la pérdida del agua coordinada a puente. Estudios recientes de nuestro grupo con las MβLs B2 Sfh-I y B3 GOB-18 (en su forma mono-metalada), revelaron que la hidrólisis de carbapenemes por estas enzimas cursa por medio del mismo mecanismo de reacción y que durante el proceso se acumulan intermediarios con características espectroscópicas similares a los observados en NDM-1. Estos resultados establecen al mecanismo catalítico como un punto de partida para el diseño racional de inhibidores activos frente a las tres subclases.El sitio activo de las MβLs B1 se encuentra rodeado por dos bucles, nombrados L3 y L10. Se ha reportado que el L3 tendría un papel fundamental en la primera interacción de la enzima con los sustratos y que ayudaría al posicionamiento de los mismos por medio de interacciones hidrofóbicas. Para evaluar la función de esta estructura en NDM-1, se generaron dos variantes en las que se intercambió el bucle nativo por el de enzimas de relevancia clínica de la misma subclase VIM-2 e IMP-1 (nombradas L3VIM y L3IMP), y una tercera variante en la que se insertó un residuo de prolina en la base del bucle (L3Pro). Las propiedades de estas variantes fueron evaluadas in bacteria e in vitro. Las variantes mostraron una disminución en su estabilidad y alteraciones en su afinidad por metal, siendo la variante L3VIM la que más se diferenció de la enzima salvaje. A diferencia de lo esperado, no se observaron grandes cambios en el perfil de sustrato de las variantes, pero si se evidenció una alteración en la acumulación de intermediarios de reacción durante la hidrólisis de nitrocefina y carbapenemes, indicando cambios en el mecanismo de reacción de las variantes. La vida media de los intermediarios fue mayor en L3IMP y menor en L3VIM y L3Pro. Fue posible resolver las estructuras de las enzimas L3IMP y L3Pro por cristalografía de rayos X. La mayor diferencia entre estas variantes fue la posición del L3 que, con respecto a la estructura de NDM-1, se encontraba más cerca del sitio activo en L3IMP y más alejado en L3Pro. Se encontró una correlación directa entre en tamaño del surco catalítico (modulado por la posición del bucle L3) y la acumulación de intermediarios de reacción: mientras más alejado del sitio activo se encontraba el L3, menor era la acumulación de los intermediarios. Este resultado indica que la secuencia de aminoácidos del L3 puede modular la vida media de los intermediarios, afectando el proceso de catálisis enzimática y estableciendo una correlación entre la estructura y la función en NDM-1.

El presente trabajo de tesis tiene por objetivo desarrollar una estrategia de control de la enfermedad psorosis de los cítricos mediante el uso de cítricos transgénicos resistentes a Citrus psorosis virus (CPsV), agente causal de la enfermedad. Para ello se trabajó con plantas de Citrus sinensis que expresaban un fragmento del gen que codifica para la proteína de cubierta de CPsV en una estructura de tipo hairpin (horquilla), inductora del silenciamiento génico. Este mecanismo otorgó a estas plantas transgénicas resistencia al virus, y en el contexto de esta tesis, se estudió la estabilidad de esta resistencia mediada por silenciamiento a lo largo del tiempo y de sus propagaciones vegetativas por injerto sobre un pie de Citrus jambhiri Lush. Se analizó además la transmisión del silenciamiento a través del injerto y el movimiento de sus señales a larga distancia. Finalmente se desafió a los injertos con CPsV para evaluar el impacto de la transmisión del silenciamiento sobre la resistencia al virus.

El presente tema me fue sugerido por el doctor Danilo C. Vucetich, quién me hizo notar el interés que tendría, realizar un trabajo que permitiera determinar si el método de Mezger, Rall y Hess, era aplicable en nuestro ambiente a la determinación de la edad de las escrituras. En nuestro país se han omitido numerosos informes periciales contradictorios relacionados con la aplicabilidad de dicho método, y de allí la necesidad de realizar un trabajo experimental que fijara el punto do vista actual al respecto sin pretender dar una explicación del proceso físico- químico que rige la migración de los cloruros.

El Balance del Contenido Vaginal (BACOVA) genera el nuevo concepto de determinación de Estados Vaginales Básicos (EVBs), que define con un alto valor predictivo el estado funcional vaginal de toda mujer estudiada (1). Es una metodología morfológica que estudia la Disfunción Vaginal (DV) y utiliza el valor numérico de Nugent (2). Agrega la presencia de levaduras, Trichomonas, morfotipos bacterianos extraños al contenido vaginal (CV) y con un alto valor predictivo la determinación cuantitativa controlada de leucocitos y de células epiteliales no habituales (1). Estos criterios tienen valores predictivos diferentes, pero definen el EVB, información útil para ajustar decisiones clínico / terapéuticas inmediatas y/o de seguimiento (3).

Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la información existente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo se lleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye la información 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado de estructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estos últimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuida homogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existen fragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegado final, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de la estructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden ser removidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βL como modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteína correctamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aún en trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no posee puentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es un modelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topología medianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de la estructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vista cinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas también se estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas a tal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegado por GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmente plegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantes para el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estados parcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructurado en dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización no coincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos es compatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de la β-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar la interdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por la hélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizaron tres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados de bacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario, dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14, demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirir estructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia de residuos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia no impide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, que está conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructura secundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulo fundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad de replegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuos eliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampas cinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través del estado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literatura referidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan un plegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que la cadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local en la secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían un papel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que la cadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado.

Objetivo general: Estudiar la potencialidad de los microorganismos del gránulo de kefir y sus metabolitos para inhibir el desarrollo de hongos toxicogénicos y para secuestrar micotoxinas. Objetivos específicos: - Estudiar el efecto antifúngico de los productos fermentados con kefir sobre los hongos toxicogénicos. - Analizar el efecto que ejercen los ácidos orgánicos puros y en mezclas en concentraciones similares a las presentes en los productos fermentados con kefir, en la inhibición del crecimiento de hongos filamentosos toxicogénicos. - Indagar el efecto de los productos fermentados del kefir y de los ácidos orgánicos sobre la producción de micotoxinas por los hongos estudiados. - Evaluar la aplicación potencial de los microorganismos del kefir como un conservante natural sobre alimento para pollos. - Determinar la capacidad de los microorganismos totales del kefir y de microorganismos aislados de los mismos para capturar aflatoxinas bajo diferentes condiciones de cultivo. - Estudiar la capacidad protectora de los microorganismos totales del kefir sobre modelos celulares in vitro