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El virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, es un miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARN segmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. La entrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posterior fusión dependiente de pH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro del citoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia de codificación ambisentido. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside es denominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), se obtienen dos glicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2 y el péptido señal (SP). Estos conforman las estructuras claviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento los mecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en los eventos tempranos del ciclo de replicación viral. En este trabajo se estudiaron aspectos de la interacción virus-célula huésped, caracterizando el rol de distintas proteínas celulares en los eventos tempranos del ciclo de multiplicación del JUNV. En primer lugar se analizó la vía de entrada utilizada por el JUNV para ser endocitado en las células, así como también se estudiaron las proteínas celulares esenciales para este proceso. Con este fin se utilizaron plásmidos que expresan proteínas dominantes negativas, encontrándose que es esencial la Eps-15 y dinamina en el proceso de endocitosis, mientras que las proteínas Rab5 y Rab7 juegan un rol esencial en el paso posterior a la internalización y previo a la fusión. Luego se estudio la interacción del virus con las principales redes del citoesqueleto: los microfilamentos y los microtúbulos. Se utilizaron compuestos capaces de despolimerizar o estabilizar específicamente cada una de estas redes. La internalización del virus disminuyó de manera dosisdependiente en presencia de compuestos que alteraban la integridad de los microfilamentos o estabilizaban los microtúbulos. El tropismo de los virus está regulado por la interacción entre factores celulares y virales durante la transmisión, diseminación y replicación en el huésped. La unión del virus a receptores de superficie específicos determina la susceptibilidad de las células a ser infectadas. La entrada y diseminación de diferentes familias virales puede ser mediada por lectinas de tipo C, como DC-sign o L-sign. Por este motivo se estudió si estas actúan en la infección con el JUNV. Para esto se utilizaron células relativamente no permisivas a la infección por JUNV como las células CHO, las cuales al expresar transientemente las lectinas DC-sign o L-sign fueron infectadas por el JUNV de forma altamente eficiente. Fue demostrado que las células 3T3, que en su forma salvaje no permiten la infección del JUNV, se vuelven permisivas al mismo al expresar de forma estable estas lectinas, y esta interacción es específica lo cual fue demostrado al bloquear la infección con anticuerpos específicos contra las lectinas o el compuesto mannan. Actualmente no hay tratamiento para las fiebres hemorrágicas, por lo que existe una necesidad crítica de desarrollar terapias efectivas para tratar los brotes anuales y contrarrestar su potencial uso como armas biológicas. Todos los virus causantes de fiebres hemorrágicas infectan preferencialmente monocitos, macrófagos y células dendríticas durante las etapas tempranas de la enfermedad. Es por este motivo que estas células representan un blanco potencial en el tratamiento de las fiebres hemorrágicas.

El crecimiento celular polarizado de los tubos polínicos es un proceso oscilatorio que implica una compleja regulación de iones Ca2+, especies reactivas de oxígeno (EROs) y alto tráfico vesicular hacia la zona apical. Durante este proceso ocurre la constante remodelación de la pared celular, la cual debe ser rígida para soportar las presiones citoplasmáticas laterales de turgencia pero a la vez flexible en la zona apical para posibilitar el crecimiento. Para esto, es crucial que el ensamblado de la pared celular se encuentre estrictamente regulado mediante la construcción de una red flexible generada por el entrecruzamiento entre glicoproteínas específicas y homogalacturonanos presentes en el espacio apoplástico. En angiospermas, las glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs) constituyen una de las familias más abundantes de proteínas estructurales que mayor número de modificaciones post-traduccionales sufre. Miembros de esta familia son las extensinas (EXTs), los arabinogalactanos asociados a proteínas (AGPs) y las proteínas repetitivas en prolina (PRPs). Dentro de las EXTs, se encuentra la subfamilia de las proteínas LRXs (Leucine-rich repeat extensins) constituida por 11 miembros, de los cuales 4 (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11), se expresan específicamente en polen maduro y tubo polínico. Dichas proteínas, presentan una estructura modular formada por un dominio N-terminal rico en repeticiones de leucina (LRR) y un dominio C-terminal de tipo extensina plausible de ser glicosilado. En este trabajo de tesis, caracterizamos y estudiamos la función de las proteínas LRXs de polen (LRX8, LRX9, LRX10 y LRX11). Mediante ensayos fisiológicos se demostró que la ausencia de las proteínas LRX8-LRX11, afecta la germinación de los granos de polen, ocasiona alteraciones en la integridad de los tubos polínicos y provoca desviaciones en la herencia mendeliana. Así mismo, se observó mediante microscopía 5 confocal, que la mutante triple pérdida de función lrx9 lrx10 lrx11 presenta fallas en el ensamblado de la pared celular, tales como la deposición alterada de los polisacáridos más abundantes, calosa y pectina. Las evidencias obtenidas sugieren que las proteínas LRX8-LRX11 son necesarias para el mantenimiento de la integridad de la pared celular de los tubos polínicos durante el crecimiento celular polarizado. El motivo EXT presente en las HRGPs se caracteriza por poseer numerosas repeticiones de la secuencia Ser(Pro)3-5. Previo a ser secretadas a la pared celular, es necesario que ocurran tres modificaciones post-traduccionales (MPTs): la monogalactosilación de los residuos serina (Ser) (N-glicosilación), la hidroxilación de los residuos prolina (Pro) a hidroxiprolina (Hyp) y la posterior O-glicosilación de la Hyp. Las enzimas responsables de catalizar la hidroxilación de Pro son las prolil-4-hidroxilasas (P4Hs). Es por ello que estudiamos el rol de las proteínas P4H4 y P4H6, de alta expresión en polen, y la importancia de la hidroxilación de las HRGPs. Los resultados obtenidos mostraron que las mutantes simples p4h4, p4h6 y la mutante doble p4h4 p4h6, presentan una disminución en la tasa de germinación de los granos de polen. Resultados similares se obtuvieron al bloquear la acción de las enzimas P4Hs empleando los inhibidores químicos EDHB (etil-3,4-dihidroxibenzoato) y DP (α,α-dipiridil). Si bien se observó una reducción en el largo de los tubos polínicos de la mutante doble p4h4 p4h6, la disposición y el contenido de pectina en la pared celular de tubos polínicos mutantes fue similar al de plantas wild type. Finalmente, se determinó la posible localización subcelular de la enzima P4H4 en el retículo endoplasmático (RE)/aparato de Golgi en tubos polínicos de plantas transgénicas expresando la construcción pP4H4::P4H4-YFP. En base a lo observado, proponemos que la hidroxilación de las HRGPs, y posiblemente de las LRXs, sería catalizada por las P4Hs en el RE/aparato de Golgi y sería necesaria principalmente durante los primeros estadíos del desarrollo del tubo polínico. Sin embargo, se requerirán nuevos estudios para determinar si, además de P4H4 y P4H6, existe otra enzima de la familia P4H implicada en la hidroxilación de las HRGPs, particularmente las LRX de polen

El virus del dengue produce en humanos la enfermedad viral más frecuentemente transmitida por artrópodos y no existe hasta el momento terapia antiviral ni vacuna alguna. En este trabajo se desarrollaron diferentes herramientas genéticas con el fin de estudiar las distintas etapas de la replicación viral y la interacción del virus con la célula huésped. Así, se obtuvo el primer clon infeccioso del virus del dengue de un aislamiento argentino y distintas generaciones de virus con proteínas reporteras. Empleando estos sistemas genéticos se pudieron disecar las distintas etapas de la replicación viral. La manipulación del genoma viral permitió caracterizar mutantes de N-glicosilación de las proteínas de envoltura y pre-membrana, y estudiar su importancia en las distintas etapas del ciclo viral. El ensayo del virus reportero, el cual permite evaluar la actividad de luciferasa como un marcador de replicación viral, fue miniaturizado para realizar una búsqueda de quinasas de la célula huésped involucradas en la replicación. Para esto se utilizó la tecnología del RNA de interferencia a gran escala. Mediante este ensayo se identificaron distintas quinasas claves en la replicación del virus y se estudió su importancia en la replicación viral. Por último, se aportó nueva infomación sobre el mecanismo celular por el cual la proteína de cápside se dirige a las organelas celulares lipid droplets, y su relación con la proteína celular ADRP. Este trabajo provee nuevas herramientas genéticas y nueva información sobre los requerimientos del virus del dengue para replicar en la célula infectada. Además, realiza un aporte que podría llevar al desarrollo de nuevas estrategias antivirales.

La organización de las comunidades vegetales y su dinámica está determinada en cierto grado por las interacciones que suceden entre las especies que la componen. Estas interacciones se producen debido a que al crecer y desarrollarse una especie afecta los recursos disponibles y condiciones de crecimiento de otras especies que coexisten espacial y temporalmente. La facilitación y competencia son dos clases diferentes de interacciones (positivas y negativas respectivamente), y han sido identificadas como factores importantes en la dinámica de Austrocedrus chilensis (D.Don) Pic. Serm. et. Bizarri. La mayoría de estas interacciones ocurren a través de un factor intermediario, como por ejemplo la sombra. En este sentido la modificación de la intensidad lumínica por debajo del dosel de la vegetación, puede inducir cambios morfológicos y fisiológicos sobre las plantas, y por lo tanto puede afectar su crecimiento y supervivencia. Se ha comprobado que A. chilensis requiere inicialmente para su germinación y establecimiento el efecto protector de especies arbustivas, y también se conoce que con posterioridad estos mismos arbustos pueden afectar negativamente su crecimiento. Sin embargo el signo e intensidad de las interacciones puede variar en relación a las condiciones climáticas y al estadio de vida de los individuos involucrados, y se desconoce como estos factores pueden afectar el crecimiento y supervivencia de los renovales de A. chilensis. El objetivo de esta tesis fue el de estudiar el signo e intensidad de la interacción entre A. chilensis y los arbustos en la etapa comprendida entre el estadio en que los pequeños plantines ya se encuentran establecidos hasta que sobresalen del dosel de la vegetación, bajo la hipótesis de que el balance neto de la interacción depende de: Las características climáticas durante el período de crecimiento, y del tamaño relativo del árbol juvenil de A. chilensis en relación a los arbustos. Para verificar esta hipótesis y comprender algunos de los mecanismos involucrados se establecieron tres objetivos de investigación: Descripción de la respuesta morfológica y fisiológica de A. chilensis en relación a condiciones de crecimiento de intensidad lumínica variable (aclimatación). Estudio del signo y la intensidad de la interacción en relación a las condiciones climáticas y la importancia relativa de A. chilensis y los arbustos, Integración de estos conocimientos en un modelo de simulación del crecimiento de plantas individuales en condiciones de sombreado. Para llevar adelante estas investigaciones se establecieron ensayos donde se observó el crecimiento y supervivencia, durante tres años, de renovales correspondientes a distintas relaciones de importancia entre A. chilensis y arbustos. También se utilizaron plantas que fueron sometidas a la remoción de la vegetación, y se comparó la respuesta en crecimiento de estas dos clases de plantas en años de condiciones climáticas contrastantes. Estas últimas se evaluaron a través de la precipitación acumulada, la integral del déficit de presión de vapor, humedad y temperatura del suelo. La importancia relativa entre los renovales y los arbustos se estableció a través de mediciones del tamaño del tallo principal y de la copa de los renovales y de perfiles porcentuales de luz por debajo del dosel de la vegetación arbustiva. Para evaluar los cambios morfológicos y fisiológicos inducidos por la sombra se emplearon datos de renovales en condiciones naturales de crecimiento y plantines sometidos a distintos niveles de sombreado artificial. En estos se describieron variables fotosintéticas, de morfología de las hojas e incluso de distribución de biomasa entre componentes (tallos, hojas y raíces) en relación a la intensidad lumínica. El modelo de simulación del crecimiento se construyó de acuerdo a los conceptos de la Dinámica de Sistemas. Para esto se identificaron los principales factores y relaciones considerados como determinantes del crecimiento de A. chilensis. El modelo se parametrizó obteniéndose un modelo cuantitativo, que se empleó para analizar el comportamiento del mismo en relación a cambios en la intensidad lumínica bajo el dosel del arbustal. En relación al primer objetivo se comprobó que la aclimatación a la intensidad lumínica induce cambios morfológicos y fisiológicos en A. chilensis. Se probó estadísticamente que el área foliar específica era distinta entre plantas de sol y sombra, y esto también se manifestaba en el tamaño de sus hojas. Esta adaptación permitió utilizar el tamaño de las hojas como un estimador de la intensidad lumínica. Además los plantines aclimatados al sol presentaron una tasa de fotosíntesis neta máxima mayor que los de sombra y una menor eficiencia fotosintética. Se observó también en los primeros una mayor densidad del follaje, un mayor crecimiento en biomasa total y en la asignación de esta a las raíces. Las plantas de sombra mostraron una alta proporción de superficie transpirante en relación al tejido conductivo y masa de raíces, que las haría más propensas a condiciones hídricas desfavorables. En cuanto al signo e intensidad de la interacción se estableció que las condiciones climáticas durante el corriente año de crecimiento influyeron tanto en la magnitud como en el momento de culminación del incremento en diámetro. De acuerdo a los datos meteorológicos obtenidos y a su comparación con series históricas las condiciones climáticas fueron definidas como secas, húmedas y muy húmedas. En las plantas testigos la fecha de culminación de crecimiento en diámetro se anticipó y el incremento anual del volumen del tallo disminuyó a medida que las condiciones de crecimiento en eran más xéricas. La remoción de los arbustos también influyó sobre el crecimiento variando la respuesta de las plantas en función de las condiciones climáticas. Cuando estas fueron húmedas a muy húmedas el desarbustado prolongó el período de crecimiento alcanzándose mayores crecimientos del tallo en comparación con los testigos. Por otra parte cuando el manejo de la vegetación se realizó en el año seco la culminación del crecimiento se adelantó. El desarbustado también provocó la mortalidad de plantas, principalmente de las más pequeñas. La integración de la información de crecimiento y mortalidad a través de un índice relativo de facilitación permitió evaluar la respuesta de las plantas en función de su tamaño y de las condiciones climáticas. Estos resultados concuerdan con la teoría acerca de la interacción entre plantas, donde el efecto de facilitación de las plantas nodrizas se pone de relieve en condiciones xéricas, mientras que por el contrario es de competencia en condiciones mésicas de crecimiento. Por otra parte independientemente de las condiciones climáticas pareciera ser que los arbustos siempren ejercen un efecto facilitativo sobre las plantas más pequeñas. Esto podría deberse a la influencia que tienen los cambios morfológicos y fisiológicos, inducidos por la aclimatación a la sombra, sobre la suceptibilidad de las plantas al estrés hídrico. Mediante el modelo de simulación se pudo cuantificar de forma preliminar el efecto competitivo que tienen los arbustos, debido a que reducen la intensidad lumínica, afectando esto distintos componentes que intervienen en la dinámica foliar de los renovales de A. chilensis. La aplicación del modelo permitió evaluar y comparar el efecto que tendría el manejo de la masa de arbustos respecto de no aplicar manejo alguno, concluyendo que es posible aumentar el crecimiento de los renovales por efecto del incremento de la intensidad lumínica lograda por la remoción parcial de la vegetación.

Las melaninas son pigmentos oscuros sintetizados por un amplio espectro de organismos. Estos polímeros, químicamente complejos, cumplen roles de protección ante situaciones de estrés y tienen propiedades de interés debido a que pueden ser de importancia médica, industrial y/o agronómica. Pseudocercospora griseola es el agente causal de la mancha angular, una enfermedad que causa severas pérdidas de rendimiento en los cultivos de poroto (Phaseolus vulgaris L.) en el noroeste de la Argentina. Este hongo se caracteriza por desarrollar micelio y esporas pigmentados. De la misma manera que otros patógenos evolucionó en paralelo con su hospedante, diversificándose en dos grupos génicos: "Andino" (P. griseola f. griseola) y "Mesoamericano" (P. griseola f. mesoamericana). En estudios previos se determinó que el tipo de melanina que sintetiza este hongo es 1,8-dihidroxinaftaleno (DHN). El objetivo general de esta tesis fue analizar la capacidad de los aislamientos de Pseudocercospora griseola correspondientes a los grupos génicos Andinos y Mesoamericanos para sintetizar melanina, las características de los pigmentos y el rol biológico que cumplen. Para ello se estudiaron en primer lugar las diferencias en crecimiento y pigmentación de 10 representantes de los dos grupos génicos. A partir de dicho estudio se seleccionaron dos aislamientos, P. griseola f. griseola (S3b) y P. griseola f. mesoamericana (T4), que difieren en crecimiento y pigmentación. Con estos aislamientos se llevaron a cabo experimentos para caracterizar la localización y propiedades de sus melaninas así como la evaluación de dos actividades enzimáticas relacionadas con su síntesis, una involucrada en la reacción inicial y otra vinculada con la polimerización. También se analizó el cultivo de S3b y T4 bajo diferentes condiciones de cultivo, incluyendo la aplicación de tratamientos químicos con fungicidas con diferentes modos de acción y agentes que alteran el estado redox. La melanina de estos hongos se localizaron en la capa externa electrondensa de la pared celular, la que varía en espesor en los dos grupos génicos. Se confirmó que la melanina de P. griseola es del tipo DHN, la que está caracterizada por diferentes grupos químicos, incluyendo grupos fenólicos y por revelar propiedades antioxidantes y quelantes de Fe+2. En P. griseola este pigmento reveló diferencias según el aislamiento analizado. P. griseola sintetiza tanto enzimas PKSs como unas con actividad oxidativa extracelular de tipo lacasa. Los aislamientos S3b y T4, correspondientes a los grupos Andino y Mesoamericano respectivamente, se comportan diferencialmente frente a distintas condiciones ambientales, lo que sugiere la existencia de mecanismos diferentes para enfrentar situaciones ambientales según el grupo génico de procedencia, incluso bajo condiciones de estrés. Estos resultados pueden tener relevancia en el desarrollo de estrategias de control de este hongo patógeno de poroto vinculados con la síntesis de pigmentos oscuros.

El cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de muerte por cáncer en la Argentina. Las mucinas y sus antígenos carbohidratos asociados han sido relacionados con la proliferación, invasión, metástasis y mal pronóstico. Objetivo: Estudiar la utilidad de MUC1, MUC2, MUC5AC y los antígenos carbohidratos asociados como marcadores tumorales pronósticos y predictivos de respuesta al tratamiento en pacientes con CCR. Materiales: Se incluyeron 248 muestras histológicas: 90 CCR, 64 ganglios linfáticos, 68 muestras de mucosa colorrectal normal, 26 adenomas y 120 muestras sanguíneas. Métodos: Se empleó la técnica de inmunohistoquímica en los tejidos tumorales y radioinmunoanálisis en las sanguíneas. Se utilizó un índice de expresión antigénica (intensidad por el porcentaje de la reacción). Los pacientes fueron estadificados según el TNM (AJCC, edición 2002). Resultados: Independientemente del estadío y del tratamiento instaurado, los pacientes tuvieron una menor sobrevida global (SG) y tiempo libre de progresión (TLP) cuando sus tumores primarios (TP) o ganglios linfáticos metastáticos (GLM) expresaron MUC1, Tn, Lewis x/y, sialil Lewis x y cuando en el núcleo de las células tumorales se halló presente β-catenina. Los pT avanzados se asociaron con mayor expresión de MUC1 y MUC5AC. Estos tumores presentaron mayor expresión de sialil Lewis a/x y Lewis y en sus GLM. El estadío pN2 se asoció con mayor expresión de sialil Lewis a/x. Se observó una mayor expresión de MUC1 y sialil Lewis a/x en los TP de los pacientes con M1. Los TP indiferenciados presentaron una elevada expresión de MUC1 y MUC5AC y una disminución de MUC2, los antígenos del grupo Lewis sialil y CEA. Los TP grado nuclear 3 tuvieron mayor expresión de MUC5AC, Tn, Lewis x y CEA. Un elevado índice mitótico en los TP se correlacionó con una alta expresión de MUC1 y CEA y una baja expresión de MUC2 y MUC5AC. Los GLM con alto índice mitótico expresaron en su mayoría Lewis x/y y sialil Lewis x. MUC1 se halló asociada a la invasión linfática y perineural tumoral. En esta última también se encontró elevada MUC5AC, sialil Lewis a y CEA. Los tumores mayores de 5 cm presentaron una elevada expresión de sialil Lewis x y CEA. El aumento de la expresión de MUC1 se relacionó con cáncer familiar, diabetes mellitus, hábito alcohólico y tabáquico, hipertensión arterial, colecistectomía previa y una pérdida de peso mayor a 10 kg en los dos meses previos al diagnóstico. Se demostró una variación en la expresión de las mucinas y antígenos carbohidratos estudiados siguiendo la secuencia: mucosa normal, mucosa normal adyacente al TP y TP, pudiendo comprobarse que la mucosa normal adyacente al tumor es una zona de transición entre mucosa normal y TP. Conclusión: Las mucinas y los antígenos carbohidratos asociados constituyen parte de los cambios ocurridos tanto durante la carcinogénesis como en los procesos de invasión del CCR. Asimismo, constituirían un elemento a considerar para comprender las recaídas locales.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019.

Noguera, M. E. (2012). Estudio de las propiedades estructurales y mecanismo de plegado de la superfamilia de módulos SEA (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Gomphrena perennis var. perennis L. (G. perennis) "flor de papel" o "siempre viva del campo" (Amaranthaceae) es una especie perenne distribuida en Sudamérica, principalmente Paraguay, Brasil, Argentina y Uruguay, usada en medicinal tradicional con purificadora estomacal, emoliente, diurética y tranquilizante para el tratamiento de afecciones del corazón. Su presencia se vio incrementada en la última década debido a que se comporta como una maleza tolerante al herbicida Glifosato (Round-Up®), de amplia utilización en el sistema productivo de siembra directa. Fitoquímicamente se ha reportado la presencia de 20-hidroxiecdisona, protoalcaloides betaína y colina. Farmacológicamente se ha estudiado sus propiedades anticancerígenas, actividad citotóxica y antimicrobiana, así como un efecto inhibitorio moderado del extracto metanólico y su fracción butánolica sobre la actividad de la 5-lipoxigenasa. El objetivo del presente trabajo de tesis intenta validar los efectos etnofarmacológicos de la tintura de G. perennis (GphT) y estudiar sus posibles propiedades farmacológicas, así como, contribuir al conocimiento fitoquímico de la especie. Para ello se realizó la extracción de la parte aérea de G. perennis con etanol 70º por maceración en frío, con solventes de polaridad creciente y por decocción al 10%. En el estudio fitoquímico detectamos la presencia de flavonoles y saponinas no citados en bibliografía para esta especie y se confirmó la presencia de alcaloides y núcleo esteroide. Por otra parte, no se detectaron taninos, cumarinas ni aceites esenciales. El estudio farmacológico demostró que los extractos ensayados presentaron actividad antioxidante y antiespasmódica, en este último caso solo en la GphT. La administración oral de GphT protegió al corazón frente a la injuria por isquemia-reperfusión (I/R) evitando el efecto deletéreo de la perfusión directa de la misma en un modelo de I/R por atontamiento sin infarto. Además, GphT mostró actividad hipotensora dependiente de la producción de óxido nítrico y un leve efecto ansiogénico pero no mostró actividad diurética, mientras que para la decocción no mostró efectos en la conducta de los ratones tratados.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020