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El virus de la diarrea viral bovina (BVDV)es el agente etiológico de una importante enfermedad que afecta al ganado ocasionando grandes pérdidas económicas a nivel mundial. La infección por BVDV es a menudo subclínica o causa sintomatología clínica leve y poco específica, sin embargo, la infección transplacentaria puede ocasionar desórdenes reproductivos, malformaciones congénitas y nacimiento de animales persistentemente infectados (PI). La vacuna empleada actualmente en Argentina se formula con virus inactivado químicamente. Sin embargo, los datos existentes sobre su efectividad para inducir anticuerpos neutralizantes son contradictorios y la protección frente a la infección no resulta plenamente satisfactoria. En nuestro país, la prevalencia de anticuerpos anti BVDV en el ganado bovino es de 40-90%, según los reportes; aproximadamente el 2% de la población total de animales se encuentra persistentemente infectado. En esta compleja situación epidemiológica, la técnica de referencia utilizada para la detección de anticuerpos anti BVDV es la seroneutralización en cultivo celular. Si bien esta técnica resulta muy especifica y sensible, requiere de un laboratorio de diagnóstico de mediana-alta complejidad y resulta económicamente desventajosa para analizar un número alto de muestras. En el presente trabajo se abordaron ambas problemáticas centrales para el control de la enfermedad. Por un lado, se desarrollaron y evaluaron ensayos de ELISA para detectar anticuerpos anti BVDV en el suero de los bovinos. Los ensayos se diseñaron utilizando cada una de las tres proteínas más inmunogénicas del virus, E0, E2 y NS3, expresadas en el sistema baculovirus / células de insecto. Los ensayos de ELISA demostraron ser altamente sensibles y específicos en la detección de anticuerpos anti BVDV, de manera similar a la neutralización. Más aún, la inclusión de la proteína no estructural NS3 permitió detectar anticuerpos anti BVDV en animales tipificados como negativos en ensayos de seroneutralización. Por otro lado, se ensayó una vacuna experimental basada en la glicoproteína E2. Para ello se llevó a cabo una prueba de vacunación y desafío en la que se evaluó la respuesta inmune humoral y la protección conferida por la vacuna experimental frente a una de las vacunas comerciales usada actualmente. El nivel de anticuerpos neutralizantes presentes en el suero de los animales vacunados con la vacuna recombinante E2 fue significativamente mayor que el inducido por la vacuna inactivada convencional. Al momento del desafío, los animales vacunados con E2 presentaron altos niveles de anticuerpos neutralizantes, mientras que en los animales de los grupos vacunados con vacuna inactivada o con placebo, éstos fueron indectables. Coincidentemente, la sintomatología clínica desarrollada por los bovinos vacunados con la vacuna E2 recombinantes después del desafío viral fue más leve. Los resultados obtenidos demuestran que es posible mejorar las actuales vacunas contra BVDV, así como diseñar nuevos ensayos diagnósticos sencillos, sensibles, específicos y económicos basados en la utilizaciónde las proteínas recombinantes E2 y E2/E0/NS3, respectivamente. Este trabajo puede considerarse como un primer paso hacia la resolución de ambos problemas.

El núcleo celular es una organela con una organización espacial muy compleja. Los componentes responsables de las distintas funciones nucleares, como la replicación y la reparación del ADN, la transcripción y el procesamiento del ARN, no se encuentran distribuidos homogéneamente en el espacio nuclear sino compartimentalizados en diferentes dominios subnucleares, definidos por ácidos nucleicos y/o proteínas.En este trabajo de Tesis, se propuso estudiar la organización dinámica de un factor de transcripción en el núcleo, utilizando como modelo el receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción activado por ligando. El uso clínico de glucocorticoides otorga una especial relevancia al estudio del mecanismo de acción del receptor, en el marco de la búsqueda de ligandos que conserven los efectos deseados de los glucocorticoides (anti-inflamatorios e inmunosupresores) pero minimicen sus efectos adversos (metabólicos).Mediante el uso de microscopía confocal y de técnicas basadas en espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) se exploró la distribución espacial subnuclear del GR y su dinámica intranuclear en células vivas en cultivo, con el fin de establecer ciertas correlaciones entre estos aspectos y la actividad transcripcional del GR.Los resultados muestran que, en células no estimuladas, el GR inactivo se encuentra principalmente en el citoplasma, mientras que NCoA-2 ?un importante coactivador de receptores nucleares? se acumula en dominios focales nucleares identificados como cuerpos de leucemia promielocítica (PML). La unión al GR de un agonista como dexametasona (Dex) promueve una redistribución espacial de ambas proteínas, que pasan a colocalizar e interactuar en múltiples foci subnucleares. Se demostró además que estos foci son estructuras dinámicas dependientes de la integridad del ADN y presentan un recambio rápido (~1 s) de sus componentes con el nucleoplasma.Por otra parte, se demostró que el receptor y el coactivador difunden dentro del núcleo y pueden interactuar con sitios de distinta especificidad en la cromatina, caracterizados por tiempos de interacción de ~500 y ~50 ms (denominados sitios lentos y rápidos, respectivamente). Una dinámica similar se detectó al estudiar la interacción del GR con un arreglo de múltiples copias de un promotor conteniendo secuencias blanco del GR, introducido en el genoma de una línea celular. La activación con Dex produce un aumento tanto del tiempo de residencia como de la unión de GR a los sitios lentos en el ADN. Esta unión puede ser favorecida además por la sobreexpresión de NCoA-2. De manera simétrica, la activación del GR promueve la unión al coactivador y el reclutamiento de éste a los sitios lentos.Con el objetivo de correlacionar la funcionalidad del receptor con la distribución espacial y la dinámica que presenta en el núcleo, se utilizaron mutantes del GR y ligandos que al unirse al receptor producen variantes conformacionales con actividad transcripcional deficiente. En algunos casos, se observó que la incapacidad transcripcional se ve acompañada por una dinámica y una distribución intranucleares diferentes y, especialmente, una deficiencia en la capacidad de interactuar con NCoA-2.En conclusión, la partición dinámica de un factor de transcripción en diferentes reservorios nucleares constituye un mecanismo regulatorio que impactaría en su función biológica. El enfoque clásico del factor de transcripción interactuando in vitro con su secuencia blanco implica no tener en cuenta todas las interacciones que ocurren en el núcleo de células vivas. El conjunto de estas interacciones define la disponibilidad local del factor de transcripción y, en última instancia, las posibilidades de interactuar con secuencias blanco y regular la expresión génica

Los parásitos nematodos producen diversas proteínas solubles que unen lípidos (LBPs) estructuralmente distintas a las del huésped. Las funciones que cumplen se desconocen pero se hipotetiza que estarían involucradas en las funciones típicas internas de organismos multicelulares, como la utilización y transporte de compuestos no solubles, y en externas especializadas. Algunas de estas proteínas participarían en la modificación del entorno local en el tejido del huésped, posibilitando la modulación y la evasión de la respuesta inmune. Entre las LBPs producidas por nematodos se encuentran las FAR (Fatty Acid and Retinol binding proteins), una clase novedosa de proteínas que unen ácidos grasos y retinol. Tienen un tamaño aproximado de 19 kDa y sus estructuras que parecen ser ricas en alfa-hélices aún no han sido completamente dilucidadas. La comprensión del rol que cumple esta familia de proteínas tiene gran interés fisiopatológico ya que podrían desempeñar funciones relevantes en la biología de los parásitos que las producen y dadas las diferencias estructurales que presentarían con respecto a las LBPs de sus huéspedes, servirían como potenciales blancos para el diseño de nuevas terapias antiparasitarias. Con la finalidad de contribuir a la caracterización de las proteínas FAR y avanzar de este modo en la determinación de su función biológica, se llevaron a cabo estudios biofísicos y estructurales que permitieron resolver la estructura de Na-FAR-1 en solución por espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Determinándose que consta de once hélices que conforman una cavidad interna de gran tamaño, donde podrían ubicarse ligandos hidrofóbicos. La estequiometría de unión de los complejos formados por Na-FAR-1 estaría dada por cuatro moléculas de ácido oleico por molécula de proteína, pero se limitaría a una única molécula de ligando en el caso del retinol y de los análogos fluorescentes de ácidos grasos empleados para su estudio. A su vez se evidenció que además de los ligandos esperados como ácidos grasos y retinol, esta proteína es capaz de unir fosfolípidos y diacilglicéridos. La amplia diversidad de unión a ligandos, sumada a su localización en el intestino del nematodo, indicarían que podría participar en el direccionamiento hacia los distintos tejidos de los lípidos ingeridos.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Cátedra de Química Biológica. Ciencias Biológicas.Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Universidad Nacional de Córdoba. CONICET, SECyT (UNC), y FONCyT- 2013 - 114 h. con Apéndices + CD ; ils. col.; grafs.; tabls. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

Tal como ocurre con otras especies de la familia SPARIDAE, la denominación científica ha sido objeto de numerosos cambios, sin que se haya llegado aún, aparentemente, a un consenso entre los diversos autores. En el presente trabajo se denomina al besugo como Pagrus pagrus, siguiendo el criterio de Bianchi (1984) y la nomenclatura CLOFNAM(1986). El objetivo de esta investigación es ampliar el conocimiento de aspectos básicos de la biología de la especie con el fin de inter- pretar los efectos de la pesca sobre el potencial del recurso. En aguas argentinas habita la región costera del sector bonaerense no sobrepasando en su distribución los 41°S, en profundidades de 10 a 50 m. Se reconocen dos áreas de distribución, una entre 35° y 38°S y otra entre 39°y 41°s, y la existencia de dos áreas de crianza sobre la isobata de los 20 m, una en latitud 36°S y otra frente a Bahía Blanca. Dentro del dominio bentónico-demersal está asociado con fondos rocosos. La mayor afinidad en las capturas, se observa con elasmobranquios bentónicos, lenguados y especies tales como Percophis brasiliensis, Acanthistius brasilianus, Prionotus nudigula, tanto en la región norte como en el sur, y en otoño como en primavera. Se trata de una especie marina, euritérmica y eurihalina de alta salinidad, cuya distribución está determinada máspor las relaciones tróficas y disponibilidad de alimento que por las características físicas del ambiente o por la topografía del fondo. Por lo tanto se puede inferir que basa las estrategias de vida optimizando el gasto de energía en función de asegurar buena sobrevivencia individual en todas las etapas del ciclo vital. Cuenta para ello con fuertes dientes molariformes que le permiten triturar formas menos móviles pero muy armadas. Tanto el comportamiento alimentario como las peculiares características reproductivas, que se manifiestan también en otras especies de la familia, permiten caracterizar al besugo comoun pez relativamente especializado, adaptado a un ámbito costero con gran variación en sus condiciones físicas y ecológicamente estable, en el cual carece de enemigos o competidores naturales de importancia. Tiene la particularidad de presentar hermafroditismo en las primeras etapas de su vida. Los mecanismos de diferenciación sexual se deducen de las determinaciones macroscópicas de los distintos tipos sexuales y el análisis de variaciones porcentuales de ellos, observables en las cinco primeras edades. Si bien algunos ejemplares pueden reconocerse muy tempranamente como machos o hembras, gran parte de la población juvenil presenta hermafroditismo proterogino. El mayor porcentaje de ejemplares con gonada bisexuada se observa en el tercer año de vida y se manifiesta macroscópicamente con ambas regiones gonadales igualmente desarrolladas o con predominancia de la cresta masculina. Microscópicamente, muestran estados funcionales y sincrónicos para los dos sexos. La porción masculina evidencia una expulsión normal de sus gametas y en la parte ovárica se observan folículos post-ovulatorios y estados atrósicos con las características propias para la especie. Por el tipo de diferenciación sexual reconocido en el besugo, las hembras se definirían más tempranamente a partir de la gonada indiferenciada inicial y en los casos más tardíos lo harían de gonadas bisexuadas por pérdida de la cresta masculina. Encambio parecería que los machos en su mayor proporción pasan por estadios hermafroditas y se definen de una gonada bisexuada con predominancia de la parte masculina, por pérdida de la cresta ovárica. Esto ocurre generalmente al finalizar el ciclo del cuarto año de vida y enalgunos casos más tardíamente. Como resultado de los cambios de las gonadas bisexuadas, al fin del quinto año, se alcanza una proporción balanceada de los dos sexos. Se ha podido determinar macroscópicamente las distintas etapas del ciclo reproductivo mediante el seguimiento de los estadios de madurez gonadal y el análisis de las variaciones del índice gonadal a lo largo del año. Además se caracterizaron microscópicamente las principales fases del ciclo. Para ello se describen los cambios que ocurren en el transcurso del proceso de maduración del ovario, tanto aquellos que acontecen en los ovocitos, como en las estructuras que forman su envoltura, constituyendo el folículo. Estos estudios en conjunto permiten señalar que el besugo tiene una sola puesta anual, que tiene lugar entre noviembre y enero. El período de reposo gonadal (VII) abarca gran parte del año (febre- ro a junio). El comienzo de la maduración ovocitaria (III) tiene lugar en el mes de junio. En el mes de septiembre este proceso se incrementa, llegando a hacerse presente el estadío demaduración avanzada (VI), el cual culmina en diciembre. El período de puesta (V) parecería ser muybreve ya que en enero los índices gonadales caen bruscamente. El seguimiento de los folículos post-ovulatorios vacíos en la etapa correspondiente al desove, brindan el testimonio de que se trata de una especie de desove múltiple y permite suponer quelas transiciones de estas formaciones residuales ocurren en un lapso relativamente breve. Esquemáticamente, el ciclo gonadal se puede expresar como sigue en el esquema (ver esquema)) Los altibajos que se observan en el índice gonadal en el mes de diciembre pueden interpretarse como la consecuencia de puestas parciales o de una diferencia] actividad reproductiva de acuerdo a la talla. Cuando se analizan los pesos gonadales por talla, en función del tiempo se observa un desfasaje en el momento de la puesta que demuestra que los ejemplares de mayor tamaño completan su ciclo reproductivo antes que los más pequeños. La talla media de la primera madurez es de 23,l cm en machos y 23,6 cm en hembras, cuando cumplen los tres años de vida. Estos valores se obtivieron para la temporada 1981/1982, y en el caso de las hembras no muestran duerencias significativas respecto a los valores de las temporadas 1975/1976 y 1976/1977. Las observaciones para la región sur en el mes de octubre de 1981, muestran tallas mayores pero la edad involucrada es la 2, como en el caso del efectivo norteño. Las determinaciones de edad, basadas en el conteo de anillos en escamas, han sido utilizadas para el estudio del crecimiento en largo del besugo. Fueron obtenidos los parámetros de la ecuación de crecimiento de von Bertalanffy para las dos áreas de distribución de la especie. Ellos son: (ver esquema) Los resultados muestran que los largos promedio a cada edad así como el largo infinito son mayores para el efectivo del sur. Sin embargo tanto la constante k como el to presentan valores similares en ambas regiones. El crecimiento en largo presenta características similares en ambos sexos. En el área norte los valores de talla por edad en los machos, en edades l a 4, son ligeramente mayores que los de las hem_ bras y lo contrario se observa a partir de la edad 8. En el sur las diferencias entre sexos son afin menos notorias, las tallas promedio por edad de las hembras son ligeramente mayores que las de los machos a partir de los cinco años. Comparando el coeficiente k con el de otras especies de la familia, se encuentra que los valores son similares al de Pachymetopon blochii, e inferiores al de Pagrus major. Los estudios comparativos de las regresiones largo/peso permiten señalar los siguientes hechos. Existen diferencias significativas en las regresiones entre sexos a favor de los machos, para gran parte del año, lo que indica que éstos son más robustos. De las comparaciones entre meses sucesivos se demuestra una gran variabilidad de esta relación, tanto dentro del ciclo anual como entre años. No obstante, puede decirse que se observa una disminución paulatina del crecimiento en peso, desde septiembre a enero, fenómeno que se supone vinculado al proceso reproductivo. Desde ene- ro a abril el exponente aumenta, presentando en este último mes el máximo valor. Este hecho está relacionado con una mejor alimentación en el verano tardío, después de la puesta. De las comparaciones entre las dos regiones surgelo siguente: los meses de abril y septiembre no muestran diferencias estadísticamente significativas ni para hembras ni para machos; en el mes de octubre se observan diferencias entre las regresiones para hembras de las dos regiones, no así para machos. Las diferencias en el crecimiento del besugo tanto en largo como en peso, en las dos regiones comparadas, puede deberse a mejores condiciones en el área sur, tanto de índole ecológica (ambientales y de alimentación) como a una menor presión del esfuerzo pesquero. El análisis de la composición de tallas y edades en el desem- barque entre los años 1973 y 1981 y las campañas de este último año, muestran que: - La talla promedio anual en los desembarques provenientes del sector norte, oscila entre valores de 27,3 cm y 31,8 cm y la distribución de porcentajes de talla tiende en general a la unimodalidad, con un modo cercano a los 30 cm. En primavera tardía y veranopresenta otro modo no tan conspicuo en tallas pequeñas (21 6 24 cm Lt), que representa el reclutamiento al arte. por esa razón en invierno los promedios de largo total son ligeramente superiores y presentan menor desviación estandar que en el verano. - Al comparar regionalmente las distribuciones de talla en los meses de abril y octubre, se observa que hay diferencias en los valores promedio, con predominancia de ejemplares más grandes en la región sur. - En el efectivo del norte las edades predominantes en el desembarque variaron a lo largo del período; la tendencia general entre 1974 y 1976 muestra que las edades 3 y 4 predominan y representan más del 50% de los ejemplares en las capturas. A partir de 1977 se destacan dos hechos que modifican la composición de edades. Uno es que la clase 1975 predomina en el período 1978-1980 como edades 3 a 5. El otro es que la cohorte nacida en 1977 se muestra poco numerosa. Apartir de los datos sobre la estructura poblacional se llegó a los siguientes resultados: - Las estimaciones de la sobrevivencia, S entre años sucesivos mostraron valores aceptables variando entre 0,683 y 0,474 en los años analizados. Se observa una tendencia a la disminución delvalor S en el período, coherente con el aumento de la intensidad pesquera. - Las tasas instantáneas de mortalidad total, Z, entre pares de edades y años sucesivos, se incrementa con la edad, y con el aumento de la presión pesquera en función de los años calendario. - Los cálculos de Z para las cohortes 1969 a 1973, para pares de eda- des entre 4 y 8 años dan un valor medio de 0,52. - La tasa instantánea de mortalidad natural fue estimada en 0,182. Del conjunto de conclusiones enunciadas surgen algunas recomen- daciones, que pueden resumirse como sigue: l. Protección del efectivo de tallas menores al tamaño de primera madurez. Ya que las zonas de pesca son comunes en determinados momentos a las tallas de ejemplares adultos y de juveniles, se debe implementar el control del uso de redes de malla mayor. Secundariamente, además se debe regular el tamaño mínimo de comercialización. Esta medida, por sí sola no será eficaz sin la efectivización de la referente al tamaño de malla, ya que solamente produciría un descarte de juveniles antes del desembarque. 2. Consolidar la obtención de estadísticas de pesca comercial. Esto implica la efectivización del parte de pesca costero que recientemente se ha implementado, que permitirá analizar el esfuerzo pesquero actuante sobre las distintas especies que integran el sistema de la pesquería multiespecífica de la región. El parte, en forma simple, debe contestar a las preguntas: "Cuánto, dónde, cómo y qué". Los valores nominales de las capturas desembarcadas son los únicos datos con que se ha podido contar hasta el presente, pero en el caso de especies cuya captura se selecciona a bordo, la información debe complementarse con estudios del descarte y selectividad de las artes. La información del área de pesca debe ser lo más precisa posible, y aquella concerniente al tipo de arte, n° de arrastres, horas, lo más completa. Para ello se deberá concientizar a los pescadores para que el parte contenga información veraz, ya que ellos serán los beneficiarios de los resultados que se obtengan con él. 3. Monitoreo de los desembarques. Mantener la continuidad del muestreo de desembarque, implemen- tándolo en los niveles primarios tales como el Mercado Nacional de Concentración Pesquera. Como rutina deberá conocerse la Composición de tallas presentes en cada categoría de tamaños: chico, mediano y grande. Paralelamente al muestreo de tallas, que no perjudica la comercialización del producto, deberá mantenerse el muestreo biológico para obtener la composición por edades y la relación largo/peso. Ambaspodrán referirse a la distribución total de tallas general. En el período septiembre a diciembre debe intensificarse el monitoreo con muestras destinadas al estudio reproductivo, en particular la fecundidad. El conjunto de los puntos enunciados contempla los aspectos básicos para evitar la pesca excesiva que afecte tanto a los efectivos adultos como a los futuros reproductores. Si bien debido a la falta de datos de esfuerzo pesquero cuanti- ficables en este momento, no se ha podido aplicar modelos de dinámica poblacional, la situación del recurso queda planteada como riesgosa, si se intensifica la pesca, sin implementar medidas protec- toras. Por lo tanto es de fundamental interés complementar la informa- ción que se obtiene del desembarque comercial con campañas de investigación que permitan, por un lado, conocer la estructura natural de la población en los principales fondos de pesca, y por otro, cono- cer el nivel de descarte efectuado por el pescador. Ias campañas estarán destinadas a esclarecer problemas concre- tos tales como: - Evaluación —Definir áreas de mayor concentración de adultos - Ensayos de selectividad con distintas artes de captura, las tradicionales de arrastre y otras que permitan acceder a los fondos riesgosos. Se recomienda la ejecución de campañas de prospección pesquera específicas para el besugo, tanto por las artes a emplear como por los fondos a explorar.

El “barrenador de los brotes", Epinotia aporema, es una de las principales plagas de leguminosas en América del Sur. Las larvas de esta plaga, son infectadas por un granulovirus (EpapGV) el cual representa una de las principales causas de epizootias esporádicas en poblaciones de E. aporema. En el trabajo de tesis, se realizaron estudios biológicos y patológicos sobre EpapGV en larvas del insecto huésped, los cuales establecieron una base de conocimientos importante para determinar distintos aspectos de la interacción virus-huésped. Ensayos en laboratorio demostraron que el virus es altamente virulento y especie específico, lo que indica que es un buen candidato para ser utilizado en el control biológico de la plaga. Larvas infectadas con EpapGV sufrieron un retraso en el desarrollo, siendo inhibido el proceso de muda. Además, exhibieron un incremento en el peso mayor al observado en larvas sin infectar. Esto pudo deberse a la expresión del gen viral egt cuyo producto altera la fisiología de los insectos. Mediante exámenes de tejidos al microscopio óptico y electrónico, por medio de las técnicas de inmunohistoquimica e hibridación in situ (ARN-ARN), se observó que EpapGV causa infecciones de tipo poliorganotrópicas. Los principales tejidos afectados fueron el adiposo, la epidermis y la matriz traqueal. Luego de infectar el intestino medio, la diseminación del virus hacia otros tejidos se produce aparentemente vía hemolinfa. Los viriones producidos en células infectadas se acumulan entre la membrana plasmática y la lámina basal, lo que indica que dicha lámina constituye una barrera efectiva para diseminación de la infección. Mediante la técnica de inmuno-oro se detectó expresión de granulina dentro del núcleo, lo cual indica que la expresión de genes tardíos ocurre luego de la ruptura de la membrana nuclear. Análisis computacional de las secuencias de los extremos de clones de la biblioteca genómica de EpapGV generada en el laboratorio, permitieron identificar una posible proteína de fusión (Epap-F). El gen completo fue subclonado, secuenciado y analizado mostrando motivos característicos de las proteinas F de Nucleopolyhedrovirus (involucradas en la entrada del virus a una nueva célula). Sin embargo, no se había demostrado la funcionalidad de proteínas F de Granulovirus. Mediante la técnica de Northern blot se confirmó la expresión de dicho gen y se estudió su expresión temporal. Posteriormente, a través de la técnica de RACE, se mapeó el extremo 5' no codificante demostrándose que la transcripción del gen se realiza a partir de un motivo típico de transcripción tardío (CAGT) y también a partir de un motivo no convencional ATGC. Para demostrar la actividad fusogénica de dicha proteína se realizó un ensayo de actividad transiente in vitro. Para ello, se transfectó un cultivo de células (Spodoptera frugiperda. Sf21) con un plásmido conteniendo el ORF completo de Epap-F bajo el promotor ie-1 de Anticarsia gemmatalis MNPV, se modificó el pH del medio a 5 y se registró formación de sincicios. Con el fin de producir anticuerpos que reconozcan a Epap-F, se expresó dicha proteína utilizando un sistema de expresión de baculovirus. Los anticuerpos serán utilizados para la determinación de la ubicación subcelular de dicha proteína.

La vía de señalización por cAMP-proteína quinasa A (PKA) juega un rol importante en la regulación del desarrollo, crecimiento y virulencia en un variado número de hongos. La PKA está compuesta por un dímero de subunidades regulatorias (R) y dos subunidades catalíticas (C). La subunidad R posee una estructura modular con un dominio de dimerización y anclaje (D/D) en el extremo Nterminal y dos dominios de unión de cAMP en el extremo C-terminal, entre ambos se encuentra una zona bisagra que incluye el sitio inhibitorio (IS). A ambos lados del IS se definen el linker I y linker II. Nuestro modelo de estudio es el hongo Mucor circinelloides cuya holoenzima PKA se diferencia de las de otras especies por su mayor fuerza de interacción R-C. En esta tesis demostramos la participación del linker I en la interacción R-C y la importancia de su naturaleza química, dada por la presencia de un grupo residuos ácidos, para establecer la alta fuerza de interacción entre las subunidades. Definimos por primera vez en hongos la existencia de cuatro isoformas de subunidad R, PKAR1, PKAR2, PKAR3 Y PKAR4, las cuales se expresan en forma diferencial a lo largo del desarrollo de M. circinelloides. Mediante la construcción de dos cepas que poseen anulados los genes de pkaR1 y pkaR2 demostramos que cada una de las isoformas posee roles diferentes en la diferenciación y morfología del hongo. M. circinelloides también presenta múltiples isoformas de subunidad C, de las cuales hemos ahondado en el estudio de una en particular denominada PKAC. Caracterizamos la isoforma como una posible pseudoquinasa por las características de su secuencia aminoácidica y por la falta de actividad catalítica. Finalmente demostramos la existencia de variantes de R modificadas posttraduccionalmente por ubiquitinación, en particular se definieron isoformas multiubiquitinadas de alto PM y la monoubiquitinación de PKAR2.

Los eventos de hipoxia tienen consecuencias nocivas que se manifiestan de múltiples formas en el SNC durante el desarrollo. El presente estudio analiza los daños generados en el tectum óptico por una hipoxia aguda normobárica sobre embriones de aves. Encontramos que tanto la vulnerabilidad diferencial como el retraso temporal de la muerte celular son dos fenómenos producto del evento hipóxico. Dicho daño se caracteriza por ser independiente de aferencias de la retina y por presentar una muerte celular mediada por la vía apoptótica intrínseca. Esto fue determinado ultraestructuralmente y bioquimicamente mediante la inmunomarcación de proteínas involucradas en la cascada apoptótica. Por otro lado, se determinó que la muerte celular propia del desarrollo presenta un perfil morfológico y bioquímico apoptótico similar al observado en condiciones de hipoxia. Frente a la evidente semejanza entre estos dos procesos de muerte postulamos que la hipoxia en nuestro modelo genera un desequilibrio transitorio en la homeostasis del tectum óptico, incrementando la muerte celular propia del desarrollo. Además, observamos una disminución transitoria en la actividad de la vía de supervivencia PI3K/Akt durante el evento hipóxico. Los resultados preliminares derivados de la administración de drogas que logran estimular esta vía de supervivencia en cultivos de embriones ex ovo, sugieren un rol ejecutor de esta vía en la muerte hipóxica. Por último, hemos determinado que la administración de estradiol posterior al evento hipóxico presenta efectos neuroprotectores a través de la unión a receptores y posiblemente mediante acciones no genómicas a través de PI3K/Akt.

En las últimas décadas y con la finalidad de disminuir el problema de la contaminación acuática, sobre todo aquella causada por la presencia de metales pesados, se han buscado técnicas fisicoquímicas y biológicas más eficientes para la remoción de los contaminantes metálicos. Una técnica que llama la atención actualmente, es la utilización de macrófitas acuáticas tales como especies del género Salvinia, que se caracterizan por acumular elevadas concentraciones de Cr, un rápido crecimiento y bajo requerimiento de nutrientes. En los ambientes acuáticos, la toxicidad del Cr varía con la temperatura, el pH y la dureza del agua. Entre los más importantes se destaca el pH del medio ya que determina la especie química de Cr que predomina en un determinado ambiente. Así, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto del pH del medio sobre los parámetros bioquímicos y fisiológicos involucrados en la remoción de Cr(VI) y Cr(III) por especies del género Salvinia. Bajo las condiciones experimentales y en base de los resultados obtenidos se pudo demostrar que la acumulación de Cr (VI)/Cr(III) en las especies del género Salvinia, sigue una variación estacional (mayor en verano que en invierno) al igual que la actividad metabólica, sugiriendo así que una interacción entre ambos aspectos determina la cantidad de metal removido. Además, la gran variabilidad observada en los parámetros fisiológicos muestra que S. minima y S. rotundifolia son especies sumamente plásticas frente al estrés y aptas para procesos de fitorremediación. En este sentido, la acumulación del cromo ocurriría a través de la combinación de dos mecanismos coordinados: a) la unión (adsorción) del cromo en la superficie de frondes y lacinias y, b) la toma del cromo por las células. Una vez que el metal entra en la célula, se pondrían en marcha otros mecanismos órgano-específicos que les permitiría resistir a la presencia del cromo. En frondes y lacinias un mecanismo de respuesta antioxidante es la acumulación de compuestos fenólicos solubles insolubles que tienen función antioxidante y de moléculas quelantes. Toda esta respuesta se apoya en las alteraciones del metabolismo primario observadas a nivel de carbohidratos solubles principalmente y en los indicadores de daño por estrés oxidativo. Además, a nivel celular, se propone que Salvinia podría tener la capacidad de reducir el cromo, ya que se observó una reducción del Cr (VI) por parte de extractos de frondes y lacinias de S. minima y S. rotundifolia, sin la adición de agentes reductores exógenos. Estos resultados fueron confirmados por ensayos realizados mediante XANES demostrando que tanto S. minima como S. rotundifolia tienen capacidad de reducir el Cr (VI) a Cr(III). Asimismo, se observó que el porcentaje de reducción fue significativamente superior en los extractos de lacinias que en los de frondes, lo que podría representar un mecanismo de defensa adicional en este órgano. En cuanto a la influencia del pH sobre la capacidad remediadora de S. minima y S. rotundifolia, se pudo confirmar que S. minima parece ser una especie apta para remover Cr(VI)/(III) de soluciones acuosas ácidas, mientras que S. rotundifolia es más eficiente para remover Cr (VI) en soluciones alcalinas y Cr (III) en soluciones acuosas ácidas. Además, se ha comprobado que S. minima posee mecanismos para alterar el pH del medio regulando así el proceso de remoción de Cr(VI), mientras que S. rotundifolia no los presentó bajo las condiciones experimentales ensayadas. La información vertida en este trabajo representa un avance en la dilucidación y entendimiento de las interacciones metal/parámetros fisicoquímicos que ocurren durante la fitorremediación y que deben tenerse en cuenta para asegurar el éxito del proceso. Desde el punto de vista del saneamiento ambiental, la implementación de ambas especies de Salvinia supone una alternativa verde para la remediación "in situ" de Cr(VI) ya que son capaces de reducirlo a su forma menos tóxica Cr(III) con la consiguiente reducción del riesgo ambiental. En general se concluye que las especies de Salvinia analizadas en esta tesis son una alternativa interesante para el saneamiento de aguas contaminadas por metales pesados. Los datos aportados por este trabajo de tesis serán de gran utilidad en el diseño de plantas de fitorremediación que deban funcionar a lo largo de todo el año.

Las abejas constituyen un grupo de insectos ampliamente distribuidos que comprende aproximadamente 20000 especies descriptas alrededor del mundo. Son considerados los polinizadores más importantes de las Angioespermas y comprenden el grupo más diverso de los visitantes florales, de allí su importancia en los ecosistemas, tanto naturales como agrícolas. De las siete familias de abejas reconocidas en el mundo, sólo cinco se encuentran representadas en nuestro país. La familia Apidae es la más diversa e incluye tres subfamilias; particularmente la subfamilia Xylocopinae se encuentra dividida en cuatro tribus: Xylocopini, Ceratinini, Allodapini y Manuelini. La monotípica tribu Xylocopini, representada únicamente por las abejas solitarias del género Xylocopa Latreille, incluye aproximadamente 470 especies de distribución cosmopolita conocidas comúnmente como “abejas carpinteras” debido a su preferencia por la madera muerta como sustrato de nidificación. Las regiones tropicales y subtropicales presentan la mayor riqueza específica. Son a menudo confundidas con las especies sociales del género Bombus (Apidae: Bombini), ambas conocidas como “abejorros”, “mangangaes”, “mamangas” o “huanqueros”. La mayoría de las Xylocopa tienen hábitos solitarios, sin embargo existe una tendencia hacia el gregarismo y al comportamiento social facultativo. En general, las especies tropicales y sutropicales presentan bivoltismo, y sólo algunas multivoltismo, pudiendo tener cuatro o cinco generaciones por año. Las abejas carpinteras construyen dos tipos principales de nidos: no ramificados (lineal) y ramificados (> dos galerías), dependiendo del sustrato disponible; internamente los nidos constan de un sistema de galerías, conectadas con el exterior por medio de una entrada circular o elíptica. Dentro de las galerías construyen celdas de cría, cada una aprovisionada con una masa de polen sobre la cual la hembra deposita un único huevo. En general, las especies de este género no presentan especialización respecto del sustrato vegetal para la nidificación y pocas son las que emplean un sustrato específico. Gran parte de las Xylocopa son diurnas y visitan distintas flores a diferentes horas del día y presentan hábitos generalistas en relación a la fuente de néctar y polen. La base de la actual clasificación genérica y subgénerica de Xylocopini fue establecida por Hurd & Moure y posteriormente revisada por Minckley. Los estudios biosistemáticos sobre estas abejas en Argentina, son escasos y fragmentarios. Debido a los pocos aportes realizados hasta el presente y a su importancia agro-económica como polinizadores, se propuso como objetivo general de este trabajo el estudio sistemático y biológico de las especies de la tribu Xylocopini presentes en Argentina. Para lo cual se plantearon los siguientes objetivos particulares: identificar el material procedente de los viajes de campaña y aquel depositado en instituciones especializadas del país y del extranjero; redescribir los taxones conocidos empleando fuentes modernas de caracteres diagnósticos; describir aquellos que resulten nuevos para la ciencia; realizar todos los cambios nomenclaturales que sean necesarios; inventariar las especies y elaborar claves para facilitar su reconocimiento; actualizar, sobre la base del material disponible, sus áreas de distribución geográfica y ampliar los conocimientos biológicos, especialmente los referidos a la nidificación y a sus relaciones con las plantas. En este trabajo se realizó un importante avance en el conocimiento de la tribu Xylocopini de Argentina. Se estudiaron 3485 ejemplares procedentes de diversas localidades de nuestro país recolectados en los diferentes viajes de campaña realizados entre los años 2004 y 2010, aquellos depositados en 16 colecciones nacióna-les y del extranjero, y el material tipo de la mayoría de las especies. Para Argentina estaban citados 38 nombres, correspondientes a especies de este género, como resultado de este estudio el número se redujo a 18, asignados a cinco subgéneros, una de las especies estudiadas resultó nueva para la ciencia. Se estableció una nueva sinonimia (X. jujuyensis = X. nigrocincta), se designó un lectotipo (X. ciliata) y se asignaron y describieron por primera vez, los machos de X. nigrocincta, X. eximia y X. simillima. Debido a que la mayoría de las descripciones originales son muy antiguas y poco claras, se elaboraron redescripciones de ejemplares de ambos sexos para todas las especies, ampliando de esta manera el número de fuentes de caracteres utilizadas tradicionalmente, como así también medidas y proporciones; elaborando además, cuadros comparativos. Se perfeccionaron las técnicas fotográficas empleando nuevos métodos de exposición y luminosidad, aplicadas al estudio sistemático; de este modo fue posible completar cada una de las redescripciones con adecuadas fotografías mostrando los principales caracteres morfoló-gicos utilizados para la identificación. Para los machos se presentan, por primera vez, fotografías de las cápsulas genitales tomadas con microscopía electrónica. Se confeccionaron por primera vez para Argentina claves dicotómicas ilustradas para el reconocimiento de los distintos subgéneros y otras para las especies incluidas en ellos. Se actualizó la distribución geográfica de todas las especies presentes en nuestro país; en todos los casos, se registraron, en mapas individuales, la de cada una de las especies, mostrando la información del material estudiado y de aquél citado en la literatura. Cabe hacer notar que para la mayoría sólo se conocían localidades o provincias aisladas. De las observaciones biológicas se pudo concluir que la mayoría de las especies de Xylocopa poseen hábitos polilécticos evidenciado por forrajear en 55 familias de plantas, sólo seis especies mostraron recursos alimenticios más restringidos. Se registraron 224 asociaciones florales de las cuales 65 son nuevos registros, confirmando además 37 especies de plantas ya citadas para especies de este género en nuestro país. Se observó y fotografió por primera vez en Argentina el comportamiento de deshidratación de néctar en cuatro especies de Xylocopa. Se amplió el conocimiento sobre asociaciones de estas abejas con otros insectos: dípteros parasitoides de larvas y adultos; himenópteros hiperparasitoides y cleptoparásitos de adultos y estados inmaduros, y coleópteros cleptoparásitos en nidos. Muchos de los registros de fauna asociada son citados por primera vez para estas abejas. Se estudió un total de 72 nidos recogidos en 19 localidades de diferentes provincias de Argentina que corresponden a 10 especies de Xylocopa. Para cada uno de ellos, se brinda nueva información de la estructura interna y para cuatro especies, se describen por primera vez. Respecto de la utilización y preferencia de sustratos para la construcción de los nidos se registraron 23 nuevos sustratos de nidificación correspondientes a 10 especies.