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El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica, que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados y vacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial para evaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con la replicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componente principal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentes serotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación, como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Es conocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bien los niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viral en el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su baja sensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con el virus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para la identificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, como proteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Ac específicos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz de detectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural o experimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros de bovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinos y porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en una especificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %), específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animales vacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína no estructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinos infectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. El estudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Ac contra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para ser utilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorear actividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con una o dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego de la revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajo vacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D para una mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso de proteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo y provee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas no estructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en la identificación de animales infectados con VFA.

La capacitación es el proceso por el cual los espermatozoides de mamíferos adquieren la habilidad para fecundar un ovocito, y se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) adquisición de capacidad para sufrir reacción acrosómica (RA) al enfrentarse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. La activación precisa de PKA depende de su adecuada localización en regiones subcelulares concretas. En este sentido, las Proteínas de Anclaje a PKA (AKAPs) forman andamiajes para generar microdominios de señalización y juegan un rol central en restringir la actividad de PKA a sitios específicos. Debido a que los procesos que se desencadenan a partir de la activación de PKA son esenciales para la adquisición de estado fecundante, entender cómo es que esta quinasa se regula en el espacio y tiempo es crucial para descifrar los pasos de la capacitación espermática. En este trabajo utilizamos espermatozoides murinos como modelo para la caracterización de las cascadas de transducción de señales que tienen lugar durante la capacitación. Para estudiar el rol de la interacción PKA-AKAPs se utilizó el péptido inhibidor de anclaje sHT31, en distintos momentos de la fisiología espermática. En primer lugar, validamos el uso de este compuesto, determinando que a las concentraciones de trabajo el péptido no bloquea la actividad catalítica de PKA, pero sí disocia la unión de PKA a AKAP4 en el espermatozoide. Demostramos que el anclaje de PKA a AKAPs es necesario para lograr el estado capacitado, ya que provocar su desanclaje al comienzo de la capacitación resultó en la inhibición de todos los eventos asociados: aparición del patrón de pPKAs, aparición del patrón de pY, hiperpolarización de la membrana plasmática, hiperactivación y capacidad de sufrir RA frente a progesterona. Sin embargo, encontramos que una vez que las células se han vuelto fecundantes, la interrupción repentina de la interacción PKA-AKAPs promueve un rápido influjo de Ca2+ a través del canal CatSper y resulta en la inducción de la RA sin agregado de progesterona. Estos resultados proponen un nuevo evento de señalización que vincula a CatSper con a la reacción acrosómica, en donde el canal es sensible a una activación por PKA provocada por su desanclaje de AKAPs. Por otra parte, debido a que la hiperpolarización del potencial de membrana (Em) es un evento intermedio fundamental en la vía que conduce a la capacidad de RA, y sabiendo que depende de PKA, decidimos estudiar la conexión molecular entre ambos sucesos. En este sentido, los espermatozoides de ratones knock-out en Src no pueden adquirir capacidad de respuesta acrosomal, sugiriendo un rol para la tirosina quinasa en esta vía de señalización durante la capacitación. Por ello, decidimos evaluar la participación de Src en los eventos de la capacitación que conducen a la preparación para desencadenar la RA. Nuestros resultados indican que Src es activada corriente abajo de PKA y que su inhibición bloquea la hiperpolarización del Em sin afectar al patrón de pY que acompaña a la capacitación. Además, la inhibición de Src impidió que los espermatozoides adquieran capacidad de RA frente a progesterona, lo cual pudo revertirse hiperpolarizando farmacológicamente a las células en presencia de inhibidores de Src. Evidencia complementaria sugiere que Src podría activar de manera directa o indirecta al canal de K+ Slo3 para lograr la hiperpolarización del Em durante la capacitación espermática, evento que a su vez es necesario para la adquisición de capacidad de respuesta acrosómica. En conjunto nuestros resultados aportan nuevos datos en el entendimiento de las cascadas de señalización que ocurren durante la capacitación espermática, evidenciando el rol central de PKA como modulador de la misma. PKA podría ser un componente esencial, no sólo en las vías de transducción que conducen a la capacitación, sino también en la regulación de la exocitosis acrosomal una vez que los espermatozoides alcanzaron el estado capacitado. Esta función de PKA requiere tanto de la regulación de su actividad como de su localización subcelular.