Catálogo de publicaciones

Vélez Rueda, A. J. (2020). Desarrollo de herramientas bioinformáticas para el estudio y predicción de la promiscuidad y multiplicidad de sustrato en enzimas. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

El ensamblado y la anotación de genomas es un área de particular interés en genómica, que ha abierto un horizonte de posibilidades impensadas en la época de los primeros avances de la genómica preinformática. Desde las primeras secuenciaciones de genomas completos, se han desarrollado diferentes métodos y herramientas para el procesamiento y anotación de datos genómicos. La aparición de las tecnologías de secuenciación de nueva generación ha significado una verdadera revolución en la biología y, sobre todo, en las denominadas ciencias ómicas. Sin embargo, los enormes volúmenes de datos generados representan nuevos desafíos, tanto a nivel técnico como de análisis. Se genera mucha más datos de los que pueden procesarse para posibilitar la extracción de información en forma confiable, con lo que la cantidad de datos no curados en diferentes repositorios es cada vez mayor. La velocidad con la que crecen las bases de datos y la dificultad de garantizar la calidad de las mismas, hacen que las anotaciones, principalmente automáticas, requieran siempre un gran esfuerzo posterior de curado manual. Asimismo, la disparidad en los formatos y fuentes de datos y la falta de estandarización en las metodologías dificulta la integración entre diferentes análisis, lo que suele requerir también un gran insumo de tiempo para poder extraer información a partir de datos obtenidos por medios diversos. El presente trabajo de tesis tuvo como principal objetivo el diseño, programación, testeo y aplicación de protocolos de trabajo (pipelines) para ensamblado y anotación de genomas y transcriptomas de organismos con diversos niveles de complejidad. Se programaron pipelines para ensamblar y anotar organismos desde virus y bacterias a eucariotas superiores. Cada pipeline fue organizado en forma modular, permitiendo iniciar el proceso desde los primeros pasos de secuenciación hasta las etapas más avanzadas, con la posibilidad de incorporar información procedente de fuentes diversas, tanto internas como externas y de combinar los diferentes pipelines entre sí, según el nivel de análisis que se necesite y la información de que se disponga. A su vez, las anotaciones finales son incorporadas a la plataforma web de BIA (Plataforma de Bioinformática Argentina), interrelacionándose y enriqueciéndose con otros módulos y pudiendo visualizarse y filtrarse en forma flexible. Paralelamente al proceso de desarrollo de los pipelines, los mismos fueron aplicándose a diversos organismos, en un proceso iterativo de testeo y mejoramiento. De esta forma, se ensamblaron y anotaron diversas especies de bacterias, arqueas, eucariotas inferiores y eucariotas superiores, entre ellos: anotación de la arquea extremófila Halorubrum sp. AJ67 y de la bacteria probiótica Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, ensamblado y anotación de las cepas M y B del complejo Mycobacterium Tuberculosis; ensamblado y anotación de un hongo no caracterizado del género Trichoderma, ensamblado, anotación y estudio comparativo del patógeno de maíz Puccinia sorghi race RO10H11247; ensamblado y anotación de Ilex Paraguariensis A. St.-Hil., en el marco del Proyecto de Secuenciación del Genoma de Yerba Mate (PRO.MATE.AR).

El virus de Anticarsia gemmatalis, AgMNPV, es el bioinsecticida viral que ha sido más utilizado en el mundo. Este virus, perteneciente a la familia de los baculovirus, actúa específicamente sobre larvas de la oruga de las leguminosas, Anticarsia gemmatalis, un lepidóptero que causa severos daños en los cultivos de soja y otras leguminosas. A pesar del amplio uso de AgMNPV en países con climas cálidos, como Brasil y Paraguay, la aplicación de este baculovirus en Argentina se ha visto limitada por su tiempo de acción lento en comparación con los insecticidas químicos de amplio espectro. El objetivo del trabajo desarrollado en esta tesis consiste en la generación de herramientas que permitan mejorar las posibilidades de aplicación de AgMNPV como bioinsectida mediante el uso de estrategias de biología molecular. En el segundo capítulo se describe el desarrollo de un sistema de recombinación que establece la base para la modificación genética de AgMNPV. En el tercer capítulo se describe el desarrollo de líneas celulares derivadas de lepidópteros que expresan la proteína mayoritaria del cuerpo de oclusión de los baculovirus, poliedrina. Este desarrollo permitió la generación de cuerpos de oclusión de AgMNPV de genotipo poliedrina negativo (polh-), lo cual representa un avance importante en la generación de bioinsecticidas con una barrera de contención ecológica. En el cuarto capítulo se detalla el desarrollo de una línea celular que expresa un gen indicador (GFP) inducible por la infección con baculovirus. Este tipo de líneas celulares representa un recurso importante para la manipulación cotidiana de baculovirus en cultivo celular y para estudios básicos. En el quinto capítulo se describe la transactivación de promotores del alfabaculovirus AgMNPV y del betabaculovirus EpapGV por parte de factores de transcripción provistos por la infección con AgMNPV en un entorno celular en el que no se replica EpapGV. Este tipo de estudio permite avizorar la perspectiva de expandir el rango de hospedador de AgMNPV a través del desarrollo de baculovirus recombinantes quiméricos entre dos especies de la familia. En el sexto capítulo se describen los avances en el desarrollo de sistemas de recombinación más eficientes para AgMNPV y se discuten algunos resultados novedosos acerca de la función del gen 1629 en la replicación y la infectividad de los baculovirus en cultivo celular.

Diachasmimorpha longicaudata Ashmead (Hymenoptera: Braconidae) es un endoparasitoide solitario de estadios larvales de moscas de la fruta perteneciente a la familia Tephritidae. Es criado a nivel masivo en bioplantas y utilizado en diversas partes del mundo para las estrategias de control biológico (CB) principalmente de dípteros de importancia económica de los géneros Ceratitis, Anastrepha y Bactrocera. Actualmente, se estudia su implementación en nuestro país para el control de Ceratitis capitata Wiedemann (Diptera: Tephritidae). Se cuenta con una vasta cantidad de información acerca de su biología general, fisiología, comportamiento y condiciones de cría artificial. Recientemente se han descripto aspectos genéticos y citogenéticos que permiten profundizar los conocimientos respecto a sus procesos fisiológicos. Este parasitoide posee un ciclo de vida haplodiploide (machos haploides, hembras diploides) y la determinación sexual está gobernada por el mecanismo de alelos complementarios CSD (de las siglas en inglés “Complementary sex determination”) con al menos dos loci involucrados en las vías tempranas de este complejo mecanismo, aunque aún son escasos los conocimientos que se poseen acerca de sus bases genéticas. Estos conocimientos tienen un impacto potencial relevante tanto sobre el diseño de estrategias de mejoramiento de la productividad y calidad de las crías artificiales como sobre la implementación del CB basado en D. longicaudata en el campo. A fin de aportar información genética para mejorar las condiciones artificiales de cría de D. longicaudata y profundizar el conocimiento sobre aspectos moleculares de mecanismos de relevancia para la aplicación del CB en nuestro país, este trabajo de tesis se centró en el estudio de las bases moleculares del sistema de determinación del sexo en esta especie. Se tomaron dos aproximaciones, una aproximación indirecta, caracterizando regiones genómicas a partir del conocimiento de genes involucrados en la determinación del sexo en especies relacionadas y una aproximación directa mediante el análisis de regiones codificantes específicas a través de la secuenciación del transcriptoma de la especie y el análisis comparativo descriptivo de expresión entre machos y hembras del parasitoide. A partir de esta última aproximación, se generó una cantidad masiva de datos de alta calidad, que permitieron conocer una alta proporción de las secuencias expresadas en D. longicaudata. Mediante una búsqueda por homología de secuencia a partir de nuestra base de datos, se ha logrado identificar transcriptos homólogos a dos de las llaves involucradas en la determinación del sexo: el regulador transcripcional feminizer/transformer y el efector que se encarga de regular genes que determinarán caracteres sexuales secundarios, doublesex. Se validaron a posteriori los resultados por medio de la técnica de RT-qPCR y se analizó la expresión diferencial de las variantes de fem y dsx entre machos y hembras; encontrando que existen dos variantes del transcripto homólogo a fem que se expresan diferencialmente entre sexos. Paralelamente, la tecnología de secuenciación masiva posibilitó la identificación y caracterización in sílico de 7000 marcadores moleculares potenciales (SSR y SNP) estableciendo la utilidad de 1106 marcadores microsatélites disponibles para estudios genético-poblacionales para caracterizar la variabilidad genética de poblaciones silvestres y cepas establecidas en condiciones de laboratorio o cría masiva de D. longicaudata.

El uso de herramientas de biología sintética permite realizar una contribución significativa para el avance de la ingeniería genética, mediante la reducción de los tiempos de desarrollo de organismos recombinantes. Sin embargo, la mayoría de las herramientas de biología sintética has sido obtenidas para E. coli. En este proyecto se ha desarrollado una plataforma para modificar genéticamente de manera rápida un microorganismo de alto interés industrial como C. glutamicum. En este trabajo fue diseñado un vector sintético denominado pTGR, en el cual todos sus componentes se encuentran flanqueados por sitios de restricción únicos. El mismo permite el rápido intercambio de secuencias regulatorias así como la obtención de construcciones que permiten la expresión de varios genes simultáneamente. La plataforma que provee el sistema del pTGR contribuye a la exploración de partes involucradas en la expresión génica y facilita el rápido ensamblado de circuitos genéticos el cual permite realizar ingeniería metabólica en C. glutamicum. El sistema fue validado utilizando genes reporteros para ensayar promotores y RBSs y para el ensamblado de operones duales y clústers que contienen dos unidades transcripcionales. Por otro lado se estudiaron estrategias alternativas, que no dependen de elementos reguladores de la transcripción. En este sentido, se determinó que tanto la variación la concentración del inductor así como el intercambio de orígenes de replicación con distinto número de copias, también pueden ser utilizados como herramientas para regular los niveles de expresión de proteínas recombinantes en C. glutamicum. Utilizando las ventajas que provee la plataforma pTGR se estudiaron distintas secuencias de secreción del sistema Tat en C. glutamicum reportadas en la bibliografía, demostrando que la correspondiente a la proteína PhoD de B. subtilis resultó la más eficiente al momento de secretar el gen reportero mCherry. Además, aprovechando la versatilidad que brinda esta herramienta, se sobre-expresaron los traslocadores de la vía Tat, desde el vector pTGR, demostrando que es posible lograr un aumento de la eficiencia de secreción mediante esta estrategia. A continuación se busco emplear la herramienta genética creada para su utilización en sistemas de expresión de proteínas de interés industrial. Así, se utilizaron diferentes péptidos señales evaluados con el sistema pTGR para expresar y secretar la fosfolipasa C de B. cereus (BC-PLC). Esta enzima es un candidato atractivo para el proceso de desgomado enzimático, de aceites consumibles, debido a su capacidad de degradar fosfolípidos. Durante el refinamiento del aceite los fosfolípidos capturan los triacilglicéridos disminuyendo el rendimiento del proceso. Entre las distintas secuencias señales ensayadas, la salvaje de la BC-PLC que utiliza la vía general Sec, fue la que demostró la mayor eficiencia de secreción. A partir de la misma se obtuvieron 0.12 g/L de enzima en sobrenadante de cultivos en Batch de C. glutamicum. En la última etapa del trabajo con el fin de obtener un proceso industrial económicamente viable para la manufactura de la BC-PLC, se evaluó un proceso de Fed-batch a partir de la cepa de C. glutamicum previamente desarrollada para la producción y secreción de esta enzima. Utilizando un medio semi definido y una estrategia de alimentación con flujos escalonados, se alcanzó una concentración final de 5.5 g/L luego de 55 h de proceso. La misma corresponde a una productividad volumétrica de 0.1 g/L.h, siendo hasta el momento el valor más alto reportado de expresión de una enzima heteróloga en esta especie. Finalmente a partir de ensayos de RMN, se demostró que la enzima recombinante fue capaz de hidrolizar completamente los fosfolípidos mayoritarios del aceite crudo de soja fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, demostrando su capacidad para el proceso de desgomado enzimático.

Ayarza, J. M. (2013). Desarrollo de la comunidad bacteriana del floc biológico de barros activados y respuesta a la desestabilización mediada por agentes externos (Tesis de Doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

La polilla del tomate, Tuta absoluta, es una de las plagas más devastadoras del cultivo de tomate en Sudamérica, donde es originaria, y en Europa y África, donde ha ingresado recientemente. El control de T. absoluta se basa principalmente en el empleo de plaguicidas. El objetivo de esta tesis fue establecer las bases para el desarrollo de la Técnica del Insecto Estéril, mediante el empleo de la Esterilidad Heredada (EH) en T. absoluta, y evaluar su integración con el Control Biológico (CB) con entomófagos. Los principales aportes de esta tesis son: - Conocimiento del efecto de los rayos X sobre la biología de T. absoluta. - Determinación de la dosis óptima de radiación X para aplicar la EH en el control de T. absoluta. - Estudio del efecto de la radiación sobre la dispersión de machos irradiados. - Evaluación de la supresión de poblaciones silvestres de T. absoluta mediante la liberación de individuos irradiados en invernáculo. - Determinación del número mínimo de individuos irradiados a liberar para reducir poblaciones de T. absoluta. - Evaluación de la integración de la EH y el CB mediante el empleo de los entomófagos Trichogramma spp. y Tupiocoris cucurbitaceus.

Eucalyptus globulus es la especie forestal con mejor aptitud papelera y para la obtención de bioenergía a partir de celulosa, mayormente plantada en regiones templadas del mundo. Los proyectos genómicos en Eucalyptus han incrementado el número de secuencias disponibles en los bancos de datos públicos. Los marcadores funcionales públicos, si bien son frecuentes en diferentes cultivos, son aún escasos en especies forestales. De allí la importancia de la búsqueda y validación de regiones SSRs en genes de interés, para ser utilizados en futuros proyectos de mejoramiento asistido por marcadores (marker assisted breeding). En este estudio, se identificaron secuencias no redundantes de ADN de Eucalyptus (genómicas y ESTs) depositadas en bancos de datos públicos para revelar secuencias microsatélites y predecir, in silico, su función putativa. Éstas fueron luego validadas en laboratorio para predecir su potencial uso en análisis de diversidad genética. A partir de 12.690 ESTs de Eucalyptus globulus publicados en NCBI se identificaron 4.924 secuencias no redundantes. De éstas, 952 unigenes (19,3%) contenían 1.140 regiones SSR. Luego del análisis bioinformático de estos EST-SSRs, se diseñaron 979 oligonucleótidos novedosos y se predijo su función putativa, incluyendo categorías Gene Ontology (GO) según su proceso biológico, función molecular y componente celular. Se identificaron así 29 SSRs en 24 genes candidatos (estructurales y reguladores) para calidad de madera. Los SSRs se encontraron en promotores, intrones y exones de genes candidatos (GC) de distintas rutas metabólicas (biosíntesis del fenilpropanoico, biosíntesis de celulosa, metabolismo de hemicelulosas, ruta metabólica del shikimato, metabolismo de la metionina y genes de tubulinas y el factor de transcripción LIM1). Un total de 85 SSRs (56 EST-SSRs y 29 SSRs incluídos en GC) hallados en este trabajo fueron analizados para su validación en 8 genotipos de E. globulus, resultando positivos un 65%. A partir de esta validación se obtuvieron 17 EST-SSRs y 12 GC-SSRs polimórficos. Con éstos se estimaron los valores de diversidad en una muestra de 60 individuos no emparentados de E. globulus representantes de seis razas que cubren el rango de distribución natural de la especie. Los valores de PIC, Ho y UHe variaron ampliamente entre aproximadamente 0,02 y 0,9, mientras que el número de alelos varió entre 2 y 16, con un promedio de 7,55. Al realizar el test de Equilibrio de Hardy Weinberg (EHW) para los 29 loci, se encontró que 14 de ellos mostraron un significante déficit de heterocigotas (P<0,01). Este desvío del EHW podría explicarse por la presencia de subestructura poblacional y a la presencia de alelos nulos que sesgó las estimaciones de las frecuencias alélicas. Se realizó el estudio de transferibilidad de 49 loci (37 EST-SSRs validados (polimórficos y monomórficos) y los 12 GC-SSRs polimórficos) a otras seis especies de Eucalyptus (E. camaldulensis, E. dunnii, E. grandis, E. saligna, E. tereticornis y E. viminalis). Se encontró que 33 marcadores amplificaron en las seis especies estudiadas y seis en al menos cinco, mostrando la alta transferiblidad de los mismos. Finalmente, el estudio del polimorfismo y transferibilidad de los marcadores funcionales, permitió la selección de un conjunto de 13 (7 EST-SSRs y 6 GC-SSRs) altamente informativos y transferibles a otras seis especies de Eucalyptus. El conjunto de marcadores desarrollados son altamente informativos tendrán un uso potencial en estudios de diversidad genética, taxonomía, mapeo de QTL y en facilitar, en un futuro, la selección asistida en el mejoramiento de Eucalyptus.

Ingeniería de tejido ha sido definida como una ciencia interdisciplinaria cuyo fin es la síntesis de materiales que logren mejorar o a restaurar el tejido dañado con el fin de establecer terapias alternativas para tratamientos en caso de pérdida de tejido o fallas de órganos esenciales, ya que los trasplantes están frecuentemente limitados por la escasez de donantes y el alto riesgo de rechazo o transferencia de enfermedades. Por este motivo, el presente trabajo de tesis tiene como objetivo el desarrollo de hidrogeles basados en alginato de sodio que permitan la regeneración de tejido óseo y cartilaginoso. En una primera etapa de este trabajo, se extrajo alginato de sodio de la nervadura y lámina del alga parda Undaria pinnatifida. Junto con el polisacárido de origen comercial, los aislamientos fueron caracterizados fisicoquímicamente. Además, con el objetivo de minimizar su posible potencial inmunogénico, se utilizó un método de purificación simple que permitió disminuir impurezas tales como proteínas y polifenoles. Para evaluar el éxito de este proceso, se analizó la producción de un marcador de citotoxicidad y la morfología de un modelo de macrófagos en cultivo (RAW 264.7) en presencia de los distintos alginatos, observándose que el efecto tóxico inicial de las muestras crudas resultó prevenido sin producir cambios relevantes en las características fisicoquímicas del polímero. Además, al estudiar la capacidad osteogénica del polisacárido, se encontró que la proliferación y diferenciación de CPMO se vio favorecida con la purificación del mismo. Por otra parte, se procedió a la síntesis de hidrogeles de alginato entrecruzados iónicamente con estroncio con el fin de obtener materiales con actividad osteogénica y capacidad de liberación droga de manera localizada en el sitio de interés. Se lograron matrices de gran hinchamiento, pero con un porcentaje de degradabilidad muy alto, alcanzado luego de sólo 24 h, motivo por el cual se planteó un nuevo diseño para la fabricación de scaffolds a base de alginato. Posteriormente, se desarrollaron biomateriales a partir de la síntesis de redes poliméricas de HEMA-EGDMA semi-interpenetradas (SIPN) con alginato. Con este método se obtuvieron cuatro hidrogeles en los que se variaron las proporciones de iniciador y entrecruzante para obtener una familia de SIPN con propiedades versátiles (HA, HA-E0.5, HA-E0.25 y HA-A0.5), además de una matriz sin alginato (pHEMA) con el fin de evaluar el efecto producido por la incorporación del polisacárido al material. Estos fueron observados por SEM y se le realizaron pruebas de hinchamiento, degradación, pruebas mecánicas y medidas de ángulo de contacto. Se encontraron materiales con porosidad baja, pero con mejoras en la capacidad de hinchamiento y degradabilidad debida a la incorporación de alginato a la matriz polimérica. Además, se encontró que HA y HA-E0.25 presentaron propiedades mecánicas en el orden del tejido cartilaginoso. Por su parte, los estudios in vitro mostraron que los materiales con alginato exhibieron una muy buena biocompatibilidad. También se demostró la versatilidad de estos hidrogeles, ya que permitieron la adhesión y proliferación de tres tipos celulares distintos. Además, el agregado de alginato favoreció el desarrollo osteogénico de las células progenitoras de médula ósea (CPMO) y el crecimiento de condrocitos primarios, estabilizando el fenotipo condrogénico en el tiempo tanto con respecto a pHEMA como a las células crecidas en monocapa sobre el plato de cultivo estándar. Por su parte, también se evaluó la respuesta inmunogénica con RAW 264.7, encontrando que la incorporación del polisacárido a una red polimérica de HEMA-EGDMA previene un posible efecto citotóxico de pHEMA. Por último, se empleó un modelo in vivo para evaluar tres (pHEMA, HA y HA-E0.25) de nuestros biomateriales como sustitutos óseos. Se seleccionó un modelo de lesión en calota en roedores ampliamente utilizado por otros investigadores. En el defecto creado, se implantaron los hidrogeles con previa hidratación en PBS durante dos días. En la evaluación histológica realizada sobre los cortes teñidos con Hematoxilina-Eosina no se evidenció rechazo del material, observándose la formación de tejido conjuntivo denso y frentes de reosificación en HA y HA-E0.25. Sin embargo, no se apreció la penetración celular hacia el material, lo que indica que es necesario rediseñar la arquitectura de los scaffolds para aumentar su porosidad. En conjunto, estos resultados resultan muy prometedores en cuanto a la potencialidad de HA, HA-E0.5, HA-E0.25 y HA-E0.5 para ser utilizados como sustitutos biológicos en regeneración ósea y/o cartilaginosa.

La utilización de quinolonas para el tratamiento antimicrobiano es muy frecuente hoy en día tanto en la medicina veterinaria como humana. Debido a la estructura química que presentan estos antibióticos, es muy importante tener en cuenta la administración en altas dosis y poder relacionarla con los efectos adversos que ello pueda generar en el ser vivo. Por lo general, las dosis utilizadas actualmente están por encima de las dosis terapéuticas alcanzando los niveles de dosis tóxicas. Sumado a la repetición en las dosis diarias, esto conlleva a la formación de cristales de quinolonas que pueden alojarse en los riñones. Por un lado, teniendo en cuenta los avances en la liberación controlada de drogas y por otro lado la utilización de matrices poliméricas para albergar tanto moléculas inorgánicas como biomoléculas, se propuso como objetivo utilizar una matriz polimérica capaz de albergar una quinolona de origen sintético y observar su liberación controlada en el tiempo. De esta forma, evitar la administración en dosis toxicas del antibiótico ya que una liberación controlada ofrece la posibilidad de administrar dosis constantes y prolongadas en el tiempo evitando así la exposición a dosis continuas y en niveles por encima de la ventana terapéutica. Con el fin de lograr dicho objetivo, en el presente trabajo de Tesis se trabajó con una quinolona llamada enrofloxacina y una matriz polimérica compuesta de polivinil alcohol y pectina. Ambos polímeros están aprobados para su uso en sistemas bio. Aprovechando las características del polivinil alcohol, se utilizaron películas a base de ciclos de congelado y descongelado para albergar a la enrofloxacina y observar su cinética de liberación y en un futuro proponer a dichas películas como dispositivos para el tratamiento de infecciones in situ, es decir en forma de parche o apósito en el lugar de la infección. Por lo general las infecciones alojadas en la piel se observan en zonas necróticas o lesionadas como lo son las quemaduras o las escaras. Estas zonas necróticas ofrecen una barrera en la difusión de antibióticos hacia el lugar de la infección. Es por ello que en el presente trabajo, se propuso trabajar con una queratinasa capaz de hidrolizar proteínas presentes en esas zonas lesionadas y de esta forma permitir que la administración local del antibiótico llegue al lugar de la infección. Con lo cual se trabajó con películas conteniendo el antibiótico y el antibiótico más la queratinasa. Las películas conteniendo al antibiótico y al antibiótico más la queratinasa se caracterizaron mediante distintas técnicas utilizadas ampliamente en el área de materiales con el fin de obtener información sobre la interacción de la enrofloxacina con la matriz y si la presencia de pectina y/o la enzima, afectaban en la cinética de liberación del antibiótico.