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Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límite fundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Las nanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución, han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resolución espacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En la práctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto de variables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de los marcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienen las ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso poco invasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numérico por el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición de su patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculas individuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico de los fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patrones de emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del número de fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posiciones de cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen de superresolución es necesario que los marcadores estén separados por distancias menores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedan observarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite el encendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales de la nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones de la microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía por localización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización con posibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construido como parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 se describen aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica: el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina y la distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosoma cruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.

Las nanoantenas metálicas nos permiten, gracias a sus propiedades plasmónicas, acceder en forma eficiente a las escalas nanométricas y a fenómenos que ocurren en la escala sub-difracción. Cuando una nanoantena metálica es excitada ópticamente por un pulso ultrarrápido, una parte de la energía decae rápidamente a la red atómica iniciando vibraciones mecánicas coherentes y localizadas. A su vez, las vibraciones mecánicas en una nanoantena pueden afectar sus propiedades plasmónicas y ser así detectadas ópticamente. Estas características convierten a las nanoantenas metálicas en nanoresonadores mecánicos en el rango de GHz a THz , con la propiedad de poder indagar la nanoescala utilizando ondas de hipersonido. En este trabajo estudiaremos diversos sistemas plasmónicos como generadores y detectores de hipersonido, mostraremos como cambian sus modos mecánicos en función de forma, tamaño y condiciones de contorno, cómo se comportan las ondas generadas en la nanoescala y cuáles son sus potenciales aplicaciones. La introducción al tema y motivaciones se discute en el Capítulo 1. Durante todo el trabajo de Tesis se utilizó la técnica pump-probe a uno y dos colores para medir sobre nanoantenas de oro fabricadas mediante litografía de electrones y mediante química húmeda. Las mediciones fueron siempre de partícula única, pudiendo así individualizar sus propiedades y evitando el ensanchamiento inhomogéneo. La descripción de los dispositivos, técnicas experimentales y diseños de los experimentos se discute en el Capítulo 2. En el capítulo 3 se presentan las mediciones de las oscilaciones mecánicas de nanocilindros fabricados químicamente y depositados sobre un sustrato de cuarzo, caracterizando sus frecuencias, así como los efectos provocados por irradiación con láser, que son básicamente el calentamiento de la nanoantena y el entorno y el reshaping por difusión atómica superficial. Además, se demuestra cómo el valor de la frecuencia de oscilación de los nanocilindros individuales es sensible a las propiedades mecánicas del entorno en el rango de GHz, que es un rango generalmente no alcanzado por los ensayos mecánicos estándar. Esta técnica abre un amplio rango de posibilidades para el estudio de las propiedades térmicas y mecánicas de polímeros en estas escalas espaciales y temporales. Buscando nuevas formas de sintonizar los modos mecánicos en nanoantenas, en el capítulo 4 se estudiaron nanobarras de oro sobre sustrato de cuarzo fabricadas por litografía de electrones, sobre las cuales se insertaron parches de sílice de forma localizada en tres configuraciones distintas. Se pudieron medir correctamente las tres configuraciones y compararlas con las nanobarras sin sílice, encontrando diferencias de frecuencia mecánica, amplitud de señal y decaimiento de las oscilaciones. Las frecuencias experimentales fueron comparadas con valores simulados con los cuales se observó excelente coincidencia. Las simulaciones fueron realizadas por colaboradores del Imperial College de Londres, mediante el método de elementos finitos (FEM) en el dominio de las frecuencias. Se encontró que los parches en los extremos de la nanobarra tienen bajo efecto en la frecuencia mecánica, pero disminuyen la amplitud de la señal y afectan la respuesta plasmónica. Si el parche se coloca en el centro de la nanobarra, la resonancia plasmónica no se ve afectada, pero la frecuencia mecánica aumenta y no disminuye su amplitud. Finalmente, si se cubre por completo la nanobarra con sílice obtenemos mayor aumento de la frecuencia mecánica que el caso anterior, pero también gran disminución de la señal medida, debido al corrimiento significativo de la respuesta plasmónica. En el capítulo 5 se diseñaron experimentos para comprender la interacción de los nanoresonadores litografiados con el sustrato donde están adheridos y estudiar la propagación del hipersonido en esos sustratos. Para llevar adelante estas mediciones se desarrolló una novedosa técnica de medición diferida que consistió en excitar una nanoantena de oro litografiada en un sustrato de cuarzo y detectar la onda de hipersonido generada y transmitida a través del sustrato con otra nanonatena ubicada a una distancia diez veces mayor que sus tamaños. Luego, utilizando diferentes distancias entre nanoantenas se logró medir la velocidad de propagación de estas ondas mecánicas, concluyendo que se trata de ondas mecánicas superficiales SAW (surface acoustic waves) del tipo Rayleigh. Esta es la primera vez que se demuestra el acoplamiento de SAWs con resonancias plasmónicas producidas en nanoantenas metálicas únicas. Las mediciones fueron realizadas para nueve combinaciones de distintos pares de nanoantenas conformados por nanobarras horizontales o verticales y nanodiscos, en las cuales se detectó señal, concluyendo que en los nueve casos hay acoplamiento a través del sustrato. Esta técnica tiene un gran potencial para poder estudiar cómo afecta el sustrato a los nanoresonadores y a cuáles de sus variables influye más. También abre la puerta a investigar diferentes métodos para direccionar las ondas superficiales SAW.