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Muchas formas de vida han desarrollado mecanismos para resistir al desafío impuesto por las especies reactivas del oxígeno, o para utilizar estas especies con fines regulatorios o de señalización. En los parásitos tripanosomátidos, el metabolismo redox constituye una compleja red dependiente fundamentalmente de tripanotión, aunque otros tioles como la glutationil espermidina y el glutatión también están presentes. En esta tesis, se aborda la caracterización de proteínas redox de Trypanosoma cruzi, y la dependencia de las mismas con el glutatión. Se presenta el estudio de una glutationil espermidina sintetasa, a través del análisis cinético de la proteína recombinante. El análisis de la expresión de esta proteína permitió concluir sobre su ocurrencia en el estadio replicativo del parásito en el huésped. Se presentan también estudios realizados con el objetivo de caracterizar funcionalmente dos glutarredoxinas presentes en el parásito: una monotiólica (formando parte de una proteína multidominio), y una ditiólica. Mediante ensayos cinéticos se pudo establecer la capacidad de estas proteínas como mediadores en la reducción de diversos sustratos y la utilización de diversos sistemas reductores, como los dependientes de tripanotión y glutatión, de relevancia fisiológica en el parásito. Mediante técnicas basadas en la inmunodetección, fue posible establecer localización subcelular de estas proteínas en T. cruzi. El análisis funcional empleando cultivos del parásito permitió poner de manifiesto los posibles roles que podrían cumplir la glutarredoxina ditiólica en procesos vinculados con el ciclo de vida del tripanosoma. Los resultados presentados en esta tesis aportan al conocimiento sobre la biología redox en este parásito.

Se estudió la suplementación energética contrastante en carbohidratos: grano de maíz (MZ; almidón) vs. cascarilla de soja (CS; hemicelulosa y celulosa), sobre la biohidrogenación ruminal (BH) de los ácidos grasos (AG) de cadena larga, el microbioma y la calidad de la leche de ovejas en un sistema de base pastoril. En el experimento I se evaluó el consumo (CMS), la digestibilidad (DMS) y la producción (PL), composición química y perfil de AG de leche de ovejas consumiendo raigrás (50:50 F:C). Se utilizaron diez ovejas lecheras (30 DEL; 65.8 ± 8.67 kg de PV) en un DCA con medidas repetidas, con dos tratamientos: CS o MZ (14 d de adaptación y 3 semanas de medición). Los resultados fueron analizados por ANVA con un procedimiento de modelos mixtos (animal como efecto aleatorio y el tratamiento, semana y la interacción como efectos fijos) y las medias comparadas por Tukey (α= 0,05). El CMS y de forraje y digestibilidad de FDA fue superior en CS, aunque la DMS fue mayor para MZ (P menor a 0.05). La PL fue un 24% superior en CS (aunque sin diferencias estadísticas), con mayores contenidos de omega-3 y PUFA (P menor a 0.05). En el experimento II, se evaluaron las variables de ambiente ruminal y perfil de AG en rumen. Se utilizaron seis ovejas lecheras con cánula ruminal (78,19 ± 13,53 kg de PV), en un diseño cross-over 2x3, bajo la misma dieta y tratamientos que en I. Sobre muestras de licor ruminal (08:00, 12:00, 16:00, 20:00, 00:00 y 04:00 hs) se determinó pH, nitrógeno amoniacal (N-NH4) y ácidos grasos volátiles (AGV). Los resultados fueron analizados igual que en I para un cross-over. La relación Ac:Prop, el N-NH4 y el pH ruminal fueron mayores en CS (P menor a 0.05). El trans-11 y el C18:1cis-9 fueron superiores en CS (P menor a 0.05) y el C18:2 y C18:2 cis-9, trans-11 CLA tendieron a ser mayores en MZ (mayor consumo de linoleico; P menor a 0.05). El C18:2 trans-10, cis-12 CLA tendió a ser superior en CS (0,14 vs. 0,09 g/100g AG) (P menor a 0.1). El análisis de microbioma ruminal se hizo a través de la secuenciación de la región V4 del gen 16S rRNA (bacterias y archaeas) de 18 muestras del Exp. II, utilizando plataforma Illumina MiSeq. Se identificaron 20 phylum bacterianos, lo más abundantes fueron Firmicutes y Bacteroidetes (RA; 54,86% y 34,81% en CS y 69% y 21,15% en MZ; P menor a 0.05) y 90 asignaciones taxonómicas (mayor RA: Clostridiales, Prevotella, Bacteroidales, Methanobrevibacter, Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, Butyrivibrio, Ruminococcus, Coprococcus, Treponema y Methanosphaera). Sólo 23 difirieron entre dietas y Ruminococcus, Butyrivibrio y Shuttleworthia fueron superiores en MZ (P < 0.05). Estos dos estuvieron correlacionados entre sí y con el cis-9, trans-11 CLA (P menor a 0.01; r=0.79) y con el trans-10, cis-12 CLA se correlacionó Blautia en CS (P menor a 0.01; r=0.84). La suplementación con CS resultó en mayor PL y % de grasa, con un perfil más saludable. La BH difirió entre suplementos, posiblemente por la composicion del microbioma. Las correlaciones entre AG y ciertos géneros entre sí podrían contribuir a dilucidar la composicion bacteriana de los llamados “grupos A y B” del proceso de BH.

Las poliaminas son policationes orgánicos nitrogenados de bajo peso molecular, ampliamente distribuidos en todos los seres vivos, que participan en numerosos procesos metabólicos y fisiológicos. Si bien estos compuestos tienen una importante participación en la proliferación celular, no se conoce su papel fisiológico exacto. Una de las tres estrategias fundamentales para determinar las posibles funciones de las poliaminas en los seres vivos es el estudio de las alteraciones que se producen en celulas u organismos que carecen o tienen disminuido el contenido endógeno de poliaminas, siendo por diversas razones la mejor estrategia. Se han desarrollado dos sistemas para disminuir el contenido endógeno de estos policationes: 1.-la utilización de inhibidores dc la biosíntcsis de poliaminas y 2.- la obtención de mutantes auxótrofas para estas bases orgánicas. El uso de las mutantes constituye una muy buena herramienta de trabajo y ha permitido determinar algunos de los papeles fisiológicos de las poliaminas en los seres vivos. La levadura Saccharomyces cerevisiae es un excelente modelo para el estudio de la bioquímica y de la biología celular y molecular en eucariotes. En los últimos años se han aislado mutantes de este organismo auxótrofas para poliaminas^21,32,33,116, pero han sido poco estudiadas y nos permitirían determinar los papeles fisisológicos de estos compuestos en la proliferación celular. Estas mutantes crecen deficientemente^32,33,116, no pueden esporular^32, no mantienen el plásmido "killer"^118 y tienen alterado el transporte de colina^33. En el presente trabajo se utilizó la cepa de levaduras S.cerevisiae 179-5 auxótrofa para poliaminas obtenida por Hosaka et al^33. El estudio de las alteraciones que se producen en ausencia de estos policationes permitió asignarles nuevas funciones en este organismo. Hemos encontrado que se producen una serie de deficiencias en ausencia de poliaminas, además de las descriptas previamente^32,33,116,118. a.- La síntesis de macromoléculas, ADN, ARN, y proteínas está disminuida, recuperándose primero la síntesis proteica por reagregado de poliaminas. b.-Los ribosomas se encuentran disociados, siendo el índice de asociación dependiente del grado de ayuno; muestran además una mayor sensibilidad al efecto disociante de la presión hidrostática durante la corrida. Además, responden menos al efecto asociante del catión Mg²+; el catión monovalente K+, por el contrario, los disocia más facilmente. El agregado in vitro de poliaminas no altera el equilibrio de subunidades ribosomales. También se observan alteraciones en los polisomas, hay una menor proporción de monosomas involucrados en la síntesis proteica y aparecen estructuras denominadas "halfmers" que son acúmulos de la subunidad 40S sobre el ARNm. Todas estas evidencias demuestran por primera vez un papel fisiológico de las poliaminas en el ensamblado y/o biogénesis del ribosoma eucariótico, previamente hallado en procariotes. c.- La pared celular se vuelve más resistente al ataque de diversas enzimas líticas, dependiendo del grado y tiempo de ayuno de los cultivos. La lisis producida por estas enzimas aumenta parcialmente por agregado de distintos agentes que favorecen su acceso al sustrato, que es la capa más interna de glucano β1-3. La composición química de la pared se encuentra alterada, pues disminuye drásticamente la cantidad de glucano β1-3, aumentan ligeramente las manoproteínas y se incrementa moderadamente el glucano β1-6. La estructura de la pared celular, analizada por microscopía electrónica, no es homogénea, es de mayor espesor y aparecen microcuerpos electrodensos dentro de la misma de probable origen ciloplasmático. Por lo tanto, se pudo ver que las poliaminas participan en la síntesis y/o estructura de la pared celular, siendo la primera vez que se describe este papel para estos compuestos. d.- Se observaron por microscopía de contraste de fase y electrónica una serie de cambios morfológicos en la célula que sugieren que las poliaminas participan y/o regulan algunos de los eventos específicos del ciclo celular. Los cultivos se arrestan en fase G1, como organismos no brotados, pero un porcentaje (5-15%) posee multibrotaciones, algunas de ellas en sitios anormales. Las células son más grandes, lo que se confirmó por análisis de los tamaños de poblaciones celulares con un Coulter Analyzer. Además, utilizando un colorante fluorescente específico para ADN que tiñe los núcleos celulares, se observaron alteraciones en la mitosis. La septación también se encuentra alterada como se observa por microscopía electrónica.

Fil:Cataldi, Angel Adrián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Cozza, Eduardo Néstor. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Las bacterias sintetizan y acumulan diferentes polisacáridos de tipo α y β, los cuales cumplen funciones relevantes en la adaptación a los distintos entornos ambientales y en la interacción de las mismas con otros organismos. Los estudios que realizamos se refirieron especificamente al metabolismo de los glucanos cíclicos y del glucógeno en bacterias del suelo que interaccionan con plantas. Una parte del trabajo estuvo orientada a conocer el tipo de glucano que producen los rizobios que establecen simbiosis con el género Lotus. En dichos estudios se estableció que los glucanos cíclicos producidos por la cepa B. loti NZP 2309 tienen el mismo tipo de unión y estructuras estrechamente relacionadas con los descritos previamente en B. japonicum USDA 110, aunque la estructura de la especie mayoritaria de cada cepa es diferente. La cepa B. loti NZP 2309 produce una mezcla de glucanos cíclicos con uniones β(1-3), β(1-6), que están formados por especies neutras, no sustituidas, con DP= 10, 11 y 12, y la especie cíclica mayoritaria esta ramificada, tiene un DP=11 y está formada por un anillo de 10 residuos de glucosa con un único residuo terminal que forma la rama. La proporción de enlaces glucosidicos que tiene este glucano cíclico es 3:7:1 para las uniones β(1-3), β(1-6)y β(1-3, 6) respectivamente. La comparación de los glucanos cíclicos producidos por las cepas de B. loti NZP 2309 y B. japonicum USDA 110, sugiere que dichas moléculas tienen propiedades hidrofóbicas diferenciales y distinta capacidad de unión con flavonoides de leguminosas. Por otra parte, se observó que ambas cepas de Bradyrhizobium sintetizan in vitro, glucanos cíclicos β(l-3), β(1-6) por mecanismos similares y que dichos glucanos están estructuralmente relacionados. En B. loti NZP 2309 se identificó una proteína de membrana interna de 85 kDa que podría estar involucrada en la sintesis de glucanos solubles β(1-3) y β(1-6); insolubles β(1-3) tipo laminarina, o en la sintesis de ambos compuestos. Las moléculas sintetizadas in vitro están formadas principalmente por enlaces β(1-3), mientras que las moléculas producidas in vivo tienen mayor proporción de enlaces β(1-6). Nuestros resultados sugieren que la síntesis de glucanos cíclicos β(1-3), β(1-6)en Bradyrhizobium sp podria involucrar la formación de un glucano cíclico con uniones β(1-3), al que posteriormente se introducen uniones β(1-6)por transglicosilación, a través de la proteína NdvC Además, determinamos y comparamos el tipo de glucano que sintetizan y acumulan dos cepas de colección de M. loti, y evaluamos si la estrucutra de los mismos está relacionada con la capacidad que tienen dichas cepas para nodular distintas espcecies de Lotus. Se determinó que las cepas M. loti NZP 2213 y NZP 2037 producen glucanos cíclicos neutros y sustituidos con residuos aniónicos y uniones β(1-2), los que son similares a los reportados en otros rizobios de crecimiento rápido. La sintesis de los glucanos de M. loti se realiza a través de una proteína intermediaria que tiene una masa molecular similar a la proteína de 319 kDa reportada en otros rizobios que sintetizan glucanos cíclicos β(1-2).Se estableció que el tipo de glucano producido por las cepas M. loti NZP 2213, NZP 2037 y B. loti NZP 2309 no está relacionado con el rango de hospedante, ya que se determinó que las dos especies de M. loti producen glucanos similares con el mismo tipo de unión y presentan distinto rango de nodulación. Además, se observó que dos cepas con distinto tipo de glucano forman nódulos efectivos en una misma especies de Lotus. Otra parte de la tesis se centró en el metabolismo del glucógeno en bacterias que interaccionan con plantas. Se clonó y caracterizó un fragmento de ADN genómico de B. loti que tiene homologia con el genes de la síntesis de glucógeno y que contiene gran parte del gen glgC y el gen glgA completo, que codifican para las enzimas ADPGlc PPasa y GS, respectivamente. El fragmento clonado es similar a una región presente en el genoma de B. japonicum, indicando que la organización de los genes estructurales del metabolismo del glucógeno en el género Bradyrhizobium está conservada y es diferente a la reportada en otras bacterias. Las secuencias aminoacidicas de la ADPGlc PPasa y GS de B. loti presentan un grado de homologia mayor con las enzimas de B. japonicum que con otras enzimas homólogas de rizobios. La ADPGlc PPasa de B. loti pertenece al grupo V de ADPGlc PPasas que están altamente reguladas ya que se activan por Fru 6P, Fru 1,6 bisP y piruvato. La actividad de esta enzima en nódulos reveló que la ADPGlc PPasa de bacteroides de B.japonicum aumenta con la maduración del nódulo, cuando los mismos todavía tienen actividad reductora de acetileno. Por otra parte, se realizaron experimentos de mutagénesis sitio-dirigida con la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens, que se tomó como modelo experimental, para determinar el rol que tienen los residuos de arginina que están conservados y ubicados en la región N-terminal de las ADPGlc PPasas reguladas positivamente por Fru 6P y piruvato. Se determinó que una carga positiva en la posición 32 sería necesaria para mantener la afinidad aparente de las ADPGlc PPasas activadas por hexosas-fosfato y/o piruvato y cualquier modificación de arginina por otro aminoácido que altere el tamaño o la hidrofobicidad, reduce la afinidad aparente por Fru 6P. El comportamiento de las mutantes en la posición 33 respecto a los activadores fue diferente, afectándose de manera más drástica la activación por Fru 6P que la activación por piruvato. La presencia de arginina en la posición 33 es muy importante para la activación de la ADPGlc PPasa de A. tumefaciens y no podría ser reemplazada por otro aminoácido. La presencia de arginina en la posición 45 es importante para la activación de la enzima por Fru 6P pero es poco probable que desempeñe un rol directo en la unión de un efector particular, ya que está completamente conservada entre todas las ADPGlcPPasas bacterianas analizadas.

Los hongos responsables de prodredumbres reducen el rendimiento de los cultivos y contaminan las cosechas con micotoxinas tóxicas para seres humanos y animales. Los mismos incluyen especies de Fusarium causantes de podredumbres de cereales que son productores de fumonisinas y tricotecenos, y especies de Aspergillus de la sección Nigri responsables de podredumbres de uvas y contaminación con ocratoxina A. El control químico de estos hongos se basa en el uso de fungicidas comerciales los cuales son costosos, contaminan el ambiente y pueden conducir al desarrollo de resistencia fúngica. Los extractos vegetales podrían proveer nuevas moléculas que superen esos problemas. En este trabajo, se investigó el efecto inhibitorio de extractos de partes aéreas (hojas y tallos) de plantas autóctonas del Noroeste Argentino Amphilophium cynanchoides, Tecomastans, Macfadyena cynanchoides y Jacaranda mimosifolia sobre especies de Fusarium (Fusarium graminearum y F. verticillioides) y Aspergillus (A. carbonarius y A. niger). De los 24 extractos obtenidos, 10 alcanzaron a inhibir el 50% del crecimiento fúngico (CI50). Ensayos de microdilución indicaron que los extractos con los menores valores de CI50 fueronlos de acetato de etilo de hojas y tallos de A. cynanchoides contra F.graminearum (CI50=1320 ppm) y F. verticillioides (CI50=1305ppm), respectivamente, y el extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides contra A. niger (CI50=1025 ppm) y A.carbonarius (CI50=1066 ppm). El extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides fue el único que suprimió completamente el crecimiento fúngico (CIM=2500 ppm). El mismo fue antifúngico sobre todas las cepas fúngicas ensayadas en bioautografía por siembra puntual,donde las cepas de Aspergillus fueron más sensibles que las de Fusarium.Los constituyentes antifúngicos del extracto diclorometano se aislaron e identificaron como 2-hidroxi-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftoquinona (lapachol) y 1-hidroxi-4-metil antraquinona.La antraquinona fue más activa sobre las cepas fúngicas (CIM= 78,1-625 ppm) que el lapachol (CIM=312,5-1250 ppm). El extracto diclorometano y sus constituyentes antifúngicos se ensayaron en mezclas con propiconazol sobre todas las cepas fúngicas, con metabisulfito de sodio contra las cepas de Aspergillus y con sorbato de potasio sobre cepas de Fusarium. El extracto y sus metabolitos aislados tuvieron un efecto sinérgico con el metabisulfito de sodio sobre las cepas de Aspergillus y de propiconazol sobre las cepas de Fusarium.Incorporados en jugo de uva en concentraciones sub-inhibitorias, el extracto diclorometano, el lapachol y la 1-hidroxi-4-metilantraquinona inhibieron la síntesis de OTA mientras que el metabisulfito de sodio estimuló la acumulación de esa micotoxina. Sin embargo, los mismos suprimieron la producción de OTA en mezclas con metabisulfito de sodio. El extracto diclorometano de tallos de M. cynanchoides y sus quinonas identificadas tienen potencial como aditivos de metabisulfito de sodio contra Aspergillus responsables de la podredumbre negra de la uva.