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Lograr dosis terapéuticas con drogas de elevada toxicidad y/o importantes efectos secundarios, sigue siendo un desafío para la tecnología farmacéutica. Los métodos de liberación controlada y sostenida de moléculas constituyen una nueva estrategia de desarrollo en la industria farmacéutica que permite reducir dosis, frecuencias de administración y toxicidad de fármacos con el consecuente impacto social y económico. A tal fin, el objetivo del presente trabajo de tesis es desarrollar vehículos más eficientes para el transporte y liberación de moléculas, que si bien pueden ser de interés biológico y de utilidad en el tratamiento de patologías agudas y crónicas, su toxicidad limita el uso terapéutico. Se postula desarrollar partículas que mejoren la administración de drogas anticancerosas encapsuladas con una alta eficacia y baja incidencia en sus efectos secundarios. Se propone el empleo de biopolímeros naturales para su utilización como matrices transportadoras y el desarrollo de tecnología de producción de micropartículas nanoestructuradas a escala de laboratorio, con la finalidad de una potencial aplicación en el ámbito farmacéutico. En forma preliminar, se trabajará con una molécula modelo, rojo congo como análogo de fármacos, con la finalidad de explorar, determinar y optimizar condiciones experimentales de síntesis de biogeles y sus propiedades. En una segunda etapa se realizarán estudios con un fármaco seleccionado, Doxorubicina, anticancerígeno perteneciente a la familia de las antraciclinas con elevada toxicidad, y de amplio uso en tratamientos oncológicos, para desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Se trabajará sobre diferentes matrices biológicas naturales, empleando polímeros de origen vegetal: alginatos (producidos por algas), pectinas y gomas; y a su vez se empleará un polímero de origen microbiano (EPS y Emulsano) cuya producción y purificación será incluida en el presente proyecto. Se explorará el desarrollo de microesferas generadas a partir de diferentes estrategias con biopolímeros simples, mezclas biopoliméricas, recubrimientos biopoliméricos, y/o sistemas híbridos (inorgánicos-biopoliméricos), mediante el empleo de diferentes polímeros tanto de origen vegetal como sintetizados en nuestro laboratorio, con diferentes estrategias metodológicas: técnicas de gelación iónica, síntesis química por copricipitación coloidal y fluidos supercríticos. Se caracterizarán y evaluarán sistemas seleccionados, empleándose técnicas de microscopía, espectroscopía vibracional (FTIR y RAMAN) y de dispersión de luz (light scattering, AFM, etc), análisis reológicos y modelamiento cinético. Se analizarán las capacidades de almacenamiento y condiciones de entrecruzamiento, estabilidades en medios simulados al fluido gástrico e intestinal y las cinéticas de liberación, así como toxicidad en sistemas in vitro.

En la actualidad, existe una tendencia creciente de utilizar polímeros naturales por las características de ser renovables, biocompatibles, biodegradables y en muchos casos económicamente viables en aplicaciones varias. En particular los almidones provenientes de diferentes fuentes han sido empleados para elaborar recubrimientos para alimentos. Sin embargo requieren de la adición de plastificantes para reducir la rigidez y tendencia al agrietado. Una práctica común es la incorporación de glicerol, alcohol polivinílico (PVA) o combinaciones de ellos. La plastificación por glicerol es temporaria y puede migrar hacia el alimento. El PVA, por su parte, es un polímero de amplio uso en la industria por ser no-tóxico, soluble en agua, biocompatible y biodegradable, con resistencia química y alta flexibilidad, así como buenas propiedades de barrera para el oxígeno y los aromas. Sin embargo, la plastificación empleando PVA como único plastificante requiere de la incorporación de cantidades importantes, que supera en algunos casos el 50 % p/p. La incorporación de agentes específicos a la formulación de un recubrimiento o envase modifica la funcionalidad transformándolo en película activa o en envase activo, ampliando su condición de “extender la vida útil del producto” a “mejorar la seguridad y propiedades sensoriales del producto manteniendo su calidad”. Por otra parte, la compleja composición de los quesos y las condiciones ambientales durante el procesamiento y almacenamiento, promueven el desarrollo de mohos y bacterias en la superficie, reduciendo considerablemente la alidad de los mismos, y conformando un riesgo para la salud por la potencial generación de toxinas que pueden migrar a la masa del queso. En este trabajo de investigación se propuso el reemplazo de parte del PVA por un poliuretano de muy baja temperatura de transición vítrea, de tal manera que pudiera actuar como plastificante en pequeñas cantidades o proporciones, logrando películas conteniendo como mínimo 70 % p/p de almidón. Posteriormente las formulaciones fueron adicionadas con antioxidantes y antimicrobianos y se evaluaron las propiedades físico-químicas, mecánicas y de superficie de las películas comparadas con películas sin aditivar. En particular se evaluó la actividad antimicrobiana en placa frente a cultivos específicos aislados de la superficie de quesos en salas de maduración y se realizaron ensayos del desempeño en sistemas reales. Las películas conteniendo poliuretano presentaron una mejora en sus propiedades mecánicas y de permeabilidad al vapor de agua, y cuando se les adicionó natamicina como agente antifúngico resultaron eficientes para proteger la superficie de quesos frente a la contaminación externa durante la etapa de maduración.

Hidalgo, R. (2018). Desarrollo de membranas difusivas para el control de metabolitos en un hígado bio-artificial. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina : Universidad Nacional de Quilmes.

La demanda enzimática en actividades de la industria química, alimenticia, textil, farmacéutica, etc. genera la necesidad de desarrollar técnicas de obtención y purificación de biocatalizadores que sean económicas, rápidas, que no dañen el medio ambiente y otorguen beneficios sostenidos a largo plazo. Estos diseños deberían permitir el uso de productos de desecho, materias primas renovables o materiales que puedan ser reciclados. En biotecnología se emplean microorganismos presentes en la naturaleza en fermentaciones, panificación, fabricación de bebidas alcohólicas, quesos, etc. o a través de la ingeniería genética se producen microorganismos modificados para la producción de proteínas con importantes rendimiento y eficiencia. Esto hace que la tecnología enzimática se encuentre fuertemente ligada a los progresos en el desarrollo de biorreactores para fermentación a gran escala y cultivos celulares. En el presente trabajo se diseñaron dos metodologías de concentración y purificación de la enzima alfa-amilasa: precipitación con polielectrolitos (PEs) y reparto en sistemas bifásicos acuosos (SBAs), con el fin de evaluar su posible aplicación a partir de diversas fuentes naturales de la alfa-amilasa, como lo son el páncreas bovino y el hongo filamentoso Aspergillus oryzae. Como fuente de polisacáridos para los cultivos del microorganismo se trabajó en el aprovechamiento de desperdicios generados por la industria agrícola, contribuyendo a la reducción y tratamiento de grandes cantidades de desechos que se acumulan y muchas veces son una fuente valiosa de productos de importancia industrial. La enzima alfa-amilasa es una glicoproteína que hidroliza los enlaces internos 1,4) del almidón. Tradicionalmente fue utilizada en la industria alimenticia, en el procesamiento de alimentos, en la fabricación de cerveza, etc. y actualmente su espectro de aplicación se ha ampliado a la industria de productos químicos como detergentes, jabones, textiles, papel y productos farmacéuticos. Este es el motivo del interés en el desarrollo de tecnologías limpias, sencillas, rápidas y de bajos costos para la producción, recuperación, concentración y purificación de alfa-amilasa. La primera metodología ensayada en este trabajo emplea polímeros de cadena flexible con carga eléctrica neta, llamados polielectrolitos. Estos tienen la capacidad de formar complejos con las proteínas los cuales pueden ser insolubilizados de manera reversible en función de diversas variables experimentales y condiciones del medio (peso molecular, densidad de carga y concentración del PE, pH, fuerza iónica, etc.). Así, los complejos pueden volverse insolubles y separarse del resto del medio por simple decantación. Para que el proceso sea efectivo debe lograrse que la proteína pueda ser recuperada del complejo insoluble, lo cual demanda hallar las condiciones para que el complejo se disocie, recuperando la proteína con su actividad catalítica conservada, y reciclar el PE para un nuevo proceso bioseparativo. Se emplearon como polielectrolitos, poliacrilatos de sodio de diferentes pesos moleculares promedio. La segunda metodología se basa en el principio de reparto de macromoléculas en SBAs formados por un polímero de cadena flexible (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares promedio) y una sal (fosfato de potasio). Estos sistemas forman espontáneamente dos fases inmiscibles por encima de una concentración crítica de sus componentes: una fase enriquecida en el polímero y la otra en la sal. Macromoléculas tales como proteínas se repartirán entre las fases de estos sistemas de acuerdo a un coeficiente de reparto (Kr) que es el cociente entre las concentraciones de dicha macromolécula entre las fases superior e inferior del SBA y depende de variables inherentes al sistema, de factores del medio y de las características de la molécula que se reparte. De esta forma, para aislar una molécula desde una muestra compleja se deberán hallar las condiciones para que la misma se reparta de manera mayoritaria hacia una de las fases y los contaminantes hacia la fase contraria. Ambas metodologías son sencillas, rápidas, económicas, no requieren de instrumental complicado, son aplicables a gran escala y utilizan polímeros de bajo costo que pueden ser reciclados para un subsiguiente paso separativo. En este trabajo se abordó el estudio de los factores que afectan a dichas metodologías, así como también la naturaleza de las interacciones en las que participa la enzima y los efectos en su integridad funcional y estructural. Para la metodología de precipitación con poliacrilato, en primer lugar se obtuvieron los diagramas de fase para los complejos formados con alfa-amilasa, los cuales permitieron evaluar el rango de pH y concentraciones dentro de los cuales los complejos son solubles o insolubles y seleccionar los pHs óptimos para la precipitación y redisolución de los complejos. Tratándose de polielectrolitos aniónicos, el pH de mayor interacción entre los componentes resultó ser ácido (cercano a 3,00) y por encima de 6,00 se redisolvieron por completo, con una cinética rápida que también fue determinada. Los ensayos de calorimetría de titulación isotérmica evidenciaron una interacción con efectos exotérmicos y de naturaleza mixta, que no es afectada en forma importante por un aumento en la fuerza iónica del medio, mostraron gran afinidad entre los componentes y una estequiometría que sugiere que un gran número de moléculas de enzima se unen por molécula de polímero. Su estabilidad catalítica tampoco se vio disminuida ante la presencia de los polielectrolitos dentro de su rango óptimo de pH, pero sí aumentó a pH ácido revelando cierto efecto protector de los poliacrilatos en el proceso de inactivación ácida de la enzima. Este mismo efecto protector a pHs ácidos se observó a nivel de la estructura secundaria de la proteína por espectroscopía de dicroísmo circular. Esto nos permitió verificar que el mecanismo molecular de inactivación ácida está asociado con la pérdida de estructuración de la enzima y el efecto protector de los poliacrilatos estaría vinculado con los niveles de estructuración secundaria de la misma. La estructura secundaria o terciaria de la enzima no se vio significativamente afectada ante la interacción con cantidades crecientes de los polímeros, tal como lo demuestran los estudios de espectroscopía de fluorescencia, dicroísmo circular y UV-visible. La estabilidad térmica de la enzima, analizada por calorimetría diferencial de barrido, tampoco se vio modificada de manera sustancial en presencia de los polielectrolitos, evidenciándose un modelo de desnaturalización térmica con dos transiciones (correspondientes a dominios independientes de la enzima) y de carácter parcialmente reversible. Finalmente, la precipitación de la enzima comercial (de origen Aspergillus oryzae) con los poliacrilatos arrojó rendimientos elevados, con resultados promisorios para la implementación de esta técnica sobre extractos naturales. El reparto de la alfa-amilasa fue estudiado en SBAs con polietilenglicoles (PEGs) de distintos pesos moleculares (2.000, 3.350. 6.000 y 8.000), a pH 7,00, cuatro composiciones de fases diferentes y relaciones de volúmenes de fase unitarias. Luego de alcanzado el equilibrio de reparto, la enzima se concentró mayoritariamente en la fase inferior enriquecida en sal, excepto para los sistemas formados con PEG 2.000 donde se repartió principalmente hacia la fase polimérica. Al aumentar la masa molar del PEG el equilibrio se desplazó mayoritariamente hacia la fase inferior, indicando que el volumen excluido por el polímero podría ser un factor influyente y determinante en el comportamiento de reparto en estos sistemas. El agregado de una sal inerte a los SBAs no mejoró los resultados de reparto, mientras que el aumento en la relación de volúmenes entre las fases resultó favorable para el sistema con el PEG de menor peso molecular y desfavorable para el PEG de mayor peso molecular. Las funciones termodinámicas del proceso de reparto indicaron que, en general, el pasaje de la enzima desde la fase rica en sal a la fase rica en PEG es un proceso exotérmico que produce ordenamiento del estado final, lo cual indicaría que el proceso está conducido entálpicamente. Además, el efecto de compensación entrópico-entálpico observado también es indicio de que el agua juega un rol importante en el mecanismo de partición. Resulta de interés destacar que, a pesar de que el pasaje de la enzima de la fase inferior a la superior es un proceso principalmente exotérmico, la interacción alfa-amilasa/PEG 2.000 (analizada por calorimetría de titulación isotérmica) es de naturaleza endotérmica y de afinidad débil. Los ensayos espectroscópicos de fluorescencia y dicroísmo circular, realizados para evaluar el estado conformacional de la enzima, mostraron que las fases superiores lo afectan de manera poco significativa, mientras que las inferiores producen consecuencias algo más marcadas. Lo mismo se observó para la actividad catalítica de la enzima la cual resultó, en líneas generales, más afectada en las fases inferiores respecto de las superiores. La estabilidad térmica de la enzima no se vio alterada de manera relevante ante la presencia de PEG, según demuestran los ensayos de calorimetría diferencial de barrido. Al aplicar los resultados obtenidos con la enzima comercial, de origen fúngico, sobre el páncreas bovino se observó que para algunos SBAs ensayados el reparto difiere entre ambas fuentes en su comportamiento y los resultados de purificación no fueron satisfactorios. Otros SBAs, en cambio, permitieron obtener elevados rendimientos con escasa purificación. La precipitación con poliacrilato también arrojó rendimientos porcentuales elevados aunque un bajo factor de purificación. Esto sugiere que estas técnicas podrían ser eficaces para concentrar la enzima pancreática pero no para purificarla. Al trabajar sobre cultivos de Aspergillus oryzae, los resultados del reparto en todos los SBAs ensayados siguieron la misma tendencia que la alfa-amilasa comercial mostrando que algunos sistemas no son eficientes en la purificación de la proteína, pero sí lo son en cuanto a la posibilidad de concentrarla. La precipitación con poliacrilatos arrojó resultados promisorios, tanto en referencia a la purificación como rendimiento total del proceso, ya que se produce poca pérdida enzimática con factores de purificación que son coherentes con los bajos niveles de contaminantes que están presentes en estos cultivos. En conclusión, podríamos decir que estas metodologías son eficaces como primer paso extractivo de concentración durante un proceso de purificación de alfa-amilasa. La precipitación con poliacrilato también puede presentarse como técnica de purificación primaria, evaluándose la necesidad de implementar metodologías más específicas de acuerdo a los requerimientos de pureza del producto final. El empleo de materiales de desecho como fuente natural de alfa-amilasa (páncreas bovino) o de almidón para los cultivos de Aspergillus oryzae (desechos del procesamiento del trigo) aporta un valor extra a estos resultados tanto desde el punto de vista económico (ya que se trata de productos de partida con escaso valor comercial) pero también medioambiental, ya que contribuye a disminuir las grandes cantidades de subproductos o residuos que se generan en la industria ganadera y agrícola.

Las investigaciones realizadas en este trabajo se centraron en el estudio de los procesos de degradación de triacilglicéridos y proteínas en aglutinantes como aceites vegetales, huevo y cola animal aplicados sobre portaobjetos de vidrio y en contacto con yeso empleado como soporte en la pintura mural andina. Se determinó además la influencia en estas reacciones de mezclas pigmentarias conteniendo índigo. Se trabajó con réplicas pictóricas envejecidas naturalmente en condiciones del laboratorio así como por envejecimiento acelerado por irradiación con luz UV, preparadas según manuales y tratados de la época sobre técnicas empleadas en la elaboración de pintura mural. La primera parte del trabajo comprendió el análisis de muestras extraídas de réplicas pictóricas por FTIR-ATR, mediante el análisis de las derivadas segundas de los espectros, lo cual permitió identificar bandas características de cada aglutinante y visualizar mejor los cambios producidos por el envejecimiento de las muestras. Los extractos lipídicos de las réplicas pictóricas conteniendo aceites vegetales y huevo se analizaron por CG-FID y CG-EM. Se identificaron ácidos dicarboxílicos originados en reacciones de polimerización y oxidación de ácidos grasos insaturados. La formación de estos productos de oxidación fue mayor en réplicas preparadas sobre soporte de vidrio, sugiriendo una mayor estabilidad de los aglutinantes aplicados sobre yeso como base de preparación. Los aglutinantes proteicos mostraron mayor estabilidad que los lipídicos y las composiciones en aminoácidos no presentaron mayores variaciones en función del soporte. Los resultados obtenidos por FTIR ATR y CG-FID fueron analizados aplicando modelos estadísticos multivariados, permitiendo una mejor interpretación de los datos. En la segunda parte del trabajo se presentan los resultados obtenidos en la caracterización de aglutinantes orgánicos en pinturas murales sobre yeso de dos iglesias del siglo XVIII del área andina aplicando las técnicas analíticas y las metodologías optimizadas con las muestras de referencias. Se identificó la presencia de aceite vegetal y huevo como aglutinante de los pigmentos, característico de una pintura al temple, y el uso de una cola animal como imprimación de la base de preparación de yeso. La identificación de proteínas características de huevo y colágeno de la cola animal fue confirmada por MALDI-TOF. Estos resultados adquirieron relevancia al contrastarse con información suministrada por historiadores y restauradores de arte, constituyendo el primer estudio químico sobre la técnica pictórica en pintura mural andina.

En el presente trabajo de tesis doctoral se desarrollaron estrategias analíticas modernas,novedosas, sensibles y confiables que permitieron la cuantificación de sustancias prohibidas y/o restringidas para su aplicación al control de calidad en productos de cuidado personal(PCP).Millones de personas en el mundo utilizan diariamente los PCP, estando por lo tanto sometidos a una significativa y relativamente incontrolada exposición a los componentes de estos productos. Debido a este motivo, su seguridad debe ser evaluada exhaustivamente antes de su comercialización.Entre los ingredientes que componen los PCPs se encuentran los conservantes, estando los que se utilizan habitualmente, seriamente cuestionados como desencadenantes de reacciones adversas. Debido a que muchos de estos productos se aplican varias veces al día y quedan deforma permanente en la piel. La industria cosmética ha tratado de disminuir e inclusive eliminar el uso de algunos conservantes. Tal es el caso de los parabenos (PA).Considerando la naturaleza compleja de estos productos se advierte la necesidad de desarrollar procedimientos de tratamiento de muestra que faciliten la determinación desustancias prohibidas, restringidas y activas. El objetivo del presente trabajo de tesis se basó en la síntesis de polímeros de impresión molecular (MIPs) utilizados para el desarrollo y optimización de metodologías de pre tratamiento de muestra y posteriormente se acoplaron a técnicas separativas y electroanalíticas para la determinación de PAs en PCPs.Los MIPs son materiales sintéticos con sitios de reconocimiento generados artificialmente capaces de capturar específicamente un analito dado o un grupo de especies relacionadas estructuralmente.  El uso de MIPs como materiales adsorbentes selectivos es de especial interés cuando la muestra es compleja y la presencia de interferencias podría dificultar la cuantificación final a través de técnicas separativas acopladas a detectores comunes.La utilización de los polímeros en combinación con técnicas separativas modernas, permitió que se conjuguen la alta especificidad de los MIPs y su potencialidad de preconcentración con la robustez y el elevado poder de resolución de la Cromatografía Líquida de Alta Resolución(HPLC).Una vez evaluadas las características de los MIPs para su uso como sorbente de extracción en fase sólida, y dada la versatilidad que demostró el polímero, se decidió profundizar la investigación sobre su aplicación para otros usos analíticos. Es así que se modificó la superficie de un sensor electroquímico mediante la deposición de una película de siloxano con impresión molecular (MIS).Con el fin de mejorar la sensibilidad y estabilidad del sensor, se electrodepositaron nanopartículas de oro (AuNPs) sobre la superficie de un electrodo de trabajo de carbonovítreo, para luego sintetizar vía sol-gel sobre las mismas un MIS. El objetivo del uso de lasAuNPs radicó en aumentar el área superficial, mejorar la capacidad de adsorción, para luegoacoplar el MIS. La combinación de AuNPs con la técnica sol-gel ofreció una alternativa interesante a las técnicas establecidas que permitió mejorar la sensibilidad y la estabilidad del sensor impreso. Esto permite considerar a los MIPs para futuras investigaciones en el área electroquímica y aprovechar de esta manera sus consiguientes ventajas de sensibilidad y selectividad.

En el presente trabajo de tesis se abordó el estudio del aislamiento, a partir de sus fuentes naturales, de dos fitoproteasas de aplicación industrial: bromelina (BR) y papaína (PAP). Para ello se propuso combinar dos estrategias bioseparativas de bajo impacto: el reparto de afinidad en sistemas bifásicos acuosos (SBAs) formados por polietilenglicol y citrato de sodio (PEG/NaCit), empleando alginato como macroligando, seguido de la precipitación de afinidad, metodología que aprovecha la capacidad del alginato de gelificar reversiblemente en presencia de iones calcio. Ambas metodologías comparten ciertas ventajas: son sencillas, rápidas, económicas, escalables y no requieren de instrumental sofisticado. Como punto de partida del desarrollo bioseparativo propuesto, se estudiaron las interacciones entre las enzimas de interés y los polímeros de fase (polietilenglicoles) y de afinidad (alginato) a fin de lograr la identificación y caracterización de las posibles fuerzas intermoleculares involucradas. Mediante la aplicación de técnicas basadas en propiedades espectroscópicas, hidrodinámicas y calorimétricas, fue posible inferir una diferenciación de los polímeros utilizados, agrupándolos en dos clases según sus comportamientos frente a las proteasas: i) los de mayor peso molecular (PEG2000, PEG4600 y PEG8000) y ii) los de menor peso molecular (PEG600 y PEG1000) y el alginato de sodio. Con respecto a los primeros, los efectos observados indicaron que los mencionados PEGs se excluyen preferencialmente de la superficie proteica por un mecanismo de tipo estérico, no afectándose significativamente el contenido de estructura secundaria de las fitoproteasas. Por su parte, los PEGs más pequeños y el alginato ocasionaron alteraciones que evidenciaron su unión preferencial a las fitoproteasas. En el caso del alginato, las perturbaciones fueron más marcadas, sugiriendo la existencia de interacciones fuertes y específicas entre este polímero y las proteínas. El estudio del reparto de BR y PAP comerciales en los diferentes sistemas PEG/NaCit mostró un desplazamiento del equilibrio de reparto de ambas proteasas hacia la fase salina a medida que aumentaba el tamaño del polímero empleado. A pesar de que ambas enzimas presentan características fisicoquímicas semejantes (peso molecular, punto isoeléctrico, etc.) sus perfiles de reparto reflejaron comportamientos disímiles, evidenciando BR una mayor tendencia que PAP a distribuirse hacia la fase rica en PEG. Esta conducta también fue observada cuando se ensayó el reparto de las fitoproteasas presentes en el extracto de tallo de ananá y en el látex de papaya. En dicho caso, el análisis del proceso separativo/extractivo de BR, mostró a los SBAs formados por PEG2000, PEG4600 y PEG8000 como los de mejor performance, ya que permitieron recuperar mayoritariamente a la enzima en fase salina, con rendimientos cercanos al 90% y factores de purificación de 2,0-2,5, indicadores que pueden considerarse aceptables para una primera etapa de recuperación de la enzima. Cuando se trabajó con el látex de papaya, los resultados fueron poco satisfactorios ya que, si bien todos los sistemas permitieron recuperar la PAP en forma significativa en la fase inferior con rendimientos mayores al 60%, los valores del factor de purificación apenas superaron la unidad. Excepcionalmente, el sistema formado por PEG8000 demostró una buena capacidad de purificación (FP 2,50) en la fase polimérica pero con bajo rendimiento (20%). Como estrategia posible para mejorar el desempeño del proceso extractivo, se evaluó la inclusión de alginato como ligando de afinidad en los SBAs. Este polímero se repartió mayoritariamente hacia la fase superior, rica en PEG, y su presencia, en concentraciones adecuadas (0,1-0,3 %P/P), direccionó a BR y PAP hacia dicha fase, mejorando considerablemente los rendimientos. Estos resultados, junto con la determinación de las condiciones óptimas de formación de los geles de alginato y su redisolución, permitieron diseñar una estrategia integrada (reparto + precipitación de afinidad) para recuperar las fitoproteasas a partir de sus respectivas fuentes naturales. Su aplicación sobre el extracto de tallo de ananá mostró indicadores de desempeño adecuados en términos de rendimiento de BR (79,3%), pero no así en purificación (1,51). Sin embargo, para el procesamiento del látex se pudo recuperar el 72% de PAP y purificarla 2,41 veces, siendo esta performance sensiblemente mejor que aquella lograda en la extracción líquido-líquido con SBAs sin alginato. Como conclusión final, se puede afirmar que la metodología integradora propuesta resultó eficaz como primer paso extractivo para la recuperación de PAP a partir de látex de Carica papaya, no sólo por sus indicadores, sino por las ventajas de esta metodología en términos de simplicidad y sustentabilidad. En el caso de la extracción de BR a partir de tallo de ananá se halló más conveniente la extracción empleando SBAs PEG/NaCit sin alginato.

En la actualidad, el trasplante hepático representa la solución terapéutica predilecta en pacientes con falla hepática terminal. El constante aumento en la demanda de órganos para trasplante ha dado inicio a la expansión del criterio de selección de potenciales donantes, incluyendo a los órganos provenientes de donantes a corazón no batiente. Los mismos presentan alto riesgo de disfunción primaria como consecuencia del tiempo variable de isquemia normotérmica que atraviesan antes de la procuración. En los últimos años se ha reflotado la técnica de preservación por perfusión hipotérmica y actualmente se encuentran registros en innumerables artículos de resultados prometedores con órganos marginales. En la clínica son muy pocos los centros que la aplican para la preservación de hígados.En la presente tesis se empleó un modelo de donante a corazón parado en ratas de laboratorio, utilizando la máquina de perfusión hipotérmica y una solución de preservación desarrollada en nuestro laboratorio. Este procedimiento se asoció con una mejora en la mayoría de los parámetros evaluados durante la reperfusión in vitro y en el trasplante heterotópico (resistencia intrahepática, producción biliar, consumo de O2, liberación de enzimas al perfusato, etc), cuando se comparó con los resultados obtenidos en hígados preservados con una solución comercial.

Se realizaron estudios para diferenciar isómeros de posición en compuestos aromáticos, empleando un espectrómetro de masa híbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo acoplado con distintas fuentes de ionización a presión atmosférica, en modo positivo. Se utilizaron inicialmente dos N-óxidos isómeros de hidroxipiridina comerciales, que sirvieron luego como sistema modelo para el análisis de una serie de 1- y 4- N-óxidos de pirazinas monosustituídas sintetizados. Se investigaron dos metodologías para la diferenciación. La primera metodología consideró el comportamiento disociativo, comparando la relación de intensidades entre los iones observados en los espectros de iones producto de cada isómero a diferentes energías de colisión. En la otra metodología, la formación de iones aducto a partir del empleo de soluciones de cationes metálicos por electrospray, permitió identificar especies características en los espectros de masa obtenidos para cada N-óxido isómero. Los alcances de esta metodología fueron evaluados con isómeros de dihidroxiarenos comerciales, siendo aplicable como método de detección postcolumna para una mezcla de los mismos separada por cromatografía líquida. La complementación con cálculos computacionales permitió interpretar y analizar las diferencias observadas en los espectros de masa, en términos energéticos y estructurales de los iones. Además, se pudo confirmar la correcta asignación de las estructuras calculadas para los iones aducto de uno de los compuestos estudiados por medio de espectroscopía de disociación multifotónica infrarroja. Se desarrolló una metodología alternativa para determinar la posición del grupo N-óxido en pirazinas sustituídas, empleando espectroscopía de resonancia magnética nuclear de carbono-13, a través del cálculo de un índice derivado del análisis quimiométrico de los datos.

El género Glandularia (familia de las Verbenáceas), está integrado por especies de ornamentales nativas con potencial para ser empleado en canteros, borduras e inclusive como planta en maceta. En nuestro país se destacan las especies G. incisa y G. peruviana por sus flores de color rojo intenso, su hábito erecto y rastrero, y su rusticidad. En un trabajo anterior se identificó Groundnut ringsopt virus (GRSV) infectando Glandularia. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar y optimizar metodologías para la propagación in vitro de G. incisa y G. peruviana libre de GRSV. Utilizando WPM con 0,025 mg/l de TDZ junto con 0,025 mg/l de ANA se estableció el cultivo de ápices caulinares con un 70% de regeneración en ambas especies. A través del cultivo de ápices in vitro se obtuvo un 83% de plantas libres de GRSV para G. incisa y del 33% para G. peruviana. El porcentaje más alto de liberación fue del 90% para el tratamiento de termoterapia a 38ºC-32°C durante 10 días combinada con el cultivo de ápices de G. incisa. La evaluación del material saneado fue realizada por DAS-ELISA y AC-RT-PCR. La combinación de técnicas de liberación de virus mediante cultivo in vitro y métodos sensibles de diagnóstico de las virosis son la clave para la obtención en corto tiempo de grandes volúmenes de plantas de alta calidad genética y fitosanitaria necesarias para impulsar el cultivo de Glandularia en nuestro país.