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Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

El objetivo de este trabajo de Tesis Doctoral consistió en esclarecer la problemática existente desde el punto de vista sedimentológico, composicional y estratigráfico para las sedimentitas del Grupo Río Chico (Paleoceno superior-Eoceno medio) aflorantes en la porción centro-oriental de la cuenca del Golfo San Jorge, en la provincia del Chubut. En este contexto, se propuso la utilización de diversas herramientas aplicables al análisis sedimentológico de sucesiones continentales capaces de permitir la elaboración de un modelo a través del cual sea posible explicar el origen y diferenciación de los depósitos pertenecientes al Grupo Río Chico.

En el presente trabajo de tesis se realizó la determinación estructural de compuestos liberados al medio de cultivo por formas infectantes de T. cruzi. El estudio comprendió tres aspectos: Estudio químico de los compuestos lipídicos liberados: Sólo ciertos componentes de la membrana son liberados (PC, LPC, sulfátido, IPL, ácidos grasos). Es significativa la ausencia de PE ya que es un componente importante de la membrana. Por otra parte, algunos de los compuestos liberados presentan diferencias estructurales con los análogos del parásito, principalmente en los ácidos grasos componentes. La segunda parte abarcó el estudio estructural del ancla glicolipídica de la trans-sialidasa: se caracterizó una estructura de glicoinositolfosfolípido, formada mayoritariamente por ceramida en las formas trypomastigote metacíclicas y ceramida y alquilglicerol en relación 3:1 en las formas trypomastigote. La fracción oligosacarídica contiene una unidad de α-galactosa caracterizada por primera vez como componente de anclas en Trypanosoma cruzi. El tercer aspecto consistió en un estudio estructural de la cadena N-glicosidica de Tc-85 liberada al medio: el análisis por HPAE-PAD permitió determinar tres cadenas de menor longitud que las presentes en el oligosacárido de la proteína aislada de parásitos. Las cadenas difieren en el monosacárido presente en el extremo no reductor.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) -- Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2003.

As-p18 es una de las proteínas más abundantes del fluido que baña a la larva infectiva, L3, dentro de los huevos, particularmente resistentes, del parásito Ascaris suum. Es una proteína que une lípidos, perteneciente al grupo de las FABPs, aunque por presentar características únicas, exclusivas para nematodos, se las asocia a un nuevo subcluster, las nemFABPs. Dentro de las peculiaridades de las nemFABPs se destacan: poseer señal de secreción, estar bajo una estricta regulación de síntesis y poseer una estructura con ciertas características no presentes en otros miembros de la superfamilia. Tomando como base estas diferencias, se ha propuesto que las nemFABPs presentarían funciones específicas, de relevancia en la supervivencia de estos organismos, tal vez involucrando la captación, la distribución y/o el almacenamiento de lípidos. Con la finalidad de contribuir al entendimiento de la estructura y función de este singular grupo de proteínas, se abordaron estudios estructurales y de dinámica, empleando la técnica de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Por otra parte, se determinaron las propiedades de unión a lípidos, haciendo uso de variadas técnicas biofísicas y bioquímicas. Por último se analizó la capacidad de As-p18 para transferir ácidos grasos a membranas modelo y se realizaron ensayos preliminares para caracterizar la interacción con las mismas. El plegamiento tridimensional determinado en solución, mostró que As-p18 presenta componentes estructurales que caracterizan a la familia de FABPs. Dentro de los mismos se encuentran: el barril β, formado por 10 hebras β antiparalelas cubierto por el motivo hélice-vuelta-hélice; la hendidura o gap entre las hebras βD y βE; una cavidad interna que incluye al sitio de unión al ligando y que involucra residuos de aminoácidos polares e hidrofóbicos; y una región portal postulada como lugar de entrada del ligando, delimitada por los loops entre βC-βD y βE-βF, y la α-hélice II. Sin embargo, a pesar de presentar un plegamiento FABP canónico, As-p18 mostró características que la diferencian de cualquier estructura de FABP descrita hasta el presente. Los loops entre las hebras βB y βC, y βG y βH, son notablemente más largos que los presentes en cualquier otra FABP, llegando al doble de longitud para el primer caso. En cuanto a los residuos que estabilizan la unión del ligando, se comprobó la participación de la Arginina 43, que dada su ubicación relativa en la proteína, representa un elemento atípico respecto a lo observado para otras FABPs. Aminoácidos hidrofóbicos protruyentes, que flanquean la región portal, estarían potencialmente involucrados en interacciones proteína-proteína o proteína-membrana. Los estudios de unión a lípidos mediante TLC y cromatografía gaseosa mostraron que la proteína recombinante une de manera exclusiva ácidos grasos (AGs) dentro de un entorno lipídico celular como el provisto por E. coli. Entre los AGs seleccionados del medio por la proteína, se comprobó un enriquecimiento relativo de ácido oleico (18:1). La particular afinidad por este lípido se corroboró mediante experimentos de fluorescencia involucrando el desplazamiento competitivo de una sonda fluorescente. Asimismo, estudios por Calorimetría de Titulación Isotérmica (ITC) y RMN, permitieron establecer un único sitio de unión, de alta afinidad, donde la contribución entálpica fue preponderante. En cuanto a la habilidad de As-p18 para ceder AGs a vesículas o membranas modelo, se ha propuesto que la transferencia de ligandos ocurre mediante interacciones proteína-membrana. En este sentido, se analizaron de forma preliminar qué factores modulan dicha interacción. En resumen, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuirían a la comprensión del rol de As-p18 en los huevos infectivos de A. suum. De manera más general, constituyen el paso inicial para el mejor entendimiento del nuevo subcluster, nemFABP, dentro de la familia de las FABPs.

Se llevó a cabo un estudio estructural y de reactividad de compuestos organolíticos. Resultados basados en espectroscopía RMN-13C, intercambio isotópico y reacciones de carbonilación permitieron determinar que amiduros de litio cíclicos, como morfolil-litio y piperidil-litio, forman, en solución, agregados mixtos con moléculas de amina. Además, por difracción de rayos X se pudo confirmar, en el caso del piperidil-litio, la presencia de piperidina en la estructura cristalina: este amiduro de litio forma un agregado mixto [(amina)4.(amiduro)4], siendo el primero de este tipo descripto en la literatura. El análisis de los resultados obtenidos en la carbonilación en diferentes condiciones experimentales, permitió el desarrollo de una metodología con amplios alcances sintéticos y la postulación de los mecanismos de reacción de amiduros de litio con monóxido de carbono. El primer intermediario postulado, carbamoilo, es un anión acilo altamente reactivo que, usualmente, lleva a sistemas complejos. Se estudió entonces la reacción entre amiduros de litio y formamidas sustituidas mediante cromatografia gaseosa y Resonancia Magnética Nuclear. El equilibrio establecido ayudó a explicar la dependencia con las condiciones de reacción, por ejemplo, la naturaleza del amiduro. En el caso del morfolil-litio se logró identificar un intermediario monolitiado, el dimorfolinmetóxido de litio. Un aducto como éste, que puede considerarse como un aducto entre una molécula de amida y un amiduro de litio, no se habia encontrado anteriormente. Por otro lado, la reacción entre diciclohexilamiduro de litio y alquilformamidas produce principalmente un intermediario dilitiado en el que un carbono está unido a N, O, Li y un carbono carbonílico, siendo también la primera vez que se describe una entidad de este tipo. Estas investigaciones fueron de gran significancia para mayor conocimiento de la naturaleza de intermediarios y mecanismos de reacción que involucran reactivos organolíticos y para su aplicación en síntesis orgánica. Por otro lado, se investigó la reactividad de derivados litiados de heterociclos aromáticos frente a distintos electrófilos. Por reacción de 2-furil-litio, 5-metil-2-furil-litio y 2-litio-tiofeno con halogenuros orgánicos se logró sintetizar, en forma rápida y sencilla, furanos y tiofenos α sustituidos. La carbonilación de estos reactivos resultó de gran interés, ya que dio lugar a la formación de compuestos carbonílicos complejos. Además, la reacción se llevó a cabo en diversas condiciones estudiándose el mecanismo de la misma.

Es bien conocido que el estudio de la composición química y de las características estructurales de los componentes inorgánicos presentes en las fases bio-mineralizadas es sumamente complejo y es, aún hoy, movo de grandes controversias. También en éste, como en otros campos de la Química Bio-inorgánica, el estudio de "modelos" puede aportar valiosa e importante información que gradualmente ayude a comprender mejor y más acabadamente muchos de los procesos que ocurren a nivel celular y sus consecuencias químicas y biológicas. Teniendo en cuenta que la fase inorgánica presente en los tejidos duros de mamíferos está estructuralmente relacionada a las apatitas, en este estudio se han realizado una serie de trabajos tendientes a obtener un mejor conocimiento acerca de diversos procesos sustitucionales que pueden ocurrir en huesos y dientes, utilizando como "modelos" algunas redes apatíticas sintéticas. La idea central del trabajo fue la de aplicar, en forma conjunta, técnicas de difracción de rayos X y de espectroscopia vibracional a efectos de conocer en forma detallada las consecuencias que los procesos estudiados tienen sobre las propiedades estructurales y sobre las características de enlace de los sistemas-modelo.

En algunos trabajos recientes, así como en algunas de las últimas Tesis Doctorales desarrolladas en el CEQUINOR se comenzaron a explorar diversos aspectos de la química estructural y de las propiedades generales relacionadas con este tipo de materiales y fases íntimamente relacionadas con ellos. En el presente trabajo de Tesis se estudiaron diversos aspectos de este campo, los que se comentan brevemente: En la primera parte del trabajo, luego de una introducción general acerca de la superconductividad de alta temperatura crítica en sistemas oxídicos, se describe el estudio de una serie de sistemas relacionados al YSr2Cu3O7. Como es sabido, este material sólo puede obtenerse en condiciones de alta presión y presenta una Te cercana a los 60 K. Sin embargo, se ha demostrado que es posible generar y estabilizar diversas fases relacionadas con el mismo en condiciones normales de síntesis, realizando diversos procesos sustitucionales en su red básica. No todos estos nuevos materiales resultan ser superconductores, pero su estudio es considerado como de central importancia para avanzar en la mejor comprensión del fenómeno en este nuevo tipo de materiales.Los sistemas estudiados en esta parte del trabajo incluyen la sustitución de una parte del cobre del YSr2Cu307 por varios cationes tri- y tetra-valentes derivados de elementos representativos y de transición, por cationes de carga elevada, tales como Mo(VI), W(VI) y Re(VI) y por oxoaniones tetraédricos como sulfato, fosfato y vanadato . Concretamente, estos sistemas en los que los dopantes son capaces de mantener estabilizada la red 123 del YSrCu, fueron investigados desde el punto de vista de su comportamiento estructural y espectroscópico-vibracional. La segunda parte de la Tesis está centrada, esencialmente, en el estudio espectroscópico-vibracional de una amplia serie de materiales de composición general Ln2BaMn05 los que en el caso de M = Cu constituyen las llamadas "fases verdes", una de las impurezas que más habitualmente se generan durante la síntesis de los nuevos óxidos superconductores de alta Te, del tipo YBaCuO. En este caso, se estudiaron las familias de materiales asociados con todos los cationes lantánidos trivalentes y el Y(III) y con M = Cu,Zn, Ni, Co y, para algunos lantánidos, también con M = Pd y Pt . Los compuestos mencionados pertenecen a distintos tipos estructurales y, en varios casos, se logró establecer la existencia de dimorfismo en algunos de los materiales preparados (Tm2BaCu05, Cap. 2.3. y materiales con M = Co,). En la tercera y última parte del trabajo se estudia en detalle el comportamiento estructural y espectroscópico de una serie de materiales oxídicos que pueden resultar útiles como sustratos para películas, gruesas o delgadas, de cerámicos superconductores. Luego de analizar en detalle las características que deben reunir este tipo de compuestos para cumplir adecuadamente con esa función, se estudian tres grupos de óxidos mixtos: perovskitas de composición A2BB'C>6, con metales alcalino tórreos en la posición A y una gran variedad de cationes, con diferentes combinaciones de cargas, en los sitios B y B' (Cap. 3.1.); sistemas pertenecientes al tipo estructural del K2NiF4 y derivados y, finalmente, una serie de óxidos mixtos pertenecientes a otros tipos estructurales . La Tesis se cierra con la presentación de una serie de conclusiones generales, en las que se presenta un breve resumen de los sistemas estudiados y de los principales resultados obtenidos, concluyendo con el listado de los trabajos originales a que dieron lugar estos estudios.

En el presente trabajo se buscó ampliar el conocimiento acerca de la biología reproductiva de los gasterópodos, estudiando las proteínas del perivitelo de dos especies de Ampullariidae: Pomacea canaliculata (Lamarck, 1822) y Pomacea scalaris (d’Orbigny, 1835). Los ampuláridos son gasterópodos dulceacuícolas de América, Islas del Caribe, África y Asia, alcanzando su mayor diversidad de especies en América del Sur; en nuestro país son integrantes característicos de la malacofauna continental. Esta familia presenta dos tipos de desoves: algunas especies desovan dentro del agua, adhiriendo masas gelatinosas de huevos a macrófitas u otros sustratos sumergidos. En la otra estrategia los desoves son realizados frecuentemente varios centímetros por encima del nivel del agua y los huevos se depositan en masas presentando una cáscara calcárea. La mayoría de estos huevos aéreos presentan una coloración muy llamativa y registran muy pocos casos de depredación en condiciones naturales. Al menos en una especie, Pomacea paludosa (Say, 1829), esta coloración se ha vinculado con la no palatabilidad de los huevos, y se ha sugerido que sería una coloración de advertencia (coloración aposemática). La estrategia de oviposición aérea parece ser una sinapomorfía de las especies más derivadas de Ampullariidae, principalmente del llamado “grupo Pomacea”; las especies del Viejo Mundo y los grupos basales del Nuevo Mundo en cambio, retienen la oviposición dentro del agua o cerca de su superficie. Esta nueva estrategia de oviposición aérea podría representar un hecho clave en la evolución reciente de los Ampullariidae, cuyo carácter ventajoso desde el punto de vista selectivo queda puesto de manifiesto por el hecho de que los grupos derivados son los que incluyen mayor número de especies y exhiben una mayor distribución geográfica. Este cambio en la estrategia reproductiva fue acompañado de cambios anatómicos y fisiológicos en los adultos que les permitieron salir fuera del agua durante el desove, pero también debe haber incluido cambios drásticos en la bioquímica de los huevos para soportar las condiciones de insolación, desecación y depredadores permitiendo así el desarrollo embrionario fuera del agua. Este tipo de adaptaciones bioquímicas han sido muy poco estudiadas. Los huevos en esta familia, como en la mayoría de los gasterópodos, presentan un limitado contenido de vitelo, cuyas funciones son provistas por una envoltura secretada por la glándula del albumen de la hembra denominada fluido perivitelino (FPV) compuesto principalmente por polisacáridos y proteínas. Las proteínas del FPV, denominadas perivitelinas, eran consideradas tradicionalmente como reserva nutricia para el embrión, representando una fuente de aminoácidos que servirían eventualmente para sintetizar proteínas o como fuentes de energía. A medida que se ha avanzado en el conocimiento de las perivitelinas en un mayor número de especies, se ha encontrado que estas presentan múltiples funciones. Esto es, cumplen funciones biológicas específicas durante el desarrollo, antes de ser finalmente consumidas por el embrión. Las pocas perivitelinas que han sido estudiadas presentan funciones asociadas a factores de crecimiento, actividad antimicrobiana y actividad inhibitoria de proteasas. La especie cuyas perivitelinas han sido más ampliamente estudiadas es P. canaliculata, una especie de estrategia de oviposición aérea. La principal perivitelina en esta especie es la ovorubina (OR), una glicoproteína cuyo principal cofactor es el carotenoide astaxantina. Dentro de las funciones adicionales a su rol nutricio, la OR cumple las funciones de transportar y estabilizar las moléculas antioxidantes que serán utilizadas por el embrión, de otorgar coloración al huevo, que como dijimos sería una alarma aposemática, y al mismo tiempo de fotoproteger al embrión en sus primeras etapas de desarrollo. También se ha demostrado que la OR tiene la capacidad de inhibir serínproteasas, y dado que algunas de las proteasas inhibidas son de origen bacteriano y fúngico, se interpretó que esta perivitelina cumpliría una función antimicrobiana en el huevo, aunque esto no fue nunca demostrado. En el presente trabajo, se estudió el FPV de otra especie con la misma estrategia de oviposición, P. scalaris, ya que se desconocían las perivitelinas en otras especies de esta familia. También se avanzó en la caracterización estructural y funcional de la OR de P. canaliculata, explorando si presentaba actividad antimicrobiana, y estudiándose su estabilidad en diferentes condiciones de pH y su susceptibilidad frente a proteasas.

El presente trabajo de tesis doctoral se basa en la síntesis, caracterización y determinación de las actividades biológicas de distintos complejos de coordinación. Por un lado se estudió la familia de los sartanes, principalmente candesartán, telmisartán e irbesartán y sus complejos de coordinación con cobre(II). Mientras que por otro lado se estudió un complejo del flavonoide naringenina con el catión óxidovanadio(IV) y complejos de zinc(II) con el ácido 3-cumarín carboxílico. Las caracterizaciones se realizaron por métodos espectrofotométricos, entre los que se destacan UV-visible, FTIR, Raman, EPR. Dentro de las actividades biológicas estudiadas se realizó la evaluación de la capacidad antioxidante frente a diferentes radicales como DPPH., ABTS.+, ROO., OH., actividad SOD símil e inhibición de la actividad de la fosfatasa alcalina. Se realizaron también estudios en sistemas celulares para evaluación de la capacidad antitumoral y antihipertensiva. Además se evaluó el efecto de todos los complejos como agentes antimicrobianos frente a distintas cepas de hongos y bacterias.