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Estudio del plegado proteico: la ß-lactamasa
Javier Santos Mario R. Ermácora
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Las propiedades biológicas de las proteínas dependen de su estructura tridimensonal (3D). Hoy sabemos que el plegado proteico permite la conversión de la información existente en la secuencia de aminoácidos en información 3D, pero no sabemos cómo se lleva adelante este proceso. Tampoco se conoce la lógica con que se distribuye la información 3D en la secuencia y no existe una opinion unificada sobre el grado de estructura presente en los estados parcialmente plegados ni sobre el papel de estos últimos en el plegado proteico. Sí existen algunas pruebas de que la información conformacional no estaria distribuida homogéneamente en la secuencia proteica. En una misma cadena polipeptídica existen fragmentos o bloques que pueden ser eliminados sin producir alteraciones en el plegado final, por lo que no formarían parte del conjunto de residuos determinantes de la estructura 3D nativa. Por el contrario, otros fragmentos aparentemente no pueden ser removidos sin abortar el proceso de plegado. En este trabajo de tesis se utilizó a la β-lactamasa de Bacillus Licheniformis. ES-βL como modelo experimental para estudiar el proceso de conversión de información 1D → 3D e investigar la existencia de módulos de información para el plegado. Se eligió a ES-βL como modelo principalmente porque a) la existencia de proteína correctamente plegada (nativa) es fácilmente detectable por actividad enzimática. aún en trazas; b) se conoce su estructura cristalográfica con gran resolución; c) no posee puentes disulfuro que compliquen adicionalmente el plegado; y d) ES-βL no es un modelo excesivamente reduccionista: posee dos dominios y una topología medianamente intrincada. Para caracterizar el modelo experimental se estudiaron aspectos generales de la estructura, el plegado, y estados intermediarios de ES-βL, tanto desde un punto de vista cinético como en el equilibrio. La estructura de formas parcialmente plegadas también se estudió a partir de experimentos de modificación química de cisteínas introducidas a tal fin en la cadena polipeptídica como sondas conformacionales. El desplegado de ES-βL inducido por urea presentó más complejidad que el desplegado por GdmCl. En el primer caso, se detectaron por lo menos cuatro estados parcialmente plegados. Inesperadamente, el reemplazo de Ser265 → Cys265 tuvo consecuencias importantes para el plegado. El efecto desestabilizador de la mutación sobre los estados parcialmente plegados indicó que el residuo formaría parte de un módulo estructurado en dichos estados. La observación de estados parcialmente plegados, curvas de desnaturalización no coincidentes, transiciones multifásicas, cores resistentes e intermediarios cinéticos es compatible con un mecanismo de ensamblado modular o plegado por partes de la β-lactamasa. Por otra parte, en este trabajo se manipuló la secuencia de la proteína para estudiar la interdependencia de los niveles jerárquicos de estructura en el proceso de plegado. Se evaluó el contenido de información para el plegado de ES-βL codificado por la hélice α C-terminal. Para estudiar el papel de esta hélice se prepararon y caracterizaron tres variantes de ES-βL acertadas, en nueve, catorce y diecinueve residuos desde el C-terminal. ES-βLͨΔ9, ES-βLͨΔ14 y ES-βLͨΔ19, respectivamente. Los lisados de bacterias expresando ES-βLͨΔ19 no presentaron actividad β-lactamasa. Por el contrario, dicha actividad sí fue detectada en lisados conteniendo tanto ES-βLͨΔ9 como ES-βLͨΔ14, demostrando de manera preliminar que una fracción de estas moléculas, puede adquirir estructura nativa. La caracterización rigurosa de ES-βLͨΔ9 permitió demostrar que la secuencia de residuos eliminada tiene un rol en el mecanismo de plegado pero que su ausencia no impide la formación de estructura 3D nativa. También se caracterizó en detalle Ip ES-βLͨΔ9, un estado parcialmente plegado, que está conectado con la forma nativa de ES-βLͨΔ9. Ip ES-βLͨΔ9 sólo posee estructura secundaria residual, pero es muy compacto. Posee las características de un glóbulo fundido y puede esmbilizarse formando un dímero. La eliminación de los residuos 287-295 afecta dramáticamente la velocidad de replegado de la β-lactamasa: ES-βLͨΔ9 se pliega 10 4 veces más lentamente que ES-βL. A partir del estudio tennodinámico y cinético de ES-βLͨΔ9 se concluyó que los residuos eliminados proveen información para formar estructura secundaria, evitar trampas cinéticas y asociación errónea de unidades de plegado, acelerar el pasaje a través del estado de transición y estabilizar al estado nativo. Los resultados obtenidos con la β-lactamasa se compararon con otros datos de literatura referidos a proteínas que a pesar de carecer de partes de su secuencia alcanzan un plegado nativo. El conjunto de las evidencias experimentales parece sugerir que la cadena polipeptídica tiende a plegarse guiada principalmente por información local en la secuencia. Las interacciones entre residuos alejados secuencialmente jugarían un papel secundario en el proceso de plegado y aparecerían posteriormente, luego de que la cadena polipeptídica adopte el recorrido espacial apropiado.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
PLEGADO; PROTEINA; FRAGMENTO; INFORMACION; ESTADOS PARCIALMENTE PLEGADOS; ß-LACTAMASA; FOLDING; PROTEIN; TRUNCATED; INFORMATION; PARTIALLY FOLDED STATE; ß-LACTAMASE; FRAGMENT
Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 2004 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
2004
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