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El receptor nicotínico de Discopyae Tschudii: caracterización bioquímica y estudios funcionales en membranas reconstituídas
Silvia Medrano Enrique L.M. Ochoa
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El objetivo del presente trabajo fue estudiar el receptor nicotínico del órgano eléctrico de Discopyqe tschudii y sus propiedades funcionales en membranas reconstituídas. En tal sentido se comprobó la existencia de sitios que fijan α-bungarotoxina y de influjo de Rb+ estimulado por carbamilcolina en preparaciones de membranas del órgano eléctrico de D. tschudii. La respuesta fue bloqueada por curare y se inactivó por incubación previa de las membranas con el agonista (desensibilización). El material fue extraido con colato de sodio y se purificó por cromatografía de afinidad utilizando bromoacetilcolina comoligando. La actividad específica del material purificado fue, en promedio, de 4,7 nmoles de α-bungarotoxina/mg proteína. El análisis de dicho material por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS de dicho material reveló la presencia de cuatro bandas de PM 41.200, 49.500, 60.000 y 66.300. El receptor purificado fue incorporado a liposomas de lecitina de soja (asolectina). Las propiedades funcionales del receptor se preservaron en las muestras reconstituldas. Esto es: capacidad de fijación de ligandos, influjo de cationes estimulado por carbamilcolina, la desensibilización de la respuesta y las transiciones de afinidad para agonistas que se correlacionan con este último fenómeno. Se demostró además, como habia sido observado por métodos electrofisiológicos en preparaciones neuromusculares y por métodos bioquímicos en fragmentos de membranas de órgano electrico, que el Ca2+ acelera la velocidad de inactivación (desensibilización) del receptor reconstituido en liposomas. Estas observaciones sugieren la presencia de un receptor colinergico de tipo nicotínico en el órgano electrico de D. tschudii, con características bioquímicas y funcionales similares al receptor de las especies del género Torpedo. Esto permite considerar al órgano electrico de D. tschudii como una fuente para el estudio de este receptor. El receptor nicotínico purificado y reconstituído en líposomas fue el sistema elegido para estudiar el mecanismo de acción de la droga amantadina. Esta droga, utilizada para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y para prevenir ciertas infecciones virales, produce, ademas, un bloqueo de la transmisión neuromuscular uniéndose al receptor nicotínico en un sitio distinto del sitio de unión de la acetilcolina. En el presente trabajo se confirmó que la amantadina es un bloqueante no competitivo del receptor nicotínico ya que no afecto la fijación de α-bungarotoxina en equilibrio pero si produjo un bloqueo del influjo de cationes estimulado por carbamilcolina. A través de la determinación del influjo de Rb+ a membranas expuestas a carbamilcolina por distintos tiempos se observo que la amantadina aceleró la velocidad de inactivación de la respuesta (desensibilización) inducida por el agonista. La amantadina no indujo dicho fenómeno por si misma. La aceleración de la velocidad del proceso de desensibilización seria entónces uno de los mecanismos por los cuales la amantadina ejerce el bloqueo de la transmisión colinérgica. Otro de los objetivos del presente trabajo fue estudiar la aplicación de una nueva tecnica para la reconstitución del receptor nicotinico y comparar el funcionamiento del receptor en liposomas preparados bajo distintas condiciones experimentales. La técnica empleada fue la de precipitación con polietilenglicol, que ha sido utilizada en la reconstitución del receptor muscarinico del corazón y el receptor α2-adrenérgico del cerebro de mamíferos. Se observó que el receptor nicotínico se incorporó a los liposomas y que un 80 % de las moleculas se orientaron correctamente en la membrana. La fijación en equilibrio de α-bungarotoxina reveló que se produjo una perdida de 50-55% de los sitios durante el procedimiento de reconstitución. Los valores de la constante de velocidad de fijación de α-bungarotoxina de segundo orden (kt) y de la constante de baja afinidad para carbamilcolina (K1) fueron comparables a los observados para el receptor reconstituido por el método de diálisis. Sin embargo, el receptor reconstituldo por el método de precipitación con PEG exhibió un minimo inílujo de Rb+ estimulado por carbamilcolina y no manifestó transiciones de afinidad. Cuando la preparación de PEG se purificó, mediante el empleo de éter etílico, para eliminar las impurezas presentes en las muestras comerciales de PEG, el receptor reconstituido exhibió transiciones de afinidad e influjo de cationes estimulado por carbamilcolina. El análisis de los lípidos presentes en las muestras reconstituldas reveló que los proteoliposomas preparados por precipitación con PEG presentaron un contenido mayor de ácidos grasos libres que los preparados por el método de diálisis. Los resultados sugieren que los efectos observados pueden deberse a alguna de las impurezas presentes en las preparaciones de PES y/o a la presencia de ácidos grasos libres provenientes, probablemente, de la hidrólisis de la asolectina. Con el objeto de profundizar en el estudio del fenómeno de la desensibilización del receptor nicotínico, se estudió el efecto de un pentapeptido, denominado timopentina, sobre las propiedades funcionales del receptor nicotínico reconstituído en liposomas. Se piensa que dicho pentapeptido corresponde al sitio activo de la hormonatimica timopoyetina. La timopoyetina y la tímopentinas ademas de sus efectos inmunológicos, producen un bloqueo de la transmisión neuromuscular. En el presente trabajo se muestra que la timopentina no modificó la fijación en equilibrio de α-bungarotoxina pero produjo un bloqueo de la respuesta del receptor en un rango de 10-10M a 10-4M. Más aún se observó que la timopentina aumento la velocidad de desensibilización del receptor y que dicho fenómeno se incrementó en presencia de Ca2+. Estas observaciones corroboran el efecto que sobre la transmisión neuromuscular tiene la timopoyetina y sugieren que la timopentina o péptidos relacionados podrian modular dicha transmision.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1988 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1988
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