Catálogo de publicaciones - tesis

Compartir en
redes sociales

Título de Acceso Abierto

Mecánica y dinámica del citoesqueleto en células vivas

Carla Pallavicini Luciana Bruno Valeria Levi

publishedVersion.

Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital

El citoesqueleto es una red auto-organizada y dinámica presente en las células eucariotas. Está compuesto por tres tipos de biopolímeros: filamentos de actina, filamentos intermedios y microtúbulos. Estos filamentos se constituyen a partir de la polimerización de proteínas más simples y forman estructuras con diámetros de ~6nm para los filamentos de actina y ~10nm para los filamentos intermedios. Los microtúbulos son los elementos más rígidos del citoesqueleto, con una estructura tubular de diámetro externo de ~25nm. Estos biopolímeros, en conjunto con proteínas motoras, componen un entramado con propiedades mecánicas que permite a las células generar y reaccionar ante la acción de fuerzas. El citoesqueleto está involucrado en numerosos procesos celulares tales como la migración, división, contracción y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento mecánico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organización y mecánica celular. La microscopía de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del citoesqueleto, permitiendo su visualización en células vivas. El análisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estudiar las propiedades mecánicas relevantes a su función biológica. Este tipo de análisis requiere la identificación de las posiciones de filamentos individuales con alta precisión. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas es extremadamente complejo. Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmo de tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtúbulos fluorescentes con precisión subdifracción. Evaluamos el rendimiento de esta rutina mediante simulaciones numéricas de imágenes confocales y experimentos in vitro y obtuvimos una precisión de ~9nm para filamentos in vitro y ~20nm para filamentos en células fijadas. Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis vivas. Mediante un análisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equilibrio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento térmico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados para calcular la longitud de persistencia de los microtúbulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un parámetro ampliamente utilizado para describir las propiedades mecánicas de filamentos, y se define como la razón entre la rigidez exural del filamento y las fuerzas térmicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtúbulos en células vivas fue ~20 nm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este parámetro no se vio modificado en presencia de la proteína asociada a microtúbulos XTP o la depolimerización de actina. En contraste, la depolimerización de la red de filamentos intermedios disminuyó significativamente el valor de este parámetro. Por otra parte, exploramos si la inhibición de los eventos de polimerización y depolimerización de los microtúbulos podría afectar su rigidez exural efectiva. En este caso, la distribución de formas de los filamentos no se ajustó a un comportamiento térmico, como el observado en células control, indicando que el comportamiento mecánico de los microtúbulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la célula. Observamos que la depolimerización de filamentos de actina e intermedios aumenta significativamente las fluctuaciones laterales de los microtúbulos, sugiriendo que estos filamentos contribuyen a la organización global de dicha red. Por otra parte, verificamos que la producción de fuerzas no es homogénea dentro de las células ya que los microtúbulos presentaban un movimiento más lento, pero más direccionado en la región cortical en comparación con la región perinuclear. En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dinámicos de los eventos de buckling de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis. Éstos son eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en células, y se caracteriza por una rápida exión del filamento seguida de su relajación. Se ha propuesto que estos eventos de rápida deformación dependen de fuerzas localizadas espacio-temporalmente resultantes de la acción de motores moleculares. Para comprender este fenómeno, caracterizamos los eventos de buckling mediante el tracking de microtúbulos fluorescentes individuales en combinación con simulaciones numéricas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podrían producir la exión de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron muchas de las características observadas en microtúbulos en células vivas, sugiriendo que el modelo mecánico implementado representaba los procesos esenciales del buckling de microtúbulos. Luego analizamos la interacción entre vesículas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtúbulos pudiendo así observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las vesículas. Los resultados obtenidos de este análisis sugieren que los microtúbulos podrían afectar el transporte indirectamente, aparte de servir como vías para las organelas transportadas. Con el fin de extender nuestro análisis del citoesqueleto a otros sistemas biológicos, estudiamos células de cáncer de próstata, que muestran una expresión anormal de proteínas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y capacidad de colonizar órganos lejanos. Desarrollamos técnicas computacionales para analizar imágenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas células y, en particular, cuantificar la acción de una droga que induce la expresión de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulación de la morfología celular. Nuestros resultados mostraron que la células bajo la inducción de HO-1 presentaban menos migración y una proporción significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las células control, los que indicaría una mayor comunicación entre células vecinas. En síntesis, llevamos a cabo experimentos biológicos para observar el citoesqueleto y desarrollamos técnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en células vivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balance y dinámica de fuerzas activas en células para la organización de la red de microtúbulos. Estos conocimientos también fueron de utilidad para analizar los cambios en el citoesqueleto de células de cáncer de próstata.

Palabras clave – provistas por el repositorio digital

CITOESQUELETO; MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA; MICROTÚBULOS; TRACKING DE FILAMENTOS; BUCKLING DE FILAMENTOS; CANCER DE PROSTATA; CYTOSKELETON; FLUORESCENCE MICROSCOPY; MICROTUBULES; FILAMENT TRACKING; FILAMENT BUCKLING; PROSTATE CANCER