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En este trabajo se han realizado experimentos para dilucidar la función local en el ovario de la Hormona Liberadora de Gonadotrofinas (GnRH-I). Se han estudiado procesos fundamentales del desarrollo folicular como la síntesis de esteroides sexuales y la angiogénesis ovárica en su relación con la apoptosis folicular. En nuestro laboratorio se postuló que el GnRH-I ejerce una acción inhibitoria durante el desarrollo folicular actuando como modulador intraovárico. En ratas estimuladas con gonadotrofinas analizamos los niveles de esteroides sexuales y la expresión y contenido de enzimas ováricas responsables de la síntesis de esteroides luego del tratamiento con un agonista de GnRH-I, Acetato de Leuprolide (LA). Los efectos observados se han corroborado con experimentos realizados in vitro utilizando este mismo agonista. Además, estudiamos factores angiogénicos esenciales para el desarrollo y establecimiento de la vasculatura en el folículo ovárico, como también parámetros de la atresia folicular. El tratamiento con el agonista afectó la síntesis de esteroides ováricos al igual que el contenido folicular de las enzimas esteroidogénicas, produciendo una disminución en la síntesis de andrógenos y como consecuencia, en la producción de estradiol. Estos resultados se observaron en los experimentos realizados in vivo e in vitro. También se observó una disminución en el contenido de factores angiogénicos y de sus receptores, acompañado de un aumento de la actividad de caspasa-3, enzima efectora clave en el proceso de apoptosis folicular. Se concluyó que el factor GnRH-I actuaría en el ovario localmente afectando factores esenciales para el desarrollo folicular. Este factor interfiere en la foliculogénesis inducida por gonadotrofinas, alterando la síntesis de esteroides gonadales e inhibiendo la angiogénesis folicular. Esto alteraría el balance de los factores de supervivencia de las células foliculares, causando la activación de proteínas reguladoras de la apoptosis, llevando a los folículos en desarrollo al proceso de atresia.

Las industrias textiles consumen grandes cantidades de agua y generan importantes volúmenes de efluentes líquidos coloreados que pueden alcanzar distintos cuerpos de agua, bloqueando procesos fotosintéticos y produciendo un daño irreparable en el medio ambiente.Existen métodos físicos/químicos para el tratamiento de efluentes textiles, usualmente son costosos y generan grandes cantidades de lodos y polución secundaria. Como método alternativo la biodecoloración resulta económicamente viable y amigable con el medio ambiente, ya que involucra procesos de biodegradación de los colorantes o bien su acumulación en diversos organismos. Las levaduras son especialmente interesantes por su rápido crecimiento unicelular y su adaptación a crecer en medios líquidos. Su capacidad para remover colorantes está vinculada a la actividad de enzimas ligninolíticas y a mecanismos de formación de radicales hidroxilos altamente reactivos, que por su baja especificidad de sustrato pueden degradar colorantes de diferente naturaleza química. Estos procesos oxidativos de decoloración, tienen además la ventaja de garantizar que no se producirán aminas aromáticas potencialmente carcinogénicas a partir de colorantes textiles.Trichosporon akiyoshidainum es una levadura basidiomicetácea que demostró ser una herramienta muy importante para la biodegradación de colorantes azoicos aromáticos. En estudios previos se evidenció que la decoloración de Negro Reactivo 5 por esta levadura es un proceso oxidativo que involucra la acción de peroxidasas y fenol oxidasas. Sin embargo, los mecanismos moleculares no han sido completamente elucidados y son objeto de estudio en el presente trabajo.La secuenciación, anotación y caracterización del genoma de T. akiyoshidainum, facilitó el análisis de las vías metabólicas involucradas en la biodecoloración de Negro Reactivo 5 y permitió proponer diversos mecanismos moleculares para su degradación.Mediante estudios de protéomica comparativa libre de marcado, se identificaron principalmente proteínas extracelulares involucradas en los mecanismos de generación de radicales hidroxilos, entre las que se destacaron enzimas productoras de peróxido de hidrógeno y otras involucradas en la reducción de hierro y homeostasis celular. Muchas de estas proteínas fueron determinadas en mayor abundancia en presencia del coloranteNegro Reactivo 5. En cuanto a las proteínas involucradas en la vía enzimática de degradación, cuyas actividades fueron determinadas en los sobrenadantes de cultivo, solo pudo ser identificada una posible peroxidasa en presencia del colorante Negro Reactivo 5.Por otro lado, se detectaron proteínas relacionadas a las vías bajas de degradación. Según estos resultados, diversas vías de degradación y metabolismo de xenobióticos fueron activadas.Con los resultados obtenidos se desarrolló una hipótesis sobre el metabolismo de T. akiyoshidainum HP-2023 durante la degradación del colorante Negro Reactivo 5. Sugieren que la degradación del colorante se consigue mediante dos etapas separadas. En primer lugar, las moléculas de colorante son degradadas por peroxidasas o reacciones de tipo Fenton, a compuestos aromáticos de bajo peso molecular. En segundo lugar, estos compuestos aromáticos son catabolizados por diversas vías de degradación de xenobióticos.La elucidación de los mecanismos moleculares implicados en este proceso de decoloración añade nuevas perspectivas a la comprensión actual de la degradación de los compuestos aromáticos por levaduras y conduce a nuevas estrategias para mejorar la remediación del colorante.

La fiebre aftosa constituye un serio problema sanitario que afecta a las especies biunguladas que genera severas consecuencias económicas a nivel mundial. Las vacunas formuladas con virus inactivado como antígeno (Ag) inducen respuestas de anticuerpos seroneutralizantes (AcN) de corta duración y es necesaria la revacunación periódica. La infección experimental en ratón adulto genera una continua e intensa respuesta de AcN tal como sucede en el huésped natural. Esta prolongada síntesis de Acs anti-VFA hace del modelo murino un excelente sistema para el estudio de los mecanismos involucrados en una prolongada respuesta humoral. Aunque este fenómeno es conocido desde hace tiempo, las bases inmunológicas responsables de la prolongada inmunidad inducida luego de la infección se encuentran aún sin dilucidar. Con la intención de comprender la causa de la respuesta inmune humoral al VFA, la primera parte de este trabajo de tesis estuvo dirigida a aclarar si el mantenimiento de los niveles de Acs puede ser explicado por un fenómeno de infección persistente del individuo, o mediante una persistencia antigénica mediada por células presentadoras de antígeno (CPA). La segunda parte del trabajo de tesis fue dirigida a estudiar los mecanismos de acción de dos efectivos inmunomoduladores (Avridine -AVR- y la pared de Mycobacterium -PCM) en la inducción de una prolongada respuesta humoral. Es importante enfatizar que los ensayos de transferencia utilizados en este trabajo permitieron acotar el sistema a los esplenocitos transferidos, debido a que estas células resultaron suficientes para inducir una prolongada respuesta humoral en los animales receptores normales (Tabla 1). La hipótesis de la existencia de una infección persistente fue descartada mediante la utilización de varios métodos, en especial la falta de detección del genoma utilizando un ensayo de PCR cuya sensibilidad es de 10-3 DIRL 50%.(Tabla 3 A y B). Además, el hecho de que haya sido posible obtener resultados similares a través de la inmunización de los animales dadores con antígenos inertes corroboró que la replicación viral definitivamente no es una condición indispensable para que se induzca una prolongada respuesta humoral (figura 6B). La transferencia de esplenocitos irradiados provenientes de animales infectados a animales receptores presensibilizados y negativizados (inmunizados con bajas dosis de virus inactivado) permitió la detección funcional de CPA específicas para el virus aftoso. La inhibición de la presentación antigénica (PA) in vitro, los ensayos de inhibición de la PA in vivo y el establecimiento de una correlación entre la capacidad de presentar el Ag y el título de Acs del animal dador corroboraron que, en el modelo utilizado, la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA que se observa en animales que fueron infectados. Dos datos experimentales merecen ser destacados: (i) Las células B son suficientes para la producción del fenómeno (figura 16B). (ii) Las CPA fueron capaces de permanecer en el animal dador por lo menos 365 días después de la infección (figura 15 B) Conociendo que la presencia de CPA es el mecanismo que media la prolongada respuesta humoral anti-VFA en los animales infectados, se analizó: la capacidad de inducir CPA en los animales inmunizados con diferentes formulaciones vacunales. Los ensayos realizados demostraron que tanto las CPA que provenían de animales infectados así como las obtenidas de ratones que fueron inmunizados con las diferentes formulaciones fueron capaces de inducir Acs detectables por ELISA. Sin embargo, solamente los esplenocitos de animales infectados o inmunizados con la vacuna inmunomodulada con AVR indujeron Acs de tipo neutralizante en los ratones receptores presensibilizados (figura 20 B). La utilización del ensayo de doble transferencia (figura 22) demostró que la presencia de Ag circulante en el animal dador no es necesaria para el mantenimiento de las CPA (figura 24). Estos resultados son coincidentes con la continua presencia de CPA en los animales infectados (hasta los 365 días post-infección) en los cuales no es posible encontrar antígeno viral ni partículas infecciosas. Se utilizó un sistema de PA donde el antígeno a ser considerado es mucho más simple en términos de cantidad de determinantes antigénicos para intentar explicar la diferencia observada entre las respuestas inducidas por las distintas vacunas utilizadas. Los esplenocitos extraídos de los animales inmunizados con dosis crecientes correspondiente a la secuencia 135-160 de VP1 del VFA O1C (P1) indujeron respuestas correlativamente incrementadas de Acs detectables primero, por ELISA y, posteriormente, por SN. Estos resultados apuntalan la hipótesis que sostiene que las diferencias entre la inducción de anticuerpos neutralizantes y aquellos detectados solamente por ELISA puede ser meramente debida a la masa antigénica presentada. Posteriormente, se analizó el efecto de los dos inmunomoduladores en un posible procesamiento diferencial de las distintas porciones del P1 Los resultados demostraron que, en efecto, estas diferencias existen, ya que los patrones de reactividad demostrados por los sueros de los animales infectados e inmunizados con AVR resultaron similares y cualitativamente diferentes a aquellos presentados por los sueros de los animales inmunizados con PCM o el vehículo oleoso per se (figura 25). Esto sustentaría que adicionalmente a un fenómeno de tipo cuantitativo, también existe un factor cualitativo como explicación a las diferencias encontradas en la respuesta humoral inducida en los animales receptores de células provenientes de dadores inmunizados con diferentes inmunomoduladores. La estrecha correlación entre la presencia y actividad de las CPA específicas para VFA, y los titulos de Acs observados en los animales que fueron estimulados antigénicamente de la forma más diversa con (infectados experimentalmente o inmunizados con virus inactivo bajo muy diferentes condiciones), poderosamente sugiere que el mecanismo involucrado en el mantenimiento de la respuesta inmune es la presencia de CPA reestimulando en forma permanente la producción de Acs anti-VFA. Estos resultados son de importancia para el diseño y desarrollo de nuevas vacunas en las cuales se debería principalmente focalizar la atención en metodologías que estimulen la inducción y un eficaz mantenimiento de CPA especificas para VFA en los individuos vacunados.

La Interleuquina 1β (IL-1β) es una citoquina proinflamatoria central en procesos fisiopatológicos que ejerce efectos pleiotrópicos sobre el sistema inmune innato y el adaptativo. A pesar de ser una proteína de exportación, la IL-1β carece de un péptido se~nal y es sintetizada en el citoplasma como una molécula precursora inactiva (proIL-1β), que tras ser procesada proteolíticamente, es secretada por mecanismos definidos de forma incompleta, que son independientes de la vía canónica de secreció celular que involucra al retículo endoplasmático y al aparato de Golgi. En este trabajo de tesis, investigamos los mecanismos involucrados en la secreción de IL-1β en neutrófilos aislados de sangre periférica humana. Nuestros estudios indicaron que la inhibición de la inducción de autofagia mediante el uso de inhibidores como 3-metiladenina y Wortmanina, o el bloqueo de lujo autofágico con Bafilomicina A1 (Baf A1) o E-64d, redujeron marcadamente la secreción de IL-1β inducida por LPS o LPS+ATP luego de 5 hs de cultivo. En neutrófilos diferenciados a partir de la línea celular PLB985, la reducción de la expresión (knockdow) de ATG5 mediante ARN de interferencia inhibió la secreción de IL-1β. En respuesta a la estimulación de neutrófilos con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando con el marcador de vesículas autofágicas LC3B al ser analizadas por microscopia laser confocal a las 4 horas postestimulación (p.e.). En contraposición al impacto ejercido por la inhibición de la autofogia, su inducción por privación de nutrientes incrementó la colocalización entre IL-1β y LC3B a las 4hs. p.e., y promovió significativamente la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP a las 5 hs p.e. Dado que la secreción de IL-1β en neutrófilos requiere de la actividad de la NADPH oxidasa, nos planteamos como hipótesis que la actividad de la enzima es necesaria para evitar la acidificación de las vesículas que contienen IL-1β y de esta forma prevenir su degradación por proteasas ácidas lisosomales. En favor de esta posibilidad, el tratamiento de neutrófilos con inhibidores de la NADPH oxidasa como DPI y apocinina inhibió la secreción de IL-1β inducida por LPS+ATP y no modificó los niveles intracitoplasmáticos de la misma, sugiriendo que la IL-1β es degradada si la enzima es inhibida. Por otro lado, en neutrófilos estimulados por 4 hs. con LPS+ATP, la IL-1β pudo ser detectada colocalizando parcialmente con gp91 (componente de la NADPH oxidasa). Sin embargo, el tratamiento con DPI de neutrófilos estimulados con LPS+ATP no afectó la colocalización de la IL-1β vesicular con Lysotracker red, aunque disminuyó la colocalización de IL-1β con LC3B. Estos hallazgos indican que la actividad de la NADPH oxidasa es requerida para la secreción de IL-1β pero este efecto parece ser independiente de la acidificación de las vesículas que contienen a la IL-1β. Nuestros resultados no descartan que la NADPH oxidasa sea necesaria en otros pasos del proceso de secreción, como ser en la inducción del proceso autofágico o en la exocitosis de las vesículas autofágicas conteniendo IL-1β. Por último, también determinamos que una porción de la IL-1β sintetizada puede ser degradada por serin proteasas neutras, cuya actividad estaría determinada por el pH vesicular el cuál podría ser modulado por la actividad VATPasa. En conjunto, los hallazgos de este trabajo sugieren que la secreción de IL-1β en neutrófilos podría involucrar un mecanismo de autofagia secretoria y que la cantidad de IL-1β secretada dependería de su resistencia a ser degradada por proteasas antes de ser conducida al medio extracelular.

La leptina presenta un papel importante en la reproducción, principalmente se ha sugerido que presenta funciones importantes en la placenta durante la gestación, donde se detectó su expresión y la de sus receptores. En mujeres embarazadas el nivel de leptina en suero aumenta en comparación a las no embarazadas, principalmente durante el segundo y tercer trimestre; aún antes de que se incremente el tejido adiposo.Originalmente la leptina, proteína de 16 kDa codificada por el gen LEP, fue descripta como una molécula producida por el tejido adiposo involucrada en la regulación del metabolismo al nivel central. La leptina placentaria podría tener efectos sobre el crecimiento, la angiogénesis y la inmunomodulación afectando tanto funciones maternas como fetales. En este trabajo, se analizó el efecto del 17β-estradiol (E2) y las vías de señalización y factores de transcripción involucrados, sobre la expresión de la leptina en la placenta humana utilizando dos modelos experimentales, la línea celular BeWo, derivada de coriocarcinoma, y explantos de placentas normales humanas a término.Al analizar la importancia del factor de transcripción Sp1 sobre la regulación de la expresión de leptina mediada por estradiol, pudimos demostrar que la sobreexpresión de este factor incrementa la expresión de leptina determinada por Western blot. Más aún la sobreexpresión de un vector de expresión para Sp1 incrementa tanto la actividad basal del promotor de leptina como la inducida por E2. Específicamente aumenta la actividad de la región del promotor de leptina comprendida entre -1951 y -1887pb que contiene al ?enhancer? placentario de leptina (PLE). Estos resultados fueron confirmados al utilizar un inhibidor de Sp1, el ácido betulínico. En estos experimentos se pierde el efecto inductor de Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria. La acción ejercida por este factor de transcripción sobre la expresión de leptina es dependiente de ERα ya que en las células que expresan un siRNA contra este receptor la sobreexpresión de Sp1 no tiene efecto alguno sobre la expresión de leptina. Además al utilizar un vector reportero que contiene el sitio halfERE mutado, la acción de Sp1 parecería anularse. Por otro lado al utilizar un vector que presenta el promotor de leptina con el sitio de unión para Sp1 mutado, la sobreexpresión de ERα no es capaz de inducir la expresión de leptina. Estos resultados sugieren que es necesario que se encuentre intacto el sitio de Sp1 para que se pueda evidenciar el efecto de ERα sobre la expresión de leptina placentaria.Además se evalúo la posible interacción de ERα y Sp1 por inmunoprecipitación. Se demostró que hay interacción entre ambas proteínas, ya que al inmunoprecipitar ERα, se puede evidenciar la presencia de Sp1 en el inmunoprecipitado, y al inmunoprecipitar Sp1 se puede observar ERα en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que habría un efecto cooperativo entre ambos factores en la inducción de la expresión de la leptina placentaria.El antagonista estrogénico, ICI 182,780 no generó inhibición alguna sobre el efecto del Sp1 sobre la expresión de leptina placentaria, lo que sugeriría que la inducción de Sp1 sobre la expresión de leptina no estaría siendo afectada por el inhibidor ICI 182,780.Encontramos también que la expresión basal e inducida por E2 se ve disminuida con el tratamiento con el inhibidor del factor NFκB, sulfasalazina, sugiriendo la participación de los dímeros del NFκB en los efectos regulatorios de dicho esteroide. A través de transfecciones transitorias hemos observado que la sobreexpresión de la subunidad p65 (Rel-A) aumenta la actividad transcripcional basal del promotor de leptina y por otro lado la sobreexpresión de Rel-A en las células BeWo-Sh2, que poseen los niveles de ERα disminuidos por la estrategia de siRNA, produce una marcada disminución de la actividad basal del promotor de leptina, sugiriendo que el efecto de la sobreexpresión de p65 sobre el nivel basal de actividad del reportero sería dependiente de la expresión de ERα ya que al disminuir los niveles de este receptor el efecto de p65 se suprime. Por otro lado la sobreexpresión de p65 no estaría afectando la expresión de leptina mediada por E2 en presencia o ausencia de ERα.Se ha evaluado también la presencia y localización de ERα y la subunidad p65 en las células BeWo, por ensayo de inmunofluorescencia y su posible interacción por coinmunoprecipitación. Hemos encontrado que ambas proteínas se encuentran localizadas en el citoplasma y cuando son sobreexpresadas migran al núcleo. Por otro lado determinamos que en las células BeWo estos dos factores de transcripción estarían interactuando, ya que al inmunoprecipitar ERα, se pudo observar p65 en el inmunoprecipitado. Lo que sugiere que existiría un efecto cooperativo entre el ERα y el NFκB.Hemos observado que el incremento de la expresión de leptina por estradiol en células BeWo depende de la integridad de la vía de señalización mediada por PKA, debido a que tratando a las células con inhibidores de ésta vía, H89 y SQ22536 se produce una disminución de su efecto. También observamos que la sobreexpresión de mutantes dominantes negativas para el factor de transcripción CREB anulan el efecto de estradiol sobre la expresión de leptina placentaria. Por otro lado la sobreexpresión de CBP, produce una estimulación del efecto inductor de estradiol, mientras que la sobreexpresión con HDAC, una deacetilasa de histonas, genera el efecto contrario. El tratamiento con tricostatina A (TSA), un inhibidor de la actividad acetiltransferasa, contrarresta el efecto de HDAC-1. Esto indicaría que la regulación de la expresión de leptina por estradiol sería un proceso multifactorial que involucraría la activación de la vía de señalización de PKA y la modificación de la acetilación de histonas.Los resultados obtenidos contribuyen a mejorar la compresión de la expresión de leptina en la placenta humana así como las vías de señalización y factores de transcripción que actúan en la acción del E2 sobre la expresión de la misma.

La actividad de HO-1 ha sido asociada a una plétora de efectos biológicos. En particular estudios previos de nuestro grupo de trabajo han demostrado su rol como modulador autócrino/parácrino de la esteroidogénesis en la corteza adrenal de ratas estimuladas con ACTH [1] y LPS [2], así como su acción citoprotectora como parte del sistema antioxidante adrenal. En el presente trabajo de tesis estudiamos mecanismos de inducción de HO-1 en células adrenales. Los resultados obtenidos confirman que el tratamiento de células Y1 con ACTH induce la transcripción de HO-1. Se localizó una zona del promotor murino de HO-1 de 400 pb aledaña al inicio de la transcripción, donde se encontraron secuencias consenso para la unión de los factores de transcripción CREB y AP-1. Se demostró también la participación de la vía de transducción de señales de AMPc/PKA/CREB y de Akt/PKB en el mecanismo de inducción de HO-1 por ACTH. El LPS incrementó la transcripción de HO-1 por un mecanismo que involucra una zona del promotor de aprox. 516 pb (entre -3216 y -2700). Tras el estímulo con LPS constatamos, además, la activación del factor de transcripción NFκB y la regulación de la expresión de HO-1 por la vía de la PKA. Finalmente, encontramos evidencias que nos permiten afirmar que el NO también induce a la HO-1 incrementando su transcripción, por un mecanismo que involucra la activación del factor de Nrf2, la actividad de PKC, la activación de la GCs y la generación de GMPc. En suma, demostramos que diferentes estímulos son capaces de activar la transcripción de HO-1, en células adrenales Y1, utilizando diferentes mediadores y factores de transcripción. Dado su rol modulatorio en la síntesis de glucocorticoides adrenales además de sus efectos citoprotectores, este conocimiento podría utilizarse para diseñar estrategias dirigidas a inducir HO-1 como un blanco novel alternativo en el tratamiento de patologías que cursan con disfunción adrenal.

Fil:Valli, Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El eje hipotalámico-hipofisiario es una estructura fundamental en el control neuroendócrino del organismo y es en la eminencia media donde se establece la principal conecxión entre ambos componentes a travéz de la liberación de factores hipofisotropos controladores de la secreción hormonal hipofisiaria. De este modo la liberación de PRL está sujeta principalmente a un control tónico de tipo inhibitorio ejercido por la DA, mientras que la sereción de la GH está controlada por la liberación cíclica de GHRH y STT. A nivel periférico, los estrógenos son los principales estimuladores de la síntesis y secreción de PRL y un tratamiento estrogénico crónico produce en la rata el desarrollo de nuestro modelo experimental: un prolactinoma o adenoma de lactotropos. La Angiotensina II (AII), además de ser una hormona involucrada en la regulación de la presión arterial sistémica, es uno de los factores que inducen endócrina y parácrinamente la secreción de PRL. Este octapéptido resulta interesante porque tiene además en diferentes tejidos efectos de tipo proliferativo y angiogénico y, en muchos casos, las acciones estimulatorias ejercidad a través del receptor AT1 son parcialmente compensadas y reguladas por efectos opuestos producidos vía AT2. El sistema renina-angiotensina (SRA) hipofisiario local se encuentra ampliamente influenciado por la acción estrogénica , y nosotros ya habíamos descripto en trabajos previos una alteración de la respuesta a AII en la hipófisis hiperplásica. Especificamente, se encontró alterado el patrón de movilización interna del ciclo y la secreción de PRL. Por los tanto la primera parte de la tesis decidimos analizar con el mayor detalle algunas de las alteraciones de la respuesta a AII en los tumores hipofisiarios, especificamente en relación con la participación de los subtipos de sus receptores. De este modo detectamos por Western-blot y por RT-PCR que el tratamiento estrogénico induce una sobreexpresión de AT2 y una subexpresión de AT1 en hipófisis. Por otro lado, describimos por primera vez la activación de ERK1/2 en la respuesta hipofisiaria a AII y definimos la vía de transducción involucrada en la glándula normal. Este proceso involucra la activación de una proteina Gq, un aumento intracelular del calcio y la transactivación del receptor EGF vía una tirosin kinasa no receptora de la familia Scr. Encontramos además que, en el caso del prolactinoma, la activación de ERK1/2 incluida por AII está en parte mediada por AT2, siendo ésta la primera evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. La terapia farmacológica actual de los prolactinomas en muchos casos no resulta ser suficiente ni definitiva, ya que muchas veces es necesario recurrir a una combinación de cirugía y fármacos, e incluso así, el tumor suele reincidir una vez suspendida la aplicación de la droga. Por lo tanto se continúa en la busqueda de nuevas y más eficientes alternativas para completar la farmacoterapia tradicional. Se ha descripto que la progesterona (P4) es capaz de antagonizar efectos estrogénicos y que la dehidroepiandrosterona (DHEA) tiene un amplio espectro de acciones antitumorales y rejuvenecedoras. Entre otras cosas, DHEA inhibiría la génesis y progresión de distintos tipos de tumores de piel, pulmón, hígado, cólon, mama y próstata. Por otro lado se le ha adjudicado a este esteroide efectos benéficos sobre otras patologías asociadas al envejecimiento y el estrés, como enfermedades cardiovasculares, diabetes, enfermedades autoinmunes, obesidad y decaimiento cognitivo o anímico. Sin embargo, también se han descripto en algunos casos efectos deletéreos asociados a un tratamiento prolongado con dosis farmacológicas de DHEA. Entre ellos, una acción estrogénica sobre algunos tumores estrógeno-dependientes, hipertrofismo uterino y hepático, y desarrollo de ovarios poliquísticos. Por lo tanto decidimos estudiar el efecto de la P4 y la DHEA en nuestro modelo de hiperplasia hipofisiaria. Un tratamiento in vivo con P4 no evidenció efectos de tipo terapéutico, ya que no redujo el aumento del peso hipofisiario ni la hiperprolactinemia inducida por el tratamiento crónico con estrógenos. Sin embargo, pudimos determinar que la P4, sinergizando con los estrógenos, induce la participación de AT2 en la secreción de PRL astimulada por AII, lo que constituye la segunda evidencia de la participación funcional de este receptor en la hipófisis. En cuanto al tratamiento con DHEA, demostramos por primera vez su efecto benéfico sobre el tumor hipofisiario inducido por estrógenos, ya que fue capaz de revertir parcialmente los parámetros tumorales mencionados. Sin embargo, el esteroide mostró también per se una cierta acción hiperplásica, prolactinoliberadora y, bajo ciertas condiciones, estimuladora de la secreción de GH. En células adenohipofisiarias normales en cultivo evidenciamos una acción directa de DHEA a nivel hipofisiario. Si bien no se modificó la secreción basal de PRL y GH, si se vió alterada la respuesta a reguladores hiportalámicos. Así, demostramos que DHEA en hipófisis potencia la liberación de PRL y GH en respuesta a AII y a GHRH respectivamente y reduce la inhibición ejercida por la DA y la STT. Determinamos asimismo que la influencia de DHEA sobre la acción dopaminérgica estaría mediada por la movilización de calcio intracelular, mientras que la influencia sobre la cción de la GHRH estaría mediada por el AMPc. Creemos que los resultados presentados en esta tesis contribuyen a una mayor comprensión de los mecanismos que relacionan la acción estrogénica con la actividad de componentes del SRA, lo que es importante a la hora de entender en mayor profundidad procesos tumorigénicos que implican tanto la hiperplásia como la angiogénesis. Por otro lado, aportan a la explicación de las actuales controversias existentes en relación con la acción de DHEA sobre algunos tipos de tumores, especialmente estrogéno-dependientes, y de los efectos secundarios que muchas veces presenta un tratamiento crónico con este esteroide.

Hemos demostrado que el aluminio induce colestasis asociada a múltiples alteraciones en transportadores hepatocelulares que participan en la función secretora bibliar, al igual que Mrp2. El objetivo fue investigar si estos efectos perjudiciales son mediados por el estrés oxidativo causado por el metal. A tal efecto, fue estudiada la capacidad antioxidante de la vitamina E, en ratas Wistar macho. El aluminio se administró ip (27 mg / kg de peso corporal, tres veces a la semana, 90 días). Vitamina E (600 mg / kg de peso corporal) fue coadministrado, sc. El Aluminio aumento la peroxidación lipídica (+50%) y disminuyó el glutation hepático (-43%) y la actividad del glutation peroxidasa (-50%) y catalasa (-88%). La vitamina E contrarrestó total o parcialmente estos efectos. Los niveles de Al en plasma e hígado fueron significativamente reducidos por la vitamina E (-40% y -44%, respectivamente, p <0,05). Aluminio aumentó 4 veces el índice de apoptosis hepática, y este efecto fue contrarrestado por la vitamina E. El flujo biliar se redujo en ratas con Al (-37%), y fue normalizado con la vitamina E. El antioxidante normalizó el manejo hepático de los sustratos de Mrp2, rosa de bengala y dinitrophenyl-S-glutatión, relacionados con la restauración de su expresión. Esto indica que el estrés oxidativo juega un papel crucial en la colestasis, apoptosis o necrosis hepatocelular ocacionada por el Aluminio, y que la vitamina E previene estos efectos nocivos impidiendo la formación de radicales y favoreciendo la eliminación del metal.

La insulino resistencia se define como la baja habilidad de la insulina para ejercer sus acciones metabólicas. Se sabe que este estado metabólico alterado es capaz de afectar a los tejidos de manera diferente. El período prenatal es un momento crítico del desarrollo en el cual el feto es vulnerable a alteraciones en el ambiente materno que predisponen al desarrollo de patologías durante la vida adulta. Con un modelo murino de programación fetal por exceso de andrógenos hemos logrado emular en ratas adultas características de tipo síndrome de ovario poliquístico, dando dos fenotipos característicos uno ovulatorio irregular y otro anovulatorio. Estos dos fenotipos presentan un estado metabólico alterado caracterizado por una hiperglucemia, hiperinsulinemia e insulino resistencia sérica; y una insulino resistencia hepática que afecta tanto el metabolismo de la glucosa como la lipogénesis. A su vez encontramos alteraciones en la vía de señalización de la insulina en el ovario de manera fenotipo dependiente; estas alteraciones conllevan a una disminución de la respuesta metabólica a la insulina que es capaz de comprometer la fisiología del ovario y que se traduce en las alteraciones ovulatorias encontradas. Estas alteraciones encontradas tanto a nivel metabólico como reproductivo son reversibles a distintos niveles luego de un tratamiento con metformina.