Catálogo de publicaciones

La ribonucleasa P es la enzima responsable de madurar el término 5' de los precursores de los ácidos ribonucleicos de transferencia (ARNt). En eubacterias, consta de dos componentes, uno proteico y uno ribonucleico (Stark et al., 1978). El gen que define el componente ribonucleico de la ARNasa P de Bacillus subtilís fue clonado y su secuencia determinada. In vivo y en condiciones fisiológicas in vitro, ambos componentes son necesarios para efectuar catálisis. Sin embargo, a altas concentraciones de iones mono- y divalentes, el ARN por sí solo es capaz de procesar los pre-ARNt; (Guerrier-Takada et al., 1983); el gen clonado en un vehículo de expresión que contiene el promotor de bacteriófago T7 permite la síntesis in vitro de un ARN que retiene propiedades catalíticas. Las altas concentraciones de cationes necesarias para manifestar la actividad del ARN P cumplen la función de contrarrestar la repulsión electrostática entre el ARN enzima y el ARN sustrato, y así permitir el íntimo contacto requerido para la catálisis. Esto se ha demostrado en el análisis cinético de la reacción catalizada por el ARN P solo; a medida que aumenta la concentración de cationes, el Km de la reacción disminuye, consistente con la mayor afinidad de la enzima por su sustrato a elevada fuerza iónica; pero la reacción es muy lenta. La posibilidad que la baja velocidad de la reacción se deba a la disociación lenta del producto de la superficie de la enzima se infiere de dos hechos: primero, la enzima no parece discriminar entre precursor y producto maduro (Ki =~ Km); y segundo, el análisis de la reacción temprana evidencia un primer ciclo rápido de clivaje. La preincubación de la enzima con ARNt maduro inhibe este primer ciclo; probablemente el ARNt no se disocia rápidamente impidiendo el acceso de sustrato. Por lo tanto, in vitro el paso limitante en la reacción por el ARN P es la disociación del producto de la superficie de la enzima. La reacción catalizada por la holoenzima no presenta este comportamiento; el producto se disocia rápidamente de la enzima una vez efectuada la catálisis. La influencia de la secuencia 3' terminal CCA sobre el procesamiento del término 5' fue también investigada. Con este fin, se construyeron sustratos que la contienen o no, a partir de precursores que in vivo la contienen codificada en el gen o no. El análisis cinético de la reacción sobre estos sustratos evidencia que la secuencia CCA provee un sitio de contacto entre el sustrato y la enzima, posiblemente participando en una unión hidrógeno. El análisis filogenético hizo posible derivar un modelo de estructura secundaria para el ARN P. Este modelo se basó en la comparación de las secuencias para el ARN P en eubacterias Gram positivas y Gram negativas (purpúreas). El modelo es satisfactorio en el sentido que permite identificar un núcleo de elementos conservados, a pesar de la gran divergencia en estructura primaria. Es en este núcleo común que los elementos necesarios para el reconocimiento del sustrato y para la catálisis probablemente residan. Esta hipótesis fue evaluada experimentalmente construyendo in vitro un "minigen" que, clonado en un vehículo de expresión adecuado, permite la síntesis de un ARN que consta sólo de estos elementos conservados y cuyo tamaño es 2/3 del tamaño del ARN P in vivo. Se demostró que esta versión reducida del ARN P retiene actividad catalítica.