-1- Empleando el método cuyos detalles su dan en la página 33, es posible dosar la creatinina, en concentraciones comprendidas entre 0.000 5 M (0.056 mg. por cc.) y 0.008 M (0.905 mg.por cc) con error probable (por cada determinación) inferior al 2%, excepto para el extremo correspondiente a la máxima dilución, en donde el error probable supera apenas ese valor y es de 2.2%. Para obtener esa precisión es necesario cuidar cada uno de los detalles de la técnica descripta, en particular, los siguientes: a) - Calibrar la pipeta con que se mide el volumen de la muestra (1 cc) asegurándose de que en su medición se cometen errores despreciables. Calibrar, también, el balón aforado de 100 cc. Por lo general estos balones son suficientemente exactos como para poder ser usados en un método fotométrico (error muy inferior al 0.5%). b - Construir las curvas de calibrado con standards suficientemente puros. c - Usar ácido pícrico purificada y controlado como se dice en las páginas 47 y 75. No es necesario medir el volumen de la solución de ácido pícrico con gran exactitud. Folin(52) empleaba probetas. Nosotros hemos usado pipetas de doble aforo. d - En cambio es imprescindible agregar una cantidad exactamente medida de álcali. Hay que cuidar, por un lado que la concentración sea realmente del 10%, y por el otro, que el volumen agregado sea exactamente 1.5 cc. para lo cual conviene emplear una bureta calibrada. La concentración del álcali tiene, en efecto, una gran influencia, tanto sobre el desarrollo del color (la fase de la reacción), como sobre los cambios, más o menos notables de su intensidad, que se producen después de diluir (2a. fase). e - Diluir con agua destilada hasta el aforo (100cc) exactamente 10 minutos después de agregar el álcali. Durante este intervalo se deja en reposo, después de mezclar bien. f - Realizar la medición fotométrica en un intervalo no mayor de 5 minutos contados a partir del instante en que se diluyó. g - Usar para cada concentración cubas de espesor adecuado, de modo que la transparencia no sea inferior a 10% ni superior a 63%. h - Llevar a cero el fotómetro antes de cada medición pues varía diariamente. Para eso se llenan ambas cubas con la solución de compensación, se fija la abertura del tambor de la izquierda de modo que corresponda a una trasparencia de 30.0% y se determina la transparencia aparente, accionando el tambor de la derecha. Se regula la iluminación incidente sobre una y otra cuba hasta que el promedio de las lecturas en el tambor derecho, de un error inferior al 1%, es decir, esté comprendido entre 29.7% y 30,3%. Solo después de haber llevado a cero de este modo se vacía la cuba izquierda, y se le llena con la solución problema, se fija su abertura en un valor correspondiente a 100.0% de transparencia y se hace la medición fotométrica manipulando el tambor derecho. i - Proceder para el dosaje exactamente del mismo modo que se procedió para el calibrado, en particular: usar el mismo filtro y las mismas cubas. -2- Hemos encontrado ventajoso el uso de las diversas soluciones en las proporciones del método de Folin de 1914(52) que también adoptaron Lieb y Zacherl(103). El método de Folin de 1904(35) tiene dos : a - La intensidad de la coloración es menor porque la concentración del alcali en la primera fase es mayor (ver cuadro de la página 27, línea S/Vl) (véase también: III - Desarrollo de la coloración después de agregar el áIcali, página 50). b - El fading después de diluir es mas pronunciado, porque la concentración del alcali y la del ácido son, entonces, menores. Consultése, por un lado el cuadro de la página 27, línea 10^3.S/V2 y 10^3.P/V2, y por el otro "IV-Fading en la solución diluída", pag. 54. El método de Edgar(85) tiene los mismos inconvenientes: a - por la misma razón (la concentración del álcali es aún mayor) b - porque, aunque la concentración del álcali es algo mayor que en el método de Folin de 1914, la concentración del ácido pícrico es mucho menor. (consultése el mismo cuadro, misma línea). -3- En cuanto a los standards, el picrato de creatinina tiene la ventaja de que su pureza puede controlarse fácilmente por presentar un punto de fusión nítido. Una muestra de picrato que funda a 205°, aunque no rigurosamente pura, puesto que su punto de fusión se eleva lentamente por cristalizaciones sucesivas, es suficientemente pura a los efectos de ser usada como standard es este método fotométrico, puesto que da, dentro de los límites de error del método, las mismas lecturas que un picrato que funde a 208° y que ha sido obtenido al cabo de quince cristalizaciones sucesivas. Este standard tiene, sin embargo dos inconvenientes de índole práctica. l) es muy poco soluble y 2) se disuelve con excesiva lentitud. De todos los standards el que nos resultó más práctico fue el cloruro de zinc-creatinina: es suficientemente soluble, se disuelve rápidamente, tiene un porcentaje muy pequeño de humedad, es muy poco higroscópico y nos resultó fácil obtenerlo al estado de pureza. Entre las páginas 35 y 45 se indican los métodos de preparación y purificación de los standards probados y se discuten sus ventajas e inconvenientes. -4- Comparando nuestros resultados, obtenidos empleando el filtro S50, con los que obtienen Lieb y Zacherl(103) empleando el filtro S53, podemos decir que, en nuestra opinión, siempre que se disponga de ambos filtros, es preferible el S53, que presenta dos ventajas principales: a - En su zona, el picrato alcalino no presenta absorción apreciable, lo que reduce los errores que pueden provenir de este reactivo. La absorción del picrato alcalino en la zona del S50, si bien no grande, es bien perceptible, lo cual nos obliga, por otra parte, a usar picrato alcalino en la cuba de compensación, mientras que Lieb y Zacherl usan agua destilada. b - En su zona, el coeficiente de extinción específico del color de Jaffé es casi rigurosamente constante, mientras que en la zona del S50 varía mucho, de tal modo que en la zona del S53, la concentración de la creatinina es mucho más aproximadamente proporcional al coeficiente de extinción. Sin embargo, como dijimos más arriba (Resumen 1 - pag.95) empleando el filtro S50, siempre que se tomen las precauciones allí indicadas, se puede dosar la creatinina, entre los límites de concentración también indicados, con errores probables inferiores al 2%. El filtro S50 tiene una ventaja con respecto al S53: el coeficiente de extinción específico en su zona es mayor que en la zona del S53. -5- En cuanto al dosaje de creatina (pag.79) hemos encontrado que procediendo en las condiciones del método de autoclave de Folin(86) pero calentando a 121°, en vez de 115-120° y durante 80 minutos, en vez de 20 minutos se obtiene una transformación de 98.4% de la creatina en creatinina. El error probable que obtuvimos empleando creatina 0.004% M fué de ±0.6%, muy parecido al obtenido dosando creatinina de igual concentración, que fué de ± 0.9%. Estos resultados, como puede verse en el cuadro de la página 89 son muy semejantes a los de Lambert(152) y muy superiores a los de Albanese y Wangerin(151). Debemos notar, sin embargo, que todos estamos de acuerdo con Albanese y Wangerin en que un calentamiento de 20 minutos (Folin), produce una transformación muy incompleta, y es precisamente Lambert quien obtiene los resultados más bajos al cabo de ese intervalo. -6- En lo que se refiere a la destrucción de la creatinina por calentamiento en presencia y en ausencia de ácido pícrico (pag. 91) nuestros resultados también concuerdan con los de Lambert y difieren de los de Albanese y Wangerin. Calentando creatinina 0.004 M., 80 minutos a 121°, en las condiciones en que se realiza el dosaje de creatina se destruyó solo un 2% de la creatinina mientras que calentando en la misma forma pero en ausencia de ácido pícrico, se destruyeron 34.3%. Estos resultados confirman las conclusiones de Lambert: que el método propuesto por Albanese y wangerin (página 87) debe dar, necesariamente, resultados altos para la creatina en presencia de cantidades considerablemente mayores de creatinina, con errores muy superiores a los del método de Folin. El método descrito en la página 79 para el dosaje de creatina, además de la ventaja de dar resultados perfectamente reproductibles, con una transformación casi cuantitativa en creatinina, presenta una seria de ventajas prácticas. a - Los reactivos son cualitativamente y cuantitativamente iguales que para el dosaje de la creatinina. La diferencia entre ellos es la mínima indispensable: calentamiento después de agregar el acido pícrico, para transformar la creatina en creatinina. Como la transformación es bastante completa (98.4%) para creatinina 0.004 M) y razonablemente reproductible (error probable de ± 0.6%) y como hemos comprobado que la creatinina preexistente solo se destruye en un 2.0% (para igual concentración, y con error probable de ±0.8%) es evidente que podemos usar para la creatina la misma curva de calibrado que para la creatinina, obteniéndola por diferencia entre la creatina encontrada después del calentamiento con ácido pícrico según se dice en la página 79 y la creatina preexistente, dosada según se dice en la página 33. Habrá que introducir tan solo pequeñas correcciones que dependen solamente de las únicas variables: las concentraciones de creatinina y creatina. Si ambas son próximas a 0.004 M., habrá que agregar a la creatinina encontrada después de calentar un 2.0% de la creatinina preexistente, y a la creatina obtenida por diferencia entre esta "creatinina total" (corregida) y la creatinina preexistente, habrá que agregarle un 1.6% a su valor, para obtener la creatina corregida. La primera de estas correcciones tiene en cuenta la destrucción de creatinina y la segunda corrige la incompleta transformación de la creatina en creatinina. Procediendo de este modo se evitan los errores provenientes de diferencias tanto en la calidad como en la cantidad de los reactivos agregados (en particular los errores resultandos del fading). b - Se acorta el tiempo de calentamiento de unas tres horas a solo 80 minutos. c - Se evita la necesidad de agregar piedra pómez u otro material para regularizar la ebullición, cosa necesaria en el método de ebullición del mismo Folin(52). d - Se evita la necesidad de filtrar y, con respecto al método de Lieb y Zacherl(103) la de diluir desde 15cc. hasta 25cc. después de la filtración. Todas estas operaciones son susceptibles de introducir errores más o menos importantes. Siendo tan sencillo este método, no vemos que haya razón alguna para preferir otra técnica (la de ebullición de Folin, por ejemplo(52)) siempre, por supuesto, que se disponga de un autoclave. Aun en el caso de no disponerse de autoclave, quizás fuera interesante probar el recurso de que se valen Kiefer y Germek(116) quienes calientan a temperatura aún más alta (155°) sin necesidad de autoclave, colocando la solución en tubos sellados, que introducen en~un baño de glicerina, manteniendo a 155°.