El estrés nutricional regula la supervivencia en todas las células eucariotas -de levaduras a mamíferos- y muchas de las vías de quinasas involucradas en esta regulación están conservadas como parte de una respuesta ancestral de regulación de la viabilidad celular ante escasez de sustratos. Aclarar los mecanismos de esta regulación es importante para comprender la biología del proceso y para indagar cómo es la señalización del mismo y su resultante en la “ejecución” de células tumorales, que son esencialmente sensibles a la falta de glucosa debido a sus características metabólicas. Los hepatocitos poseen una gran especialización en su metabolismo glucídico y resultan un modelo celular atractivo para estudiar la regulación de la supervivencia/muerte celular ante estrés por falta de glucosa. La utilización de la glucosa en las células de mamíferos depende de su metabolismo secuencial en la glucólisis seguida de la respiración mitocondrial y la contribución de cada una de estas etapas está determinada por el tipo celular y su estado, normal ó de transformación cancerígena. Por ejemplo, las células tumorales presentan una alta dependencia de los niveles de glucosa y la glucólisis anaeróbica es la principal fuente de energía. Por el contrario, en células normales como los hepatocitos la producción de energía es predominantemente a través de la fosforilación oxidativa. La restricción de glucosa desata vías regulatorias en las que están implicadas proteínas quinasas constituyendo una compleja red de regulación de la viabilidad en respuesta a la disponibilidad energética de la célula. Entre las proteínas quinasas involucradas, la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) y la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) intervienen en la regulación de la supervivencia celular y la apoptosis en respuesta a distintas señales metabólicas y de crecimiento. Dependiendo de la situación y del tipo celular, ambas proteínas pueden tener roles duales. PKA puede regular la supervivencia celular y apoptosis, teniendo efectos tanto pro como anti- supervivencia. Además, esta quinasa ha sido implicada en la regulación de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) a través de la modulación de la actividad de la cadena respiratoria mitocondrial en distintos tipos celulares de mamíferos y aun en los eucariotas más sencillos. Por su parte, la quinasa AMPK es clave en la adaptación celular al estrés energético, y la misma puede tener roles opuestos en la proliferación y la muerte celular: en algunos contextos promueve apoptosis y/o arresto de la proliferación, y en otros favorece la supervivencia. Los sistemas de señalización de AMPc regulan muchas de las mismas vías metabólicas de carbohidratos, lípidos, y metabolismo de proteínas que son reguladas por el sistema de señalización de AMPK. Existen conexiones entre ambas vías de señalización en músculo, hígado y tejido adiposo. Concretamente, se han identificado residuos de AMPK que son fosforilados por PKA, y de esta manera PKA es capaz de modular la actividad de dicha proteína. Sin embargo, aun con las evidencias que demuestran la modulación de la actividad de la quinasa AMPK por la quinasa PKA regulando así ciertas funciones metabólicas, nada se sabe hasta el momento de realización de este trabajo de tesis del rol que este cruce entre vías puede tener sobre la regulación de la supervivencia celular. En base a los antecedentes presentes en la literatura los Objetivos del trabajo de Tesis fueron, en primer lugar, estudiar los cambios en la supervivencia ante la falta de glucosa en hepatocitos normales y en células de hepatocarcinoma humano, HepG2; y en segundo lugar, analizar el rol de las quinasas PKA y/o AMPK en la regulación de dicho proceso. En la primera etapa de la tesis se realizaron estudios en cultivos primarios de hepatocitos de rata. En primer lugar caracterizamos la muerte celular inducida durante la restricción de glucosa en dichas células. Describimos que la ausencia de glucosa durante 6 horas en hepatocitos, induce la activación la vía mitocondrial de apoptosis, la cual es dependiente de la actividad de PKA y de su interacción con sus proteínas de anclaje. En segundo lugar, comenzamos a dilucidar los mecanismos que llevan a la activación de esta apoptosis y analizamos la participación de PKA en los mismos. Demostramos que la ausencia de glucosa produce un aumento temprano en los niveles de ROS de origen mitocondrial y que dicho evento es el causante de la activación apoptótica luego de 6 horas en ausencia de glucosa. Nuestros resultados indicaron además que la ausencia de glucosa en hepatocitos induce, de alguna manera, un aumento en los niveles de AMPc intracelular y mitocondrial llevando a un aumento en la señalización por PKA en ambos compartimientos. Demostramos que esta activación de PKA señaliza una represión en la expresión de genes de las enzimas antioxidantes Superóxido dismutasa y Catalasa. Por otro lado, PKA activada en mitocondria señaliza un aumento en la producción de ROS durante la respiración mitocondrial, probablemente regulando la actividad de alguno/os de los complejos respiratorios. Ambos eventos mediados por PKA intracelular y mitocondrial resultarían en una mayor acumulación de ROS y en la inducción de muerte apoptótica en ausencia de glucosa. Proponemos que esto constituiría un eje AMPc-PKA compartimentalizado en la mitocondria que podría gatillar el suicidio en las células eucarióticas en respuesta a la carencia de su fuente de carbono principal, la glucosa. Durante el desarrollo de la segunda etapa de la tesis estudiamos la supervivencia ante la falta de glucosa en células HepG2, y su modulación por AMPK y PKA. En primer lugar, demostramos que la ausencia de glucosa produce una pérdida de la viabilidad progresiva en estas células que es potenciada si las células son tratadas a la vez con el activador de AMPK, AICAR. Al analizar los procesos causantes de la disminución de la viabilidad en estas condiciones, observamos que la falta de glucosa induce no solamente muerte apoptótica y necrótica, sino también el arresto de la duplicación celular. En efecto, las células se detienen en fase G0/G1 del ciclo celular y dicho evento, según nuestros hallazgos, estaría mediado por el aumento en los niveles proteicos del inhibidor del ciclo celular, p21. Nuestros resultados, además, indicaron un aumento en la señalización de las quinasas PKA y AMPK durante la restricción de glucosa. Por otro lado corroboramos que la deprivación de glucosa induce tempranamente un desbalance en las especies reactivas del oxígeno también en estas células. En efecto, existe un aumento significativo de los niveles de ROS en las células HepG2 cultivadas en ausencia de glucosa desde las 6 horas que es impedido por la presencia del inhibidor de PKA H89. Estos datos soportan la hipótesis que la falta de glucosa que conduce a la muerte celular tiene un componente oxidativo que está asociado a la activación de PKA. En este sentido, la activación de PKA induce un aumento en los niveles de ROS y apoptosis, pero no tiene efectos en la proliferación. Por su parte, AMPK induce apoptosis y un arresto en la progresión del ciclo celular en fase G0/G1 a través de la inducción de p53-p21. En segundo lugar indagamos la posible interconexión entre las vías de señalización de PKA y AMPK. Nuestros resultados indicaron que la coactivación de ambas quinasas no produce ningún efecto en la muerte apoptótica, pero sin embargo, la activación de PKA contrarresta el efecto antiproliferativo de AMPK activada. Dicha prevención está asociada a la represión del aumento en los niveles proteicos de p21 inducido por la activación de AMPK. En concordancia con esto, demostramos que PKA fosforila a AMPK y de esta manera regula negativamente su activación. En resumen, los resultados indican que la falta de glucosa en células HepG2 involucra la señalización a través de estas dos vías de quinasas que regulan diferencialmente la muerte y la proliferación y que existe una interregulación entre AMPK y PKA controlando la expresión de proteínas claves para el arresto del ciclo celular. Así, el control del crecimiento tumoral en este tipo celular puede ser una resultante tanto de las intervenciones nutricionales que regulan la activación de estas quinasas como de los niveles hormonales capaces de modular las mismas.