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Existen numerosas evidencias en la literatura que demuestran que la exposición a situaciones de estrés durante el período de la gestacion produce alteraciones a largo plazo en los niveles de hormonas sexuales y en el desarrollo del sistema dopaminérgico de la descendencia. En nuestro laboratorio, empleando un modelo en la rata, observamos que dichas alteraciones en el sistema dopaminérgico variaban según si éstas se evaluaban antes o después de la adolescencia. Por otra parte, en el ser humano se ha demostrado ampliamente que varias psicopatologías tales como la esquizofrenia, adicciones a sustancias de abuso y depresión se desencadenan durante o hacia el final de la adolescencia. Definida como el período de transición entre la niñez y la vida adulta, la adolescencia es una etapa donde las hormonas gonadales ejercen sus efectos sobre los tejidos periféricos induciendo la aparición de los caracteres sexuales secundarios, pero también actúan centralmente influyendo sobre el remodelado y desarrollo final del cerebro. Teniendo en cuenta estos antecedentes hipotetizamos que el estrés prenatal estaría interfiriendo con el desarrollo del eje hipotálamo-hipófiso-gonadal, a la vez que modificaría la maduración del sistema dopaminérgico mesocórticolímbico deviniéndolo vulnerable a los cambios hormonales que ocurren durante la adolescencia. En este contexto, el objetivo general en el que se encuadra este trabajo de tesis consiste en avanzar sobre el conocimiento del rol de las hormonas gonadales masculinas sobre las alteraciones de la neurotransmision dopaminérgica en la cría estresada prenatalmente. En una aproximación hacia la evaluación de este objetivo se caracterizó el efecto del estrés prenatal sobre el eje reproductor masculino y sobre ciertos aspectos del sistema dopaminérgico, para por último intentar simular el efecto del estrés prenatal administrando prenatalmente a un antagonista del receptor de andrógenos: la flutamida. Mediante el empleo de un modelo de estrés prenatal por inmovilización de la madre durante la última semana de gestación en ratas Wistar, se evaluó la reactividad del sistema de estrés de las crías macho, al mismo tiempo que se estudiaron los efectos del estrés prenatal sobre diversos aspectos morfológicos, bioquímicos y moleculares del eje reproductor. En el mismo modelo, en crías macho prepuberales y adultas, se examinó la expresión de los receptores dopaminérgicos del tipo D2, de andrógenos y de estrógenos en diversas áreas cerebrales pertenecientes al sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico y se estudiaron las arborizaciones dendríticas en las mismas áreas. Finalmente mediante la administración de la flutamida durante la última semana de gestación, se estudió si la disminución perinatal en los niveles de andrógenos circulantes podría influir sobre el desarrollo del sistema dopaminérgico. Los resultados obtenidos mostraron que el estrés prenatal indujo modificaciones a largo plazo en los niveles de las hormonas pertenecientes al eje reproductor masculino. A su vez, el estrés prenatal modificó parámetros de la morfología sexual externa y de la histomofometría gonadal de la descendencia. Por su parte, los efectos del estrés gestacional sobre los receptores dopaminérgicos del tipo D2 y a hormonas sexuales presentes en el cerebro, mostraron variaciones conforme al área en la cual se estaba realizando la observación y a la edad de las crías, mientras que la reducción en las arborizaciones dendríticas inducida por el estrés prenatal se registró en todas las áreas evaluadas y en ambas edades. Por último demostramos que la administración prenatal de flutamida afecta la morfología sexual interna y externa de la descendencia, al mismo tiempo que induce alteraciones en parámetros morfológicos del sistema dopaminérgico mesocórtico-límbico. De esta manera, la manipulación prenatal de andrógenos mostró consecuancias similares a las observadas en individuos que habían recibido estrés prenatal, sugiriendo que uno de los mecanismos por los cuales el estrés gestacional podría interferir sobre el desarrollo del cerebro es mediante la alteración del rol organizacional de los andrógenos y la modulación del rol activacional de los mismos.

Tesis-Doctor en Medicina y Cirugía. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Córdoba. 2019

Tesis (Doctora en Neurociencias) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

Los niveles de dormición de las semillas de sorgo (Sorghum bicolor) determinan la susceptibilidad al brotado pre-cosecha (BPC), uno de los principales problemas agronómicos de este cultivo. Con este escenario en mente, el objetivo de este trabajo fue aproximarse a las bases moleculares de la regulación hormonal de la dormición de las semillas. En primer lugar, se clonó el gen vp1 de sorgo (Sbvp1) y un fragmento del gen de la GA20-oxidasa (SbGA20-ox). Estos genes están involucrados en el control de la sensibilidad al ácido abscícico (ABA)y en la síntesis de giberellinas (GAs), respectivamente. Utilizando un sistema experimental compuesto por dos líneas homocigotas de sorgo con comportamiento contrastante con respecto al BPC, se estudiaron las estructuras y funcionalidad de estos genes durante el desarrollo y la germinación de las semillas. Además, se determinó la posición del gen Sbvp1 en un mapa genético previamente construido. Los resultados muestran que los niveles de expresión del gen Sbvp1 durante el desarrollo de las semillas no permiten predecir el futuro comportamiento germinativo. Sin embargo, en condiciones favorables de germinación, la expresión de este gen resultó diferencialmente regulada en semillas con distintos niveles de dormición, correlacionando con la sensibilidad de los embriones al ABA. El análisis de segregación demostró que este gen no está ligado a ninguno de los QTLs para dormición previamente detectados. Esto permite proponer que este gen estaría involucrado río abajo en la cascada de señalizaciones que disparan la germinación de las semillas. Además, los resultados indican que el gen SbGA20-ox es diferencialmente regulado en cariopses con fenotipos de dormición contrastantes. El ABA inhibió la expresión de este gen durante la incubación de los embriones, implicando que esta hormona actúa antagónicamente a las GAs a través de la interferencia en su síntesis.

El mantenimiento de la homeostasis inmunológica durante el embarazo requiere múltiples circuitos de regulación a nivel local y sistémico que actúan en forma sincronizada desde el período post-implantatorio hasta el parto. Diversas poblaciones de células inmunes son reclutadas a la interfase materno-placentaria desde el inicio de la gestación y su función es modulada en gran medida por factores solubles y de contacto de las células trofoblásticas. Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases caracterizadas por distintos microambientes o perfiles predominantes. Una primera etapa proinflamatoria, asociada a los procesos de implantación y placentación temprana. Esta etapa involucra la ruptura del epitelio uterino, la invasión del endometrio por el blastocisto y la remodelación de los vasos maternos, necesaria para satisfacer la creciente demanda de oxígeno y nutrientes. Esta respuesta inflamatoria inicial está estrictamente controlada para mantener la homeostasis a través de la activación de respuestas antiinflamatorias y tolerogénicas. A continuación, pasadas las 14 semanas, se inicia la segunda fase con un cambio de perfil hacia uno predominantemente antiinflamatorio requerido para el crecimiento fetal. Finalmente, una tercera etapa mucho más corta en duración, se caracteriza por una respuesta proinflamatoria asociada al desencadenamiento del parto. Distintos mediadores solubles como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y hormonas regulan estos cambios de perfil, actuando sobre múltiples células blanco entre las cuales los monocitos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos T han sido extensamente estudiados. Entre los factores inmunomoduladores de síntesis local, es de particular interés el péptido intestinal vasoactivo (VIP), un péptido pleiotrópico que es sintetizado por células trofoblásticas, entre otras células de la interfase materno-placentaria. El objetivo de la presente tesis es investigar mecanismos celulares y moleculares que condicionan el fenotipo de los neutrófilos y su interacción con células trofoblásticas con especial foco en la participación del sistema VIP y sus receptores VPAC. Para abordar este objetivo se emplearon dos diseños principales, por un lado diseños in vitro con células humanas utilizando neutrófilos y monocitos de dadores sanos y líneas celulares derivadas de trofoblasto humano de primer trimestre (Swan-71 y HTR8-SVneo). Por otro lado, para profundizar en los efectos de VIP y sus receptores, se emplearon dos cepas de ratón genéticamente modificadas que no expresan los receptores VPAC1 o VPAC2 de dicho péptido. En primer lugar, demostramos que los neutrófilos humanos expresan ARN mensajero de los dos receptores VPAC1 y VPAC2. Observamos que el VIP y los medios condicionados de células trofoblásticas (MC) inhiben la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) inducidas por el forbol miristato acetato (PMA), con disminución en la liberación de ADN y elastasa. Esta disminución en la NETosis es acompañada por un aumento de la apoptosis. Más aún, vimos que el VIP y los MC inhiben la liberación de mieloperoxidasa inducida por PMA. Hallamos que el VIP y los MC de las dos líneas trofoblásticas Swan-71 y HTR8 disminuyen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por el PMA. A su vez, los efectos inhibitorios de liberación de ROS y ADN fueron prevenidos por un antagonista de receptores de VIP. Demostramos que tanto el VIP como los MC inhiben parcialmente la autofagia inducida por PMA. Por otra parte, el VIP y los MC aceleran la apoptosis espontánea de neutrófilos y revierten el efecto antiapoptótico del LPS. En cuanto al papel del VIP trofoblástico, observamos que los MC de células trofoblásticas deficientes en VIP no inducen el efecto proapoptótico sobre los neutrófilos. Asimismo, se observó una mayor fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por monocitos cuando los primeros habían sido cultivados con MC, comparado con aquellos incubados en RPMI. En la segunda parte de la tesis, estudiando las cepas deficientes en los receptores VPAC1 y VPAC2, encontramos que las cruzas VPAC1 KO x VPAC1 KO tienen una menor cantidad de crías al nacer, y la cruza VPAC2 KO x VPAC2 KO presenta la misma tendencia. También vimos en ambas cepas una asimetría marcada en la distribución de los sitios a lo largo del útero. Estos sitios presentan una menor expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ambas cruzas y las células trofoblásticas gigantes aisladas de los sitios tienen expresión alterada de factores relacionados con la angiogénesis: VEGF, angiopoyetina 1 y metaloproteinasa 9. Los sitios de implantación también presentan una alteración en factores relacionados a la regulación de la respuesta inmune como la proteína quimioatrayente de monocitos 1, el marcador F4/80 y el factor plaquetario 4. Finalmente, al aislar neutrófilos de hembras VPAC1 y VPAC2 knock out preñadas observamos que tienen alterada su tasa de apoptosis y su capacidad de modular estímulos activadores como el PMA. Los macrófagos también presentan diferencias en su perfil. Concluimos que factores liberados por las células trofoblásticas inhiben la activación de los neutrófilos y promueven su apoptosis. Los resultados indican que, entre dichos factores, el VIP liberado por las células trofoblásticas tiene un papel relevante y que otros factores producidos por estas células a través de mecanismos mediados por el VIP endógeno, también contribuyen a la desactivación.

El mantenimiento de la homeostasis inmunológica durante el embarazo requiere múltiples circuitos de regulación a nivel local y sistémico que actúan en forma sincronizada desde el período post-implantatorio hasta el parto. Diversas poblaciones de células inmunes son reclutadas a la interfase materno-placentaria desde el inicio de la gestación y su función es modulada en gran medida por factores solubles y de contacto de las células trofoblásticas. Desde el punto de vista inmunológico, el desarrollo del embarazo normal comprende tres fases caracterizadas por distintos microambientes o perfiles predominantes. Una primera etapa proinflamatoria, asociada a los procesos de implantación y placentación temprana. Esta etapa involucra la ruptura del epitelio uterino, la invasión del endometrio por el blastocisto y la remodelación de los vasos maternos, necesaria para satisfacer la creciente demanda de oxígeno y nutrientes. Esta respuesta inflamatoria inicial está estrictamente controlada para mantener la homeostasis a través de la activación de respuestas antiinflamatorias y tolerogénicas. A continuación, pasadas las 14 semanas, se inicia la segunda fase con un cambio de perfil hacia uno predominantemente antiinflamatorio requerido para el crecimiento fetal. Finalmente, una tercera etapa mucho más corta en duración, se caracteriza por una respuesta proinflamatoria asociada al desencadenamiento del parto. Distintos mediadores solubles como citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento y hormonas regulan estos cambios de perfil, actuando sobre múltiples células blanco entre las cuales los monocitos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos T han sido extensamente estudiados. Entre los factores inmunomoduladores de síntesis local, es de particular interés el péptido intestinal vasoactivo (VIP), un péptido pleiotrópico que es sintetizado por células trofoblásticas, entre otras células de la interfase materno-placentaria. El objetivo de la presente tesis es investigar mecanismos celulares y moleculares que condicionan el fenotipo de los neutrófilos y su interacción con células trofoblásticas con especial foco en la participación del sistema VIP y sus receptores VPAC. Para abordar este objetivo se emplearon dos diseños principales, por un lado diseños in vitro con células humanas utilizando neutrófilos y monocitos de dadores sanos y líneas celulares derivadas de trofoblasto humano de primer trimestre (Swan-71 y HTR8-SVneo). Por otro lado, para profundizar en los efectos de VIP y sus receptores, se emplearon dos cepas de ratón genéticamente modificadas que no expresan los receptores VPAC1 o VPAC2 de dicho péptido. En primer lugar, demostramos que los neutrófilos humanos expresan ARN mensajero de los dos receptores VPAC1 y VPAC2. Observamos que el VIP y los medios condicionados de células trofoblásticas (MC) inhiben la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) inducidas por el forbol miristato acetato (PMA), con disminución en la liberación de ADN y elastasa. Esta disminución en la NETosis es acompañada por un aumento de la apoptosis. Más aún, vimos que el VIP y los MC inhiben la liberación de mieloperoxidasa inducida por PMA. Hallamos que el VIP y los MC de las dos líneas trofoblásticas Swan-71 y HTR8 disminuyen la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por el PMA. A su vez, los efectos inhibitorios de liberación de ROS y ADN fueron prevenidos por un antagonista de receptores de VIP. Demostramos que tanto el VIP como los MC inhiben parcialmente la autofagia inducida por PMA. Por otra parte, el VIP y los MC aceleran la apoptosis espontánea de neutrófilos y revierten el efecto antiapoptótico del LPS. En cuanto al papel del VIP trofoblástico, observamos que los MC de células trofoblásticas deficientes en VIP no inducen el efecto proapoptótico sobre los neutrófilos. Asimismo, se observó una mayor fagocitosis de neutrófilos apoptóticos por monocitos cuando los primeros habían sido cultivados con MC, comparado con aquellos incubados en RPMI. En la segunda parte de la tesis, estudiando las cepas deficientes en los receptores VPAC1 y VPAC2, encontramos que las cruzas VPAC1 KO x VPAC1 KO tienen una menor cantidad de crías al nacer, y la cruza VPAC2 KO x VPAC2 KO presenta la misma tendencia. También vimos en ambas cepas una asimetría marcada en la distribución de los sitios a lo largo del útero. Estos sitios presentan una menor expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en ambas cruzas y las células trofoblásticas gigantes aisladas de los sitios tienen expresión alterada de factores relacionados con la angiogénesis: VEGF, angiopoyetina 1 y metaloproteinasa 9. Los sitios de implantación también presentan una alteración en factores relacionados a la regulación de la respuesta inmune como la proteína quimioatrayente de monocitos 1, el marcador F4/80 y el factor plaquetario 4. Finalmente, al aislar neutrófilos de hembras VPAC1 y VPAC2 knock out preñadas observamos que tienen alterada su tasa de apoptosis y su capacidad de modular estímulos activadores como el PMA. Los macrófagos también presentan diferencias en su perfil. Concluimos que factores liberados por las células trofoblásticas inhiben la activación de los neutrófilos y promueven su apoptosis. Los resultados indican que, entre dichos factores, el VIP liberado por las células trofoblásticas tiene un papel relevante y que otros factores producidos por estas células a través de mecanismos mediados por el VIP endógeno, también contribuyen a la desactivación.

El rol mitogénico de los estrógenos, actuando sobre sus receptores clásicos ERα y ERβ sobre los lactotropos, se encuentra bien documentado en la bibliografía. Sin embargo, se desconocía hasta el momento el rol del GPER sobre la función lactotropa. Por otro lado, el rol de la progesterona (P4) en la función normal y patológica del lactotropo es aún controversial. Postulamos que esta controversia puede deberse al uso de distintos modelos animales con diferentes entornos hormonales y a los receptores de P4 involucrados en las acciones de la misma. En los últimos años ha sido descripto un grupo de receptores de progesterona de membrana (mPRs), asociados a efectos rápidos, no genómicos, de la P4. Los mPRs (mPRα, -β, -γ, -δ y -ε) pertenecen a la familia de receptores de progestinas y adiponectinas (PAQR) y son receptores de 7 pasos transmembrana acoplados a proteínas G. Hasta el presente se desconoce la participación de los mismos en la regulación ejercida por P4 sobre el lactotropo. En el presente trabajo, demostramos que los mPRs se encuentran expresados en hipófisis, siendo mPRα y mPRβ los de mayor expresión. Llamativamente, un gran porcentaje de células adenohipofisarias mPRα-positivas resultaron ser también prolactina (PRL)-positivas (lactotropos). En búsqueda de la función de los mPRs en lactotropos, demostramos con el uso de un agonista selectivo de mPRα/β: Org OD 02-0 (10-etenil-19-norprogesterona), que la activación de mPRα inhibe la secreción de PRL (in vitro, ex vivo e in vivo). Estudiamos las vías de señalización intracelulares implicadas luego de la activación específica de mPRα describiendo un mecanismo novel mediado por TGFβ1, un potente inhibidor de la función lactotropa. Por otra parte, sabiendo que P4 actúa también a nivel hipotalámico, estudiamos la expresión y funcionalidad de los mPRs en la liberación de dopamina (DA). Nuestros resultados muestran una notable participación de dichos receptores (altamente expresados en hipotálamo) estimulando la secreción de DA, el factor inhibitorio por excelencia de la síntesis y secreción de PRL. Caracterizamos también la participación de los mPRs hipofisarios en condiciones patológicas. Encontramos, en tres modelos de prolactinoma (ratas DES, ratones hCGβ+ y ratones Drd2KO), que, si bien la expresión de los mPRs se encontraba disminuida respecto a sus contrapartes WT, la proporción relativa de mPRs respecto al total de receptores de P4 se encontraba significativamente incrementada en los prolactinomas. De hecho, un tratamiento agudo con Org OD 02-0 (in vivo y ex vivo) en ratones hembra Drd2KO fue capaz de reducir los elevados niveles de PRL en este modelo experimental de prolactinomas resistentes. Finalmente, observamos en el modelo experimental de prolactinoma generado en ratas tratadas crónicamente con estrógenos (ratas DES), que un tratamiento con P4 (4 semanas) sólo revertía los parámetros tumorales en aquellas hembras previamente ovariectomizadas (OVX). Esto podría deberse: i- al aumento significativo en la expresión hipofisaria de mPRα y mPRβ frente a una OVX (estudiamos la regulación que ejercen los esteroides ováricos sobre la expresión hipofisaria de los mPRs); ii- a que, como ya fuera mencionado, P4 inhibe PRL vía mPRs. Otro hallazgo interesante de este experimento fue la observación de que hembras que habían sido previamente OVX desarrollaban tumores de mayor tamaño (OVX-DES) respecto a las ratas intactas con tratamiento DES. Estos resultados nos llevaron a evaluar cómo se modificada la expresión de receptores clásicos y no clásicos de estrógenos luego de una OVX. Describimos por primera vez en la literatura la expresión y función del receptor de estrógenos acoplado a proteína G (GPER) en lactotropos. Ensayamos su regulación por estrógenos y progesterona, así como la alteración de su proporción frente a una ovariectomía, sugiriendo la implicancia de GPER en efectos proliferativos de los estrógenos en hembras OVX.

El rol mitogénico de los estrógenos, actuando sobre sus receptores clásicos ERα y ERβ sobre los lactotropos, se encuentra bien documentado en la bibliografía. Sin embargo, se desconocía hasta el momento el rol del GPER sobre la función lactotropa. Por otro lado, el rol de la progesterona (P4) en la función normal y patológica del lactotropo es aún controversial. Postulamos que esta controversia puede deberse al uso de distintos modelos animales con diferentes entornos hormonales y a los receptores de P4 involucrados en las acciones de la misma. En los últimos años ha sido descripto un grupo de receptores de progesterona de membrana (mPRs), asociados a efectos rápidos, no genómicos, de la P4. Los mPRs (mPRα, -β, -γ, -δ y -ε) pertenecen a la familia de receptores de progestinas y adiponectinas (PAQR) y son receptores de 7 pasos transmembrana acoplados a proteínas G. Hasta el presente se desconoce la participación de los mismos en la regulación ejercida por P4 sobre el lactotropo. En el presente trabajo, demostramos que los mPRs se encuentran expresados en hipófisis, siendo mPRα y mPRβ los de mayor expresión. Llamativamente, un gran porcentaje de células adenohipofisarias mPRα-positivas resultaron ser también prolactina (PRL)-positivas (lactotropos). En búsqueda de la función de los mPRs en lactotropos, demostramos con el uso de un agonista selectivo de mPRα/β: Org OD 02-0 (10-etenil-19-norprogesterona), que la activación de mPRα inhibe la secreción de PRL (in vitro, ex vivo e in vivo). Estudiamos las vías de señalización intracelulares implicadas luego de la activación específica de mPRα describiendo un mecanismo novel mediado por TGFβ1, un potente inhibidor de la función lactotropa. Por otra parte, sabiendo que P4 actúa también a nivel hipotalámico, estudiamos la expresión y funcionalidad de los mPRs en la liberación de dopamina (DA). Nuestros resultados muestran una notable participación de dichos receptores (altamente expresados en hipotálamo) estimulando la secreción de DA, el factor inhibitorio por excelencia de la síntesis y secreción de PRL. Caracterizamos también la participación de los mPRs hipofisarios en condiciones patológicas. Encontramos, en tres modelos de prolactinoma (ratas DES, ratones hCGβ+ y ratones Drd2KO), que, si bien la expresión de los mPRs se encontraba disminuida respecto a sus contrapartes WT, la proporción relativa de mPRs respecto al total de receptores de P4 se encontraba significativamente incrementada en los prolactinomas. De hecho, un tratamiento agudo con Org OD 02-0 (in vivo y ex vivo) en ratones hembra Drd2KO fue capaz de reducir los elevados niveles de PRL en este modelo experimental de prolactinomas resistentes. Finalmente, observamos en el modelo experimental de prolactinoma generado en ratas tratadas crónicamente con estrógenos (ratas DES), que un tratamiento con P4 (4 semanas) sólo revertía los parámetros tumorales en aquellas hembras previamente ovariectomizadas (OVX). Esto podría deberse: i- al aumento significativo en la expresión hipofisaria de mPRα y mPRβ frente a una OVX (estudiamos la regulación que ejercen los esteroides ováricos sobre la expresión hipofisaria de los mPRs); ii- a que, como ya fuera mencionado, P4 inhibe PRL vía mPRs. Otro hallazgo interesante de este experimento fue la observación de que hembras que habían sido previamente OVX desarrollaban tumores de mayor tamaño (OVX-DES) respecto a las ratas intactas con tratamiento DES. Estos resultados nos llevaron a evaluar cómo se modificada la expresión de receptores clásicos y no clásicos de estrógenos luego de una OVX. Describimos por primera vez en la literatura la expresión y función del receptor de estrógenos acoplado a proteína G (GPER) en lactotropos. Ensayamos su regulación por estrógenos y progesterona, así como la alteración de su proporción frente a una ovariectomía, sugiriendo la implicancia de GPER en efectos proliferativos de los estrógenos en hembras OVX.

El cuerpo lúteo (CL) es una glándula endócrina transitoria esencial para lasupervivencia e implantación del embrión. Es por esto que su formación, función yregresión están estrictamente reguladas a través de diversas vías de señalización. En estatesis se estudió el rol de los sistemas Notch y Wnt/β-catenina sobre el desarrollo yfunción del CL de ratas. También se analizó la interacción de ambas vías con la acciónde la progesterona.El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitrodel sistema Notch y su interacción con progesterona en cultivo de cuerpo lúteo de rata.Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Cuatro días después, los animales sufrieron eutanasia. Se aislaron losCLs y se cultivaron en presencia de Aminoglutetimida (AG, inhibidor de la síntesis deprogesterona), DAPT (inhibidor del sistema Notch), progesterona, de DAPT enpresencia de progesterona, o vehículo de las drogas (DMSO). Luego de una o 4 horas decultivo, se recolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidadluteal midiendo la concentración de progesterona en el medio. Se evaluó laparticipación del sistema Notch y de progesterona en cuanto al contenido de proteínaspro- y anti-apoptóticas, regulación de las enzimas esteroidogénicas, contenido de PCNA(marcador de proliferación) y nivel de fosforilación de AKT y ERK.DAPT produjo una disminución de la producción de progesterona. A su vez se observóuna disminución en el contenido luteal de la enzima P450scc. La presencia deprogesterona en el medio de cultivo aumentó los niveles de StAR, efecto que fueimpedido al inhibir la vía de Notch. El cultivo con DAPT produjo un aumento de larelación entre proteínas pro:anti-apoptóticas y un aumento del fragmento activo decaspasa 3. Este aumento en la apoptosis fue revertido con la presencia de progesteronaen el medio de cultivo. Para determinar la proliferación de células del CL, se cuantificóel contenido de PCNA. Progesterona incrementó significativamente los niveles deResumen2PCNA, y este aumento fue impedido por DAPT. Además, DAPT disminuyó lafosforilación de AKT, la cual se restituyó con la incubación junto a progesterona.Los resultados de este capítulo muestran por primera vez la existencia de unainteracción entre Notch y progesterona que promueve la función y supervivencia delCL.El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la implicancia dela vía Wnt/β-catenina en la función del ovario de ratas superovuladas.Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG, día en que los animales fueron operados. A un grupo se le administróbajo la bursa de ambos ovarios un inhibidor específico de la vía Wnt/β-catenina(XAV939), mientras que el grupo control recibió la dosis equivalente del vehículo delinhibidor (DMSO). Lo animales sufrieron eutanasia 24 o 48 horas luego de la cirugía.Se estudió el desarrollo folicular y la formación de CL en ovarios de cada grupoexperimental y se evaluó también la concentración de progesterona sérica. En extractoproteico de CLs se midió el contenido de proteínas pro- y anti-apoptóticas, de enzimasesteroidogénicas y de PCNA. Además, se determinó el grado de fosforilación de lasproteínas AKT y ERK. Por último, se cuantificaron los niveles de VEGF luteal y seestudió el desarrollo vascular del CL mediante marcación con lectina BS-1.La inhibición in vivo de la vía Wnt/β-catenina produjo una disminución en el porcentajede CLs, efecto que estuvo acompañado por la aparición de estructuras quísticas. Laconcentración de progesterona sérica disminuyó en los animales tratados con XAV939,como así también el contenido luteal de la proteína StAR. La administración deXAV939 aumentó el balance entre proteínas pro:anti-apoptóticas, incrementando laapoptosis en células del CL. A su vez, XAV939 disminuyó los niveles de ERKfosforilado y el contenido de PCNA en CL. Además, la inhibición de la vía Wnt/β-catenina disminuyó el porcentaje de área endotelial en CL y redujo el contenido lutealde VEGF. La doble marcación para PCNA y lectina reveló que la mayoría de las célulasproliferativas son las endoteliales. Estos resultados demuestran por primera vez que lavía Wnt/β-catenina está involucrada en el proceso de ovulación y funcionalidad lutealde ratas prepúberes tratadas con gonadotrofinas.El tercer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitro delsistema Wnt/-catenina sobre la expresión de miembros del sistema Notch.Resumen3Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horasdespués con hCG. Dos días luego de la administración de hCG, los animales sufrieroneutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de ICG-001 o soluciónvehículo (DMSO). El ICG-001 es un inhibidor de la vía de Wnt/β-catenina con unmecanismo de acción distinto al de XAV939. Luego de 12 horas de cultivo, serecolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidad lutealmidiendo la concentración de progesterona en el medio. En extractos de ARN de CLs seestudió la expresión de miembros del sistema Notch, y en extractos proteicos se midióel contenido de la proteína StAR.ICG-001 disminuyó la producción de progesterona y el contenido de la proteína StAR,reproduciendo el resultado observado con XAV939 en el capítulo II. Además, lainhibición de la vía Wnt/β-catenina produjo un aumento de la expresión génica delreceptor notch1, del ligando jagged1, del efector hes1 y del regulador rbpjκ. Losresultados de este capítulo muestran que, ante la inhibición de Wnt/β-catenina, lascélulas del CL promueven la activación de la vía de Notch, posiblemente comomecanismo compensatorio para recuperar la homeostasis celular.Los resultados de esta tesis demuestran que los sistemas Notch y Wnt/β-catenina estánimplicados en la regulación del desarrollo y función del CL de rata. A su vez, revelan laexistencia de una interacción entre estas vías y la progesterona que promueve lafuncionalidad luteal.

El cuerpo lúteo (CL) es una glándula endócrina transitoria esencial para la supervivencia e implantación del embrión. Es por esto que su formación, función y regresión están estrictamente reguladas a través de diversas vías de señalización. En esta tesis se estudió el rol de los sistemas Notch y Wnt/β-catenina sobre el desarrollo y función del CL de ratas. También se analizó la interacción de ambas vías con la acción de la progesterona. El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitro del sistema Notch y su interacción con progesterona en cultivo de cuerpo lúteo de rata. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horas después con hCG. Cuatro días después, los animales sufrieron eutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de Aminoglutetimida (AG, inhibidor de la síntesis de progesterona), DAPT (inhibidor del sistema Notch), progesterona, de DAPT en presencia de progesterona, o vehículo de las drogas (DMSO). Luego de una o 4 horas de cultivo, se recolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidad luteal midiendo la concentración de progesterona en el medio. Se evaluó la participación del sistema Notch y de progesterona en cuanto al contenido de proteínas pro- y anti-apoptóticas, regulación de las enzimas esteroidogénicas, contenido de PCNA (marcador de proliferación) y nivel de fosforilación de AKT y ERK. DAPT produjo una disminución de la producción de progesterona. A su vez se observó una disminución en el contenido luteal de la enzima P450scc. La presencia de progesterona en el medio de cultivo aumentó los niveles de StAR, efecto que fue impedido al inhibir la vía de Notch. El cultivo con DAPT produjo un aumento de la relación entre proteínas pro:anti-apoptóticas y un aumento del fragmento activo de caspasa 3. Este aumento en la apoptosis fue revertido con la presencia de progesterona en el medio de cultivo. Para determinar la proliferación de células del CL, se cuantificó el contenido de PCNA. Progesterona incrementó significativamente los niveles de PCNA, y este aumento fue impedido por DAPT. Además, DAPT disminuyó la fosforilación de AKT, la cual se restituyó con la incubación junto a progesterona. Los resultados de este capítulo muestran por primera vez la existencia de una interacción entre Notch y progesterona que promueve la función y supervivencia del CL. El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la implicancia de la vía Wnt/β-catenina en la función del ovario de ratas superovuladas. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horas después con hCG, día en que los animales fueron operados. A un grupo se le administró bajo la bursa de ambos ovarios un inhibidor específico de la vía Wnt/β-catenina (XAV939), mientras que el grupo control recibió la dosis equivalente del vehículo del inhibidor (DMSO). Lo animales sufrieron eutanasia 24 o 48 horas luego de la cirugía. Se estudió el desarrollo folicular y la formación de CL en ovarios de cada grupo experimental y se evaluó también la concentración de progesterona sérica. En extracto proteico de CLs se midió el contenido de proteínas pro- y anti-apoptóticas, de enzimas esteroidogénicas y de PCNA. Además, se determinó el grado de fosforilación de las proteínas AKT y ERK. Por último, se cuantificaron los niveles de VEGF luteal y se estudió el desarrollo vascular del CL mediante marcación con lectina BS-1. La inhibición in vivo de la vía Wnt/β-catenina produjo una disminución en el porcentaje de CLs, efecto que estuvo acompañado por la aparición de estructuras quísticas. La concentración de progesterona sérica disminuyó en los animales tratados con XAV939, como así también el contenido luteal de la proteína StAR. La administración de XAV939 aumentó el balance entre proteínas pro:anti-apoptóticas, incrementando la apoptosis en células del CL. A su vez, XAV939 disminuyó los niveles de ERK fosforilado y el contenido de PCNA en CL. Además, la inhibición de la vía Wnt/β- catenina disminuyó el porcentaje de área endotelial en CL y redujo el contenido luteal de VEGF. La doble marcación para PCNA y lectina reveló que la mayoría de las células proliferativas son las endoteliales. Estos resultados demuestran por primera vez que la vía Wnt/β-catenina está involucrada en el proceso de ovulación y funcionalidad luteal de ratas prepúberes tratadas con gonadotrofinas. El tercer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la acción in vitro del sistema Wnt/ß-catenina sobre la expresión de miembros del sistema Notch. Se utilizaron ratas prepúberes inyectadas de forma subcutánea con eCG y 48 horas después con hCG. Dos días luego de la administración de hCG, los animales sufrieron eutanasia. Se aislaron los CLs y se cultivaron en presencia de ICG-001 o solución vehículo (DMSO). El ICG-001 es un inhibidor de la vía de Wnt/β-catenina con un mecanismo de acción distinto al de XAV939. Luego de 12 horas de cultivo, se recolectaron los CLs y los medios condicionados. Se estudió la funcionalidad luteal midiendo la concentración de progesterona en el medio. En extractos de ARN de CLs se estudió la expresión de miembros del sistema Notch, y en extractos proteicos se midió el contenido de la proteína StAR. ICG-001 disminuyó la producción de progesterona y el contenido de la proteína StAR, reproduciendo el resultado observado con XAV939 en el capítulo II. Además, la inhibición de la vía Wnt/β-catenina produjo un aumento de la expresión génica del receptor notch1, del ligando jagged1, del efector hes1 y del regulador rbpjκ. Los resultados de este capítulo muestran que, ante la inhibición de Wnt/β-catenina, las células del CL promueven la activación de la vía de Notch, posiblemente como mecanismo compensatorio para recuperar la homeostasis celular. Los resultados de esta tesis demuestran que los sistemas Notch y Wnt/β-catenina están implicados en la regulación del desarrollo y función del CL de rata. A su vez, revelan la existencia de una interacción entre estas vías y la progesterona que promueve la funcionalidad luteal.