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Objetivo general Estudiar los efectos y vías de señalización involucradas en el preacondicionamiento isquémico (PI) y postacondicionamiento isquémico (POS) en corazones de ratas hipertensas espontáneas (SHR) sometidas a protocolos isquemia-reperfusión. Objetivos específicos 1.- Examinar los efectos del PI (con 1 y 3 ciclos) y POS sobre el tamaño infarto y la función miocárdica postisquémica en corazones aislados de SHR sometidos a 45 min de isquemia global y 60 min de reperfusión. 2.- Determinar el papel de la enzima glucógeno sintetasa quinasa 3β (GSK-3 β), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, utilizaremos una herramienta farmacológica como es el inhibidor específico de GSK-3β, indirubina- 3-monoxima5-yodo (IMI). 3.- Evaluar la participación de la fosfatidilinositol-3'-quinasa (PI3K/Akt), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, usaremos como herramienta farmacológica a la wortmanina, inhibidor de PI3K/Akt. 4.- Estudiar el rol de la isoforma ε de la proteína quinasa C (PKCε), en el citosol y en la mitocondria, en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, utilizaremos como herramienta farmacológica a la celeritrina, inhibidor de PKC. 5.- Estudiar la participación del poro de permeabilidad transitoria de la mitocondria (PPTM) en los efectos de las intervenciones aplicadas. Para ello, se usará la ciclosporina A (CsA), inhibidor específico de la ciclofilina D (componente citosólico del PPTM) para evitar la formación del poro. 6.- Evaluar la sensibilidad del PPTM al calcio en una suspensión de mitocondrias aisladas de corazones sometidos a los distintos protocolos. 7.- Evaluar el daño oxidativo analizando en homogenatos de corazones sometidos a los distintos protocolos, la peroxidación lipídica y el contenido de glutatión reducido (GSH). 8.- Determinar las posibles asociaciones físicas de P-GSK-3β y P- PKCε con el canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC) de la mitocondria en el PI y POS.

El comportamiento motor condicionado realizado mediante el uso del test de entrenamiento circular (TEC) produce una reducción significativa en la fosforilación endógena de la proteina GAP-43/B-50 en el estriado contralateral al sentido de giro. La magnitud de este cambio asimétrico es del 29,3 % respecto al estriado control y del 29,5% respecto del estriado ipsilateral proveniente de los mismos animales entrenados. Los animales controles no mostraron diferencias asimétricas entre estriado izquierdo vs. derecho o ipsi vs. contralateral. Estos cambios ocurren 30 minutos después de finalizada la actividad fisiológica en el TEC, y son independientes de la dirección de giro elegida. Estudios paralelos de western blot de GAP-43 y ensayos de fosforilación exógena usando PKC purificada demuestran que esta fosfoproteína participa a través de una disminución en su estado de fosforilación en el residuo Ser-41 (sitio específico de PKC). Estos cambios plásticos solo se producen cuando los animales son entrenados a los 30 días de edad (período crítico). El entrenamiento de animales de 20, 40 y 60 días de edad no produce cambios en estos marcadores neuroquímicos. A los 30 días la caída en la fosforilación in vitro de la GAP-43 se correlaciona con la velocidad desarrollada durante el TEC. Además de estos cambios los animales entrenados también muestran una inducción del mRNA del proto-oncogén c-fos entre los 30 y 60 minutos después de finalizada la actividad. La realización de una segunda prueba motora, el test de plataforma giratoria (TPG) confirma los cambios observados a los 30 días en la fosforilación in vitro de la GAP-43 y en la actividad total de PKC, y demuestran que la caída en la fosforilación de la GAP-43 es proporcional a la velocidad de giro. Estudios cinéticos demuestran las características plásticas de la fosforilación in vitro de la GAP-43, de la actividad total de PKC y de la capacidad de unión del ligando del receptor muscarínico ³H-QNB. Estudios previos realizados por nuestro laboratorio demostraron que a los 30 días del desarrollo postnatal del estriado cambios permanentes en los niveles de receptores mACh y dopaminérgicos D1 y D2 son producidos como consecuencia de la actividad motora fisiológica. Los cambios inmediatos en estos marcadores generales de plasticidad neuronal podrían representar los pasos iniciales que conducen al establecimiento de cambios plásticos de largo plazo. Además estos marcadores sugieren la participación de mecanismos plásticos durante el “período crítico” en el cual se generan los cambios permanentes. Estos resultados demuestran la participación de la fosforilación de la GAP-43 en los mecanismos plástico dependientes de la actividad motora durante un período crítico del desarrollo estriatal.

La quiescencia miometrial es un requerimiento fundamental de todas las especies para llegar al término de la gestación. La falla en el mantenimiento de la relajación uterina a menudo provoca parto prematuro, una de las principales causas de morbilidad y mortalidad fetal. En este trabajo se investigó el efecto de la progesterona (P4), hormona responsable del mantenimiento de la quiescencia de la musculatura lisa uterina, sobre factores que suprimen o estimulan la actividad contráctil miometrial como el óxido nítrico (NO), el GMPc y las prostaglandinas (PGs). Se estudió el perfil de síntesis de NO y la expresión de las isoformas de NOS uterinas durante la preñez temprana, media y tardía, observándose que la actividad Ca independiente y el nivel proteico de la NOsintasa inducible (iNOS) y la NOS endotelial (eNOS) estaban aumentados durante la gestación y descendían antes del parto. Estos hallazgos mostraron una relación temporal entre los niveles de NO producido por el útero gestante y las concentraciones de P4 sérica. La administración de RU-486, antagonista de la P4, produjo una disminución de la actividad de las NOS y del nivel proteico de la iNOS, mientras que el tratamiento con P4 en los días previos al parto, provocó un incremento en la síntesis de NO y en el nivel proteico de la iNOS. Estos hallazgos muestran que la P4 podría modular la producción de NO durante la preñez. La P4 aumentó la acumulación de GMPc,hecho que fue abolido en parte por la incubación con Aminoguanidina, inhibidor selectivo de la iNOS, sugiriendo que el efecto de la P4 sobre el NO trasciende al GMPc. La producción de PGF2α y PGE2; se encontró disminuida durante la preñez, como así también el nivel proteico de las Ciclooxigenasas (COX) 1 y 2. La P4 inhibió significativamente la liberación uterina de PGF2α y PGE2 y el nivel proteico de la COX-2. A pesar que durante la preñez se detectó baja actividad de la PLA;secretoria, enzima que libera el sustrato de las PGs, no se observó una modulación de la misma por la P4. El metabolismo de la PGF2α evaluado por la actividad de PG dehidrogenasa (PGDH), resultó incrementado durante la preñez y por la administración de progesterona. Estos resultados nos indican que los niveles de PGs estarían modulados negativamente por la progesterona, que actuaría aumentando su metabolismo a través de la PGDH e inhibiendo las COX. Cuando se estudió la posible interrelación entre los sistemas de NO y PGs se observó que la administración in vivo de un inhibidor selectivo de la COX-2 redujo el efecto del RU-486 sobre la síntesis de NO y que las PGs in vitro inhibían la actividad de la NOS. Por otro lado un dador de NO fue capaz de aumentar la síntesis de PGE2 sin modificar la de PGF2α. Estos datos nos permiten sugerir la existencia de una interrelación entre el NO y las PGs en el útero de la rata gestante. Este trabajo demuestra que la progesterona es capaz de modular la síntesis de las principales moléculas involucradas en la regulación de la contractilidad uterina durante la gestación.

Las hipótesis para el estudio de las bases neurobiológicas del aprendizaje y la memoria consideran que la información es almacenada por el sistema nervioso como cambios en las conexiones entre neuronas. Estos cambios son el resultado de un proceso de transformación inducido por la experiencia y dirigido en cada neurona por la activación de las vías de transducción, que por medio de la accion de quinasas, regulan cambios de corto término y la expresión de genes responsables de los cambios perdurables que subyacen la memoria de largo término. En la presente tesis se estudió la participación de la proteína quinasa dependiente de AMP-cíclico (PKA) en la formación de una memoria de largo término y aspectos de su activación fueron estudiados en estrecha relación con la experiencia y el tipo de memoria inducido. Con este objetivo se utilizó el paradigma de memoria contexto-señal del cangrejo Chasmagnathus granulatus, en el cual el animal aprende a reconocer la inocuidad de un estímulo inicialmente peligroso. Ante la falta de conocimiento previo sobre esta vía de transducción en crustáceos, se estudió la distribución de la actividad basal y total de PKA en sistema nervioso de cangrejo y se identificó y caracterizó a las isoformas I y II de la misma. Mediante la administración de un inhibidor de PKA, a distintos tiempo respecto del entrenamiento, se determinó la existencia de dos períodos en los cuales la actividad de PKA es fundamental para la consolidación. El primero durante el entrenamiento y el segundo en una ventana temporal entre 4 y 8 horas después del mismo. La medición de la actividad de PKA durante la consolidación permitió comprobar que la activación de PKA es parte de los mecanismos de la consolidación directamente inducidos por la experiencia. Se determinó que durante el segundo período de dependencia de PKA para la consolidación existe un aumento de la isoforma de PKA más sensibles al AMPc, PKA I, que estaría involucrado en el aumento de actividad de PKA necesario durante esa etapa de la consolidación. Finalmente, se estudió que aspectos temporales y mecanísticos de la activación de PKA son función específica de la activación inducida por distintas experiencias. La participación diferencial de isoformas de PKA es sugerida.

La forma típica del síndrome urémico hemolítico (D+SUH) es una microangiopatía trombótica caracterizada por anemia hemolítica con fragmentación de eritrocitos, trombocitopenia con agotamiento de la función plaquetaria y daño renal agudo. Esta enfermedad es la principal causa de daño renal en la población pediátrica y nuestro país presenta la mayor incidencia del mundo. Si bien la mortalidad es baja debido a las terapias de soporte empleadas en el tratamiento de los síntomas, existe una alta proporción de niños (hasta un 50%) que puede presentar secuelas renales y neurológicas. El D+SUH se desarrolla luego de la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas con bacterias productoras de una exotoxina denominada toxina Shiga (Stx). La bacteria coloniza el intestino, y comienza a producir la toxina que pasa a la circulación y se une a un receptor (Gb3) en los tejidos blanco (principalmente el riñón), donde se internaliza e inhibe la síntesis de proteínas. Si bien la Stx es absolutamente necesaria para el desarrollo de la enfermedad, existen evidencias que demuestran que el sistema inflamatorio puede influenciar el curso del D+SUH. El objetivo de esta tesis fue determinar la importancia de distintos componentes centrales de la respuesta inflamatoria como los neutrófilos (PMNs), las plaquetas y el óxido nítrico (NO) en la fisiopatología del SUH en un modelo murino por inyección endovenosa de la variante tipo 2 de la Stx (Stx2) pura. Asimismo, se investigó el estado de activación y funcionalidad de los PMNs periféricos de pacientes cursando el período agudo del D+SUH y luego de la recuperación clínica. Los resultados mostraron una disminución en la muerte y daño renal de los animales inyectados con Stx2 en ausencia de PMNs. Sin embargo, la depleción de plaquetas no tuvo ninguna influencia en estos aspectos. En los animales inyectados con Stx2 se observó una marcada neutrofilia, la cual correlacionó con el daño renal. Estos PMNs periféricos poseían mayor capacidad citotóxica, adhesión a la vasculatura y expresión del marcador de activación CD1lb. Estos datos evidencian una activación de los PMNs luego de la inyección de la Stx2 y demuestran la importancia de este tipo celular en el desarrollo del SUH como un factor de exacerbación del daño. Por otra parte, también se demostró una activación plaquetaria termprana en respuesta a la Stx2, con una inhibición posterior por agotamiento, similar a la observada en los pacientes. La inhibición de la producción de NO provocó un aumento del daño renal y la mortalidad inducidos por la Stx2. Estos fenómenos fueron mediados, al menos en parte, por una mayor activación plaquetaria en ausencia de NO. Los estudios histológicos apoyaron estos hallazgos y evidenciaron, por primera vez, la formación de coágulos intraglomerulares en los animales tratados con Stx2. Estos resultados sugieren un papel protector del NO en la fisiopatologia del SUH, mediado por su acción antitrombótica e inhibitoria de la activación plaquetaria. El estudio de los PMNs de los pacientes con D+SUH reveló una disminución en los marcadores de activación FcyRIII (CD16) y CD1lb, y en el marcador de degranulación mieloperoxidasa (MPO) y una menor respuesta citotóxica dependiente de anticuerpos y de degranulación con respecto a una población de niños sanos. Los PMNs de los pacientes presentaron una disminución del FcyRIII, la MPO y las respuestas citotóxicas con respecto a una población de niños con neutrofilia no relacionada con el D+SUH, aunque la capacidad de respuesta de degranulación entre ambas poblaciones fue muy similar. El fenotipo y funcionalidad de los PMNs de los pacientes en el momento en que acuden al hospital indica que este tipo celular se encuentra parcialmente agotado, debido a un fenómeno de activación previo. Probablemente, los efectos de la toxina sobre los PMNs sean indirectos y mediados a través de la activación y daño endotelial, ya que en nuestras condiciones y por distintas metodologías, la Stx fue incapaz de unirse y/o de causar ningún efecto en PMNs provenientes de individuos adultos normales. En conclusión, en este trabajo pudimos demostrar el papel central y modulador de distintos componentes de la respuesta inflamatoria en la fisiopatología del SUH.

Fil:Vitale, María Leiza. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La mayoría de los genes eucariotas por la ARN polimerasa II dan lugar a ARN mensajeros “inmaduros” o precursores (pre-ARNm) que contienen exones e intrones. El splicing es el proceso mediante el cual los intrones son escindidos de sus exones flanqueantes y los exones son posteriormente religados para dar lugar a ARN mensajeros maduros (ARNm). Este proceso es llevado a cabo por el spliceosoma, un mega complejo ribonucleoproteico compuesto por cinco partículas denominadas “snRNPs” (U1, U2, U4, U5 y U6) y factores proteicos asociados. Cada snRNP está formado por un ARN pequeño nuclear (snRNA), un set común de proteínas Sm o LSm y un número variable de proteínas específicas de cada partícula. El spliceosoma no existe formado como tal en el núcleo celular sino que se ensambla de novo a partir de sus componentes, de manera precisa y ordenada, sobre cada región del pre-ARNm que debe ser escindida reconociendo secuencias específicas que determinan los sitios de splicing. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron que el factor de splicing SRSF1 es también un regulador de la vía de SUMOilación, ejerciendo una actividad de tipo E3 ligasa. Estos resultados nos condujeron a explorar una posible conexión entre las maquinarias de SUMO y splicing, hipotetizando que la conjugación a SUMO podría modular la dinámica del proceso de splicing al afectar las interacciones entre proteínas y entre éstas y el ARN. En este trabajo, hemos hallado que el agregado de la proteasa de SUMO SENP1 disminuye la eficiencia de splicing in vitro. Por otra parte, el análisis por espectrometría de masa de proteínas inmunoprecipitadas con un anticuerpo anti-SUMO a partir de complejos spliceosomales purificados a distintos tiempos de la reacción de splicing nos permitió identificar diversas proteínas componentes del spliceosoma como sustratos de SUMOilación. Enfocándonos en una de ellas, la proteína componente del di-snRNP U4/U6 Prp3, detectamos su SUMOilación en células en cultivo y, mediante mutagénesis dirigida, hallamos que las lisinas 289 y 559 son sitios de conjugación de SUMO dentro de esta proteína. Observamos que la doble mutante Prp3 K289/559R, deficiente en SUMOilación, no interacciona con los snRNAs U2 y U5 ni con las proteínas spliceosomales SF3a1 (componente del snRNP U2) y Snu 114 (componente del U5 snRNP) a diferencia de la versión salvaje de Prp3, pero sí interacciona con proteínas y snRNAs componentes del di-snRNP. Estos resultados sugieren que el ensamblado de esta partícula (U4/U6) es independientemente de la conjugación de SUMO a Prp3 pero que sin embargo, esta modificación post-traduccional es necesaria para la interacción de Prp3 con las partículas snRNPs de las que ella no forma parte (U2, U5). Además, la versión mutante de Prp3 no logra rescatar los niveles de eficiencia de splicing de pre-ARN mensajeros cuando es sobre-expresada en células en cultivo, en comparación a la versión salvaje (wild type), en un contexto de silenciamiento de la proteína endógena. Experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina sugieren que esto responde a un menor reclutamiento de la versión mutante a regiones intrónicas en el ADN, comparada con la versión salvaje, durante el splicing co-transcripcional. Estos hallazgos proponen que la conjugación de SUMO juega un papel importante en el proceso de splicing y sugieren que la SUMOilación de Prp3 participa en la formación o reclutamiento del trisnRNP durante el ensamblado del spliceosoma.

Las poblaciones celulares en un organismo están estrictamente controladas por el balance de señales complejas que estimulan o inhiben la proliferación, diferenciación y sobrevida de las células. Existen evidencias experimentales que sugieren que las especies reactivos del oxigeno estón involucradas en el desarrollo del cancer. El primer objetivo de este trabajo fue evaluar la participación de las especies reactivos del oxígeno en los mecanismos de proliferación y transformación celular y modular los niveles de estas especies a fin de inhibir la proliferación y de esta forma controlar el crecimiento tumoral. Los resultados demostraron que existe un aumento de la actividad de superóxido dismutasa y una disminución de los niveles de catalasa y glutatión peroxidasa, enzimas disipadoras de peróxido de hidrógeno, en función de la malignidad. Este desbalance enzimótico se correlacionó con aumento de la producción de peróxido de hidrógeno. La disipación de peróxido de hidrógeno de manera exógena mediante tratamientos con catalasa inhibió la proliferación en líneas celulares de diversos orígenes tisulares y de organismos diferentes, lo que sugiere que la participación del peróxido de hidrógeno en el control de la proliferación sería un fenómeno general. Por otro lado, tratamientos con catalasa inhibieron el desarrollo de tumores experimentales. En concordancia con estos resultados, se demostró que la transfección estable del cDNA de la catalasa en una línea celular tumoral humana, disminuyó la tasa de proliferación y revirtió características de fenotipo maligno. Con respecto a los mecanismos de la inhibiciónde proliferación por secuestro de peróxido de hidrógeno, se demostró aumento de los niveles de óxido nítrico en los tratamientos con catalasa, sugiriendoa esta especie como un posible mediador de esta vía. Por otro lado, dado que la radioterapia constituye junto a la quimioterapia una de las principales formas de tratamiento contra el crecimiento tumoral, el segundo objetivo de esta tesis fue la caracterización de la radiosensibilidad intrínseca de líneas celulares con diferente grado de malignidad, de la respuesta celular a diferentes tipos de radiaciones ionizantes y el estudio del efecto del óxido nítrico como posible radiosensibilizador selectivo de las células tumorales. Los estudios de radiosensibilidad intrínseca demostraron un aumento de la radiorresistencia en función de la malignidad en las células tumorales de ratón evaluadas, que no se manifestó en las células de origen humano. Con respecto a las irradiaciones con haces de protones y de litio en comparación con la radiación gamma, se demostró un aumento de la eficiencia biológica relativa (RBE) en función de la transferencia lineal de energía (LET) de la radiación, que resultó consistente con los datos bibliográficos. Por otro lado, los estudios de la acción del óxido nítrico mostraron un mayor efecto radiosensibilizador en las células con mayor capacidad tumorigénica. Este efecto podría ser explicado por el estado prooxidativo basal de las células mas malignas, que potenciaría la acción de la radiación. Se demostró también la acción del óxido nítrico como radiosensibílizadoren tumores experimentales. Estos resultados sugieren la posibilidad de explorar terapias antioxidantes específicas y radiosensibílizadores selectivos para el control del crecimiento tumoral.

La Cancrosis de los Cítricos es considerada en la actualidad una de las enfermedades más peligrosas y perjudiciales para la citricultura en Argentina y en el mundo, debido a los daños causados en la producción y calidad de los frutos, siendo Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) la bacteria fitopatógena responsable de esta enfermedad. Las bacterias fitopatógenas colonizan a sus hospedadores a través de la secreción de proteínas mediante el Sistema de Secreción de Tipo III (SST3). Este sistema está codificado por el cluster hrp, el cual es esencial para la patogenicidad en plantas hospedadoras y la inducción de HR en plantas no hospedadoras. El cluster hrp de Xac contiene un gen que codifica para una proteína harpin llamada Hpa1. Las harpin son proteínas estables al calor, ricas en glicina, que pueden formar poros en membranas, inducir HR en algunas plantas y formar estructuras fibrilares. Con el objetivo de estudiar la función de la proteína Hpa1 de Xac en la patogenicidad, se expresó y se purificó esta proteína en forma recombinante, y se generó la cepa mutante de Xac en el gen hpa1. A través de diversos estudios analizando los fenotipos generados tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, la expresión de sus genes en respuesta a la Hpa1, y los efectos que produce esta proteína sobre las células bacterianas, se logró determinar que la misma posee un rol dual en la patogenicidad de Xac, por un lado promoviendo la inducción de la respuesta de defensa basal de las plantas, y por otro aumentando la virulencia del patógeno, probablemente causando cambios en la estructura del mesófilo de las hojas de cítricos y promoviendo la agregación de las células bacterianas. A su vez, se realizaron estudios utilizando técnicas biofísicas con la intención de comprender el funcionamiento de esta proteína, al mismo tiempo que se estudiaron dos dominios de la misma con el objetivo de caracterizar sus roles dentro de la proteína. Esto permitió estudiar la relación estructura-función de Hpa1 con mayor detalle. Se determinó que ambos dominios inducen HR en tejidos de plantas no hospedadoras, mientras que la capacidad de formación de fibras y de agregar células bacterianas es particular y propia de la región amino terminal de la proteína. Por otro lado, el gen hrpE perteneciente también al cluster hrp de Xac codifica para la proteína pilina que constituye el Pilus Hrp del SST3. Se estudiaron nuevos roles para esta proteína, determinando los efectos que produce la misma en las plantas. Así se logró determinar que HrpE es reconocida tanto por plantas hospedadoras como no hospedadoras. En el caso de las plantas no hospedadoras, las mismas respondieron desarrollando HR, deposición de calosa y producción de ROS, y un aumento en la expresión de genes relacionados con respuestas de defensa, mientras que en naranja todas esta respuestas fueron significativamente más leves en intensidad. Además, fue encontrada una nueva función para esta pilina promoviendo el priming tanto en plantas hospedadoras como no hospedadoras, disminuyendo el grado de infección de Xac y del fitopatógeno Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv), causante de la enfermedad Mancha o Sarna Bacteriana en plantas de tomate y pimiento. Al mismo tiempo se analizó la factibilidad del uso de anticuerpos contra esta pilina, como estrategia para la obtención de plantas resistentes a la Cancrosis de los Cítricos. De esta forma, se encontró una significativa disminución de los efectos producidos tanto por HrpE recombinante como por Xac y Xcv en plantas de naranja, validando esta estrategia para el futuro desarrollo de plantas resistentes que expresen transgénicamente estos anticuerpos. Las proteínas blanco de naranja encontradas a través del ensayo de doble híbrido en levaduras para HrpE y Hpa1, mostraron una diversa variedad de funciones, entre ellas, se encontraron proteínas cuyos genes se ven inducidos, o forman parte de la defensa, frente a algún estrés tanto biótico como abiótico; proteínas pertenecientes a los mecanismos de degradación de otras proteínas; enzimas involucradas en el metabolismo, ya sea primario o secundario; proteínas relacionadas al ciclo celular; enzimas involucradas en el mantenimiento de la homeostasis redox de la célula; proteínas de membrana tanto quinasas sensoras como transportadores de iones o azucares; enzimas involucradas en la producción de fitohormonas; y proteínas relacionadas con el reordenamiento y la muerte celular.

El virus Junín (JUNV), miembro de la familia Arenaviridae, es el agente causal de la fiebre hemorrágica argentina, enfermedad endemo-epidémica que afecta una amplia zona central de la República Argentina y para la cual, si bien existe una vacuna atenuada eficaz, no hay disponible un tratamiento antiviral específico.Numerosos virus modulan diferentes vías de señalización celular entre las que se encuentran aquellas mediadas por las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP quinasas), proteínas implicadas en la proliferación, supervivencia, diferenciación y apoptosis celular.El presente trabajo de tesis tuvo como objetivos analizar el estado de activación de las vías dependientes de MAP quinasas Raf/MEK/ERK y p38 en la infección de JUNV en cultivos celulares, establecer la importancia de estas vías para la infección y determinar el rol que cumple la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación viral.Se demostró que la infección con JUNV induce la activación de Raf/MEK/ERK en diferentes líneas celulares, mientras que la activación de p38 es dependiente del sistema celular analizado. Se comprobó que en cultivos de células Vero la activación de Raf/MEK/ERK es de tipo bifásica, observándose una primera activación temprana y una segunda fase de activación a las 7 h pos-infección, mientras que la fosforilación de p38 se hace evidente fundamentalmente a tiempos tardíos de la infección. El bloqueo de las vías mediante inhibidores químicos o RNAs de interferencia demostró que ambas rutas de señalización promueven la multiplicación de JUNV. La producción de virus infeccioso y la expresión de proteínas virales se redujeron de manera notoria en presencia de inhibidores específicos de cada una de las cascadas de señalización, tanto en células de mono como en líneas celulares humanas. El análisis detallado del papel de la vía Raf/MEK/ERK en diferentes etapas del ciclo de multiplicación de JUNV mostró que esta ruta de señalización no estaría implicada en las etapas iniciales de la infección como la adsorción, la internalización o el desnudamiento viral sino en la síntesis de RNA viral. Esto último se puso en evidencia mediante la cuantificación de los niveles de RNA viral en cultivos celulares tratados con U0126, inhibidor específico de la vía. Estos hallazgos se corroboraron empleando un sistema de genética reversa basado en análogos del genoma del arenavirus Tacaribe, virus estrechamente emparentado con JUNV. Se determinó además que la inhibición de la vía no afectaría la traducción de proteínas virales, por lo cual la reducción de la expresión de proteínas virales detectada en los cultivos celulares tratados con U0126 sería consecuencia de la inhibición de la síntesis de RNA viral. El tratamiento con el inhibidor de la vía Raf/MEK/ERK tampoco afectó los niveles de fosforilación del factor eIF2α, componente celular clave en el proceso de traducción.Los resultados obtenidos en este trabajo muestran por primera vez la capacidad de JUNV de activar vías de señalización celular dependientes de MAP quinasas y ponen en evidencia que las mismas son relevantes en la multiplicación de este virus. Asimismo, cabe destacar que la comprensión del papel de las rutas de transducción de señales en la replicación y patogénesis viral tiene importantes implicancias en el desarrollo de nuevas terapias antivirales, dado que la modulación de estas vías podría constituir una estrategia terapéutica con bajo riesgo de aparición de resistencia viral y efectiva frente a diferentes virus que manipulen de manera similar estos mecanismos de señalización.