Catálogo de publicaciones

La Porfobilinogenasa (PBG-asa) es un complejo enzimático que cataliza la ciclotetramerización del monopirrol Porfobilinógeno (PBG) en el Uroporfirinógeno III (Urogen III), intermediario fisiológico en la sintesis de hemos,clorofilas y corrinas. Está constituido por dos enzimas, la Deaminasa o Urogen I Sintetasa y la Isomerasa o Urogen III Cosintetasa. En ausencia o deficiencia de la segunda, la Deaminasa forma el Urogen I, que sólo se detecta naturalmente en condiciones anormales. Por fallas en el camino metabólico de las porfirinas, se producen una familia de enfermedades conocidas como Porfirias. En ellas, una deficiencia enzimática especifica y primaria, acompañada generalmente de un aumento secundario en la actividad de la enzima limitante ALA-Sintetasa, conduce a una sintesis anormal de precursores y/o porfirinas, responsables de los cuadros clinicos que caracterizan a las distintas porfirias. En algunas de estas porfirias, la falla metabólica se localiza precisamente a nivel de la conversión del PBG en Uroporfirinógenos, como en la Porfiria Aguda Intermitente (PAI), Porfiria Congénita Eritropoyética (PCE) y en algunos casos de intoxicación por plomo. Este sistema enzimático se ha venido estudiando en nuestro laboratorio durante más de 20 años, desde múltiples puntos de vista y en los más variados sistemas. Entre ellos, uno de los más fascinantes ha sido el alga protozoo Euglena gracilis que en virtud de sus peculiares caracteristicas ha constituido uno de los modelos experimentales más atractivos para la investigación de ciertos aspectos del metabolismo de los tetrapirroles. Empleando justamente Euglena gracilis, hemos logrado pruebas acerca de la existencia de un factor regulador de la biosintesis de porfirinas en este organismo, y el estudio de algunas de sus propiedades nos ha permitido identificarlo con un compuesto de naturaleza pteridinica, al tiempo que desarrollar una nueva terapia de la PAI, administrando ácido fólico a pacientes en fase aguda, luego de lo cual se ha logrado una positiva recuperación clinica y bioquimica. En consecuencia resultó importante continuar nuestros estudios acerca de este factor regulador. De manera que, entre los objetivos del presente trabajo nos habíamos propuesto: Emplear como fuentes, además de Euglena gracilis por las razones conocidas, una bacteria fotosíntética, que aparte de poder compartir algunas de las propiedades de la Euglena nos permitiera ampliar nuestros conocimientos acerca de la PBG-asa, poco investigada en estos organismos. Entre ellos, los datos existentes sobre las enzimas involucradas en la sintesis de porfirinas en Rhodopseudomonas palustris se refieren solo al ALA-Sintetasa y también provienen de nuestro laboratorio; de manera que la elección de la segunda fuente fue simple y lógica. Este trabajo comprendía asi, el uso de dos organismos diferentes para el logro de una serie de objetivos. Como etapa previa se planteó entonces un estudio de las condiciones necesarias para la medición de la actividad de PBG-asa EN Rp. Palustris es decir, curvas de crecimiento y actividad en función de los días de desarrollo de las células, asi como condiciones óptimas de extracción y medición de la enzima, en cuanto a atmósfera, tiempo, temperatura y pH de incubación. Se desarrollaría luego un método para la obtención de preparaciones altamente purificadas sobre las cuales se planeaban estudiar algunas propiedades generales como peso molecular, cinética de la reacción y efecto de ciertos cationes y aniones. Pero entre los fines de este trabajo se encontraba además, tratar de identificar y determinar en otros tejidos, la presencia de un factor regulador, análogo al encontrado en Euglena gracilis de manera, que se planearon una serie de experiencias en RP. palustris tendientes al logro de este propósito. Los estudios que se enfocarían en Euglena gracilis estában principalmente relacionados con la obtención de mayores datos experimentales acerca del factor regulador. Se trataba de conocer sus efectos sobre la cinética de la reacción de diferentes preparaciones de la enzima. De datos previos, nos interesó estab1ecer su relación con ciertos compuestos como sulfas y derivados sulfurados. Y dado el conocido efecto activante del factor de Euglena sobre la enzima de igual fuente y del ácido fólico en pacientes con PAI, se pretendía determinar el comportamiento de ambos compuestos frente a distintas preparaciones de la enzima proveniente de los origenes más diversos, con el objeto de aclarar el posible mecanismo de acción de este factor regulador.

En este trabajo se presenta un estudio de la biosíntesis de los exopolisacáridos complejos producidos por tres especies de bacterias Gram negativas, Rhizobium leguminosarum (R.l.), Rhizobium meliloti (R.m.) y Acetobacter xylinum (A.x.). Con el sistema de R. l. se utilizaron las siguientes cepas: R. l. bv. phaseoli 8002 es una cepa silvestre que sintetiza exopolisacárido (EPS+) y tiene capacidad para nodular (Nod+) y fijar nitrógeno (Fix+) en las raíces de su planta hospedadora, poroto (Phaseolus vulgaris). Dicha capacidad se encuentra codificada en un plásmido simbionte llamado pRP2JI. A la cepa 8002 curada de su plásmido simbionte se la denomina R.l. 8401, que no puede nodular ni fijar nitrógeno en poroto (Nod-, Fix-), pero produce exopolisacárido en cantidades equivalentes a la de su contraparte silvestre (EPS+). Una cepa derivada de la 8401 es la cepa R. l. bv. viciae 8401 pRL1JI, que es la cepa 8401 a la cual se le ha introducido el plásmido simbionte (pRL1JI) de otra cepa silvestre llamada R. l. bv. viciae 248 que nodula y fija nitrógeno en arveja (Vicia hirsuta) (Nod+, Fix+) y produce un exopolisacárido de estructura diferente a la cepa 8002 (EPS+). La cepa 8401 pRL1JI es Nod+ y Fix+ en arvejas y produce un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002 (EPS+). Otra cepa EPS+ utilizada fue R. l. bv. trifolii NA-30, que tiene capacidad para nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en trébol (Trifolium repens) y también sintetiza un exopolisacárido de estructura idéntica al de la cepa 8002. La estructura propuesta para la unidad repetitiva del exopolisacárido producido por las cepas 8002, 8401, 8401 pRL1JI y NA-30, es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Además se utilizó una mutante defectiva en la síntesis del exopolisacárido (EPS-), obtenida por mutagénesis con el transposón Tn5 con la cepa silvestre R. l. bv. phaseoli 8002, llamada R. l. bv. phaseoli RW4 pero que sin embargo es Nod+ y Fix+, en porotos. Se realizaron incubaciones in vitro con preparados enzimáticos las distintas cepas (células tratadas con EDTA) en presencia tanto de UDP[14C]Glc como UDP[14C]GlcA y se estudió la transferencia de radioactividad a diferentes fracciones, principalmente Extracto 1203 (extracción con solvente orgánico) y sobrenadante de incubación. Se utilizaron diferentes técnicas analíticas para el estudio de los compuestos presentes en las diferentes fracciones; electroforesis en papel, cromatografía, filtración por geles, perrnetilación, etc. En trabajos anteriores realizados en nuestro laboratorio con la cepa R. l. bv. trifolii NA-30, se pudo observar al analizar los Extractos 1203 que se formaban diferentes lípido-azúcares con las características de un prenol-PP-trisacárido, con la estructura de los primeros tres restos glicosídicos de la unidad repetitiva, GlcAβ(1-4) GlcAβ(1-4)Glc (comenzando por el extremo reductor) que podía estar O-acetilada o no, y un prenol-PP-octasacárido, con la estructura de la unidad repetitiva (octasacárido dipiruvilado y acetilado) correspondiente al exopolisacárido descripto para esta cepa. En este estudio previo no se logró polimerización de la unidad repetitiva in vitro que diera como producto final el exopolisacárido (EPS) (J.C. Bossio, 1989, Tesis Doctoral). En el presente trabajo, al analizar el Extracto 1203 se pudieron aislar, por diferentes técnicas de incubación, todos los intermediarios de biosíntesis a nivel de lípido-azúcares, en las fracciones de extracción orgánica (tanto con marca en [14C]Glc como en [14C]GlcA), desde el prenol-PP-glucosa hasta el prenol-PP-octasacárido dipiruvilado (unidad repetitiva) y se demostró que los mecanismos de biosíntesis del EPS y sus intermediarios eran análogos en todas las cepas estudiadas (8002, 8401, 8401 pR1JI y NA-30). Además, y muy importante, al analizar los sobrenadantes de incubación se observó que se pudo obtener polimerización in vitro de la unidad repetitiva que dió como producto final el polisacárido (EPS), en todos los casos. También se demostró de manera inequívoca, a través de incubaciones en dos etapas, que los intermediarios lípido-azúcares intervienen de manera directa en la síntesis del EPS en todas las cepas estudiadas. Esta es la primera vez que se describe polimerización in vitro de un exopolisacárido producido por bacterias del género Rhizobium. Todas estas cepas también produjeron in vitro un glucano β(1-2) (que estas cepas sintetizan) que no se estudió en mayor detalle. Por otra parte, se estudió la transferencia de restos acetilos, en incubaciones llevadas a cabo en presencia de [14C]acetil-CoA, y se vió que el grupo O-acetilo se incorporaba tanto a nivel de intermediarios lípido-azúcares como de polímero (EPS). Al utilizar la cepa mutante RW4 con este tipo de preparado enzimático (células tratadas con EDTA) no se pudieron obtener buenas incorporaciones de radioactividad al Extracto 1203. En una segunda parte de este trabajo, se realizó con la utilización de un nuevo preparado enzimático (células electroporadas) que resultó extremadamente útil para la caracterización de cepa mutante defectiva en la síntesis de EPS, Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli RW4 y para el estudio de biosíntesis in vitro de EPS en cepas en las cuales no había sido posible obtener polimerización in vitro, como en Rhizobium meliloti y Acetobacter xylinum. Con respecto a la cepa RW4 (EPS-), se la caracterizó bioquímicamente y se observó que era capaz de sintetizar la unidad repetitiva a nivel de intermediario lípido-azúcar, aunque en menos cantidad que su contraparte silvestre (la cepa 8002), pero no produjo EPS in vitro. También produjo in vitro Glucanosβ(1-2). El sistema de Rhizobium meliloti fue el segundo en ser utilizado con este sistema de células electroporadas para el estudio in vitro de la síntesis de un exopolisacárido, el succinoglicano. Esta especie se caracteriza por tener la capacidad de nodular y fijar nitrógeno (Nod+, Fix+) en alfalfa (Medicago saliva). Se trabajó tanto con la cepa silvestre Rm 1021 (EPS+) como con la mutante defectiva en la síntesis (EPS-), la cepa Rm 7094 (exo B-), que es además Nod- y Fix-. La unidad repetitiva descripta del siccinoglicano es la siguiente: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados por otro investigadores han demostrado que en incubaciones in vitro en presencia de UDP[14C]Glc y células tratadas con EDTA se obtuvieron en los extractos orgánicos, compuestos con las propiedades de lípido-azúcares, que comprenderían desde el prenol-PP-Gal (primer resto glicosídico) hasta el prenol-PP-unidad repetitiva (prenol-PP-octasacárido), pero no se logró obtener el producto final, succinoglicano. En este trabajo al usar la cepa silvestre 1021, se pudo observar que en incubaciones realizadas en presencia de UDP[14C]Glc, tanto con células tratadas con EDTA, como con células electroporadas, se obtuvieron buenas incorporaciones de radioactividad a nivel de los lípido-azúcares (Extracto 1203), pero en mayor cantidad con el sistema de células electroporadas (más del 100%). En ambos casos se observó formación de lípido-azúcares, caracterizados como el prenol-PP-octasacárido (prenol-PP- Octa) y su derivado substituído (acetilado y piruvilado) (prenol-PP-Octa.A.). Sólo en el caso de utilizar células electroporadas se observó formación de polímero in vitro. Se estudió la estructura del Octa y del polímero (succinoglicano) obtenidos in vitro y se demostró que ambos tenían la estructura esperada, siendo la primera vez que se describe formación de succinoglucano in vitro en Rhizobium meliloti. La confirmación de estos estudios se obtuvieron al utilizar la cepa Rm 7094 (exo B-) en ensayos de complementación in vitro, en donde al agregar UDP[14C]Glc en presencia de UDP-Gal, no sólo se obtuvieron lípido-azúcares, sino que se logró obtener polimerización in vitro. También se pudieron sintetizar in vitro otros polisacáridos de bajo peso molecular compuestos por 1, 3 y 4 unidades repetitivas (Octa, Octa3 y Octa4, respectivamente), previamante descriptos in vivo por otros investigadores. Ensayos de incubación en dos etapas con la cepa Rm 7094, demostraron claramente que el prenil-difosfato-Octa.A. intervendría como intermediario en la síntesis del succinoglicano final y además del Octa.A., Octa 3 y Octa 4 libres. Por último, se utilizó la cepa silvestre de Acetobacter xylinum RC Grl, que sintetiza un exopolisacárido llamado acetano cuya unidad repetitiva es un heptasacárido con la siguiente estructura: (ver diagrama en la tesis). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, con células tratadas con EDTA de Acetobacter xylinum como preparado enzimático, han demostrado la síntesis secuencial in vitro de la unidad repetitiva a nivel de compuestos lípido-azúcares (prenol-PP-heptasacárido), pero no se pudo obtener tampoco en este caso polimerización in vitro de la unidad repetitiva, para dar acetano. Se hizo un estudio detallado de la puesta a punto de la técnica de electroporación de células en el sistema de Acetobacter xylinum; se estudiaron diferentes variables como el efecto del voltaje (Voltios), capacitancia (Faradios), resistencia (Ohms), tiempo de permeabilidad, ayuno de las células, temperatura de incubación, etc. En este estudio, al analizar los resultados, se observó que al usar células electroporadas se obtuvo síntesis in vitro tanto de polímero (acetano) como de intermediarios de biosíntesis (prenol-difosfato-heptasacárido) a partir de todos los dadores de restos glicosídicos radioactivos (UDPGlc, UDPGlcA, GDPMan y TDPRam) y no glicosídicos, como acetil-CoA, demostrando que los compuestos radioactivos obtenidos pertenecen tanto a intermediarios en la síntesis del acetano como al producto final (acetano) y que el grupo O-acetilo es transferido a nivel de lípido-azúcares. Con este sistema fue posible observar además otros compuestos no relacionados a la síntesis del acetano (glucanos β(1-2); prenol-monofosfato-β-galactosa; prenol-monofosfato-β-manosa y lípido-GlcA) ya descriptos en estudios anteriores. En incubaciones en dos etapas, en donde parte de los prenol-PP-heptasacáridos, se transforman en polímero, se demostró en forma clara el papel de intermediarios originalmente asignada a estos compuestos. Al analizar la estructura del heptasacárido y del acetano obtenidos in vitro con marca en [14C]Glc por ensayos de permetilación, éstos presentaron la estructura esperable con lo que se obtuvieron evidencias concretas de que el acetano se formó por la polimerización de la unidad repetitiva.

Como parte de un proyecto de largo alcance destinado a elucidar la genetica molecular del aparato fotosintético de la bacteria Rhodonseudomonas capsulata, hemos estudiado la biosíntesis y la función de los carotenos de ese organinsmo. Los carotenos son polienos con cuarenta atomos de carbono, cuya función es proteger a las celulas de la destructiva combinación de oxígeno y luz; y tambien actúan como pigmentos fotorreccptores. En combinación con proteinas específicas y clorofila, forman el aparato fotosíntético de Rhodopseudomonas capsulata, que esta contenido en invaginaciones de la membrana plasmática. Para estudiar el "pathway" metabolico, utilizamos cepas mutantes con bloqueos geneticos en etapas sucesivas de la biosíntesis de estos compuestos. Los carotenos acumulados por cada mutante fueron analizados por cromatografía, derivatización, análisis quimicos y espectrometría visible y de masa. En base a los resultados obtenidos, describimos una nueva region genetica, crt F, que codifica la síntesis de una enzima que metila el C-l de los carotenos. Un compuesto que no habia sido descripto previamente, demetilesferoidenona, fue identificado en células de cepas mutantes cultivadas en presencia de oxígeno. Tambien describimos un caroteno, metoxyneurosporeno, cuya existencia habia sido solamente sugerida. Hemos encontrado que este es el caroteno que se une especificamente a los centros de reacción de Rhodopseudomonas sphaeroides. Esto corrige una identificacion equivocada por otros autores. En esta Tesis presentamos un diagrama metabolico para la biosíntesis de los carotenos en Rhodopseudomonas capsulata , identificando los genes y los productos que estan involucrados. Terminado el "pathway" biosintático, estudiamos los espectros de fluorescencia de los carotenos unidos al sistema fotorrecoptor I (LH-I) o el sistema fotorreceptor II (LH-II), usando mutantes con sistemas antena modificados. La conclusión es que los carotenos con nueve o diez doble ligaduras pueden transmitir energia a la clorofila de los sistemas LH-I o LH-II con un 80% de eficiencia. Este es el primer estudio realizado acerca de las propiedades fotorreceptoras de los carotenos asociados con el complejo LH-I , y tambien el primero acerca de la eficiencia de los carotenos nonaenos como pigmentos fotorreceptores. Utilizando las mismas mutantes, estudiamos las propiedades fotoprotectoras de los carotenos asociados con ambos sistemas antena. Hemos descubierto que los carotenos del LH-I protegen a las celulas de los efectos fotodinámicos que pueden ocurrir "en vivo". Encontramos, usando espectrometría con un rayo laser, que el mecanismo de esta proteccion en los complejos antena LH-I, es a través de "valvulas triples". Este mecanismo consiste en la eliminación de los estados triples de la clorófila por los carotenos, los que, de esta manera, previenen la formación de los radicales libres oxígeno (oxígeno en estado simple), que potencialmente pueden destruir la celula. Hemos encontrado el mismo mecanismo en el sistema LH-II y en los centros de reacción, confirmando de esta manera lo que habia sido descripto en especies relacionadas, por otros autores. Las proporciones en las cuales se sintetizan los sistemas LH-I y LH-II dependen de varios factores ecológicos, pero las conclusiones de este estudio indican que, en cualquier caso, los carotenos actuan eficientemente como pigmentos fotorreceptores, y protegen a las celulas de posibles daños fotodinamicoe a través de "valvulas friples".

CONCLUSIONES: Las enfermedades desatendidas comprenden un conjunto de patologías que son pobremente atendidas desde los sistemas de salud y las empresas farmacéuticas. Recientemente mediante la colaboración de organismos no gubernamentales, entes de los estados y emprendimientos privados, esa desatención ha pasado a producir modelos sinérgicos de colaboración que han producido avances llevando a tener nuevos candidatos en fases clínicas después de mucho tiempo. El objetivo principal de este trabajo de tesis fue generar una estrategia tendiente a realizar aportes en estos esfuerzos desde la órbita del sector científico nacional. A continuación se detallan las principales conclusiones alcanzadas fruto de este trabajo.  Se planteó un esquema de trabajo general que pudo ser llevado adelante y sienta las bases para llevar adelante las etapas iniciales de desarrollo de drogas en el ámbito académico.  Se postularon las diaminas alifáticas como una posible estructura privilegiada y se prepararon 97 derivados, 63 de los cuales fueron nuevos. El curso de las reacciones fue dependiente de la naturaleza de los aldehídos usados, obteniéndose los productos con rendimientos que en general fueron buenos.  Se ensayó la actividad antiproliferativa sobre los agentes etiológicos de la leishmaniasis visceral, la tripanosomiasis africana, la enfermedad de Chagas, la toxoplasmosis y la malaria, en estadíos intra y extracelulares. Además se han explorado diferentes espacios químicos que han permitido abrir nuevas expectativas respecto de nuevos líderes, apoyados éstos en estudios cercanos de inhibición de los diferentes parásitos contra los cuales resultaron activos.  La mayoría de los compuestos estudiados resultaron activos contra todos los parásitos ensayados y presentan una baja citotoxicidad. De este modo, se encontraron miembros de la colección con promisorios perfiles de actividad que los posiciona como candidatos para las ulteriores etapas de desarrollo. Se realizaron simulaciones in silico de las propiedades estructurales y fisicoquímicas para lo cual se compararon distintos software y plataformas disponibles en la web. Los estudios de las densidades electrónicas, de propiedades fisicoquímicas y los descriptores topológicos resultaron útiles para racionalizar los resultados obtenidos y fueron usados para seleccionar los mejores candidatos a líderes. Dadas las características de los compuestos preparados, el metabolismo de poliaminas aparecía como el posible blanco de acción por lo que se abordaron estudios para validarlo como posible blanco de acción. Los estudios de inhibición enzimáticos y en cultivos de Ld suplementados mostraron que algunos análogos poseen capacidad de inhibir marginalmente enzimas de la biosíntesis de poliaminas, mostrando una participación menor en el mecanismo de acción. Se desarrolló un análogo fluorescente (100) y se estudió en amastigotes de Tc. Los resultados nos permiten concluir que el compuesto atraviesa tanto la membrana de la célula hospedera, como la del parásito, lo que lo posicionaría como una posible herramienta para estudiar el transporte de estructuras similares. Los resultados de microscopía mostraron que el derivado fluorescente no se encuentra anidado en una estructura celular determinada de la célula hospedadora. No se observó acumulación del análogo en el núcleo, lo que supone que no existe interacción con el ADN. En función de los resultados obtenidos, se propuso el siguiente modelo que describe los elementos principales que modulan la actividad de la colección. Se realizaron simulaciones in silico de las propiedades estructurales y fisicoquímicas para lo cual se compararon distintos software y plataformas disponibles en la web. Los estudios de las densidades electrónicas, de propiedades fisicoquímicas y los descriptores topológicos resultaron útiles para racionalizar los resultados obtenidos y fueron usados para seleccionar los mejores candidatos a líderes. Dadas las características de los compuestos preparados, el metabolismo de poliaminas aparecía como el posible blanco de acción por lo que se abordaron estudios para validarlo como posible blanco de acción. Los estudios de inhibición enzimáticos y en cultivos de Ld suplementados mostraron que algunos análogos poseen capacidad de inhibir marginalmente enzimas de la biosíntesis de poliaminas, mostrando una participación menor en el mecanismo de acción. Se desarrolló un análogo fluorescente (100) y se estudió en amastigotes de Tc. Los resultados nos permiten concluir que el compuesto atraviesa tanto la membrana de la célula hospedera, como la del parásito, lo que lo posicionaría como una posible herramienta para estudiar el transporte de estructuras similares. Los resultados de microscopía mostraron que el derivado fluorescente no se encuentra anidado en una estructura celular determinada de la célula hospedadora. No se observó acumulación del análogo en el núcleo, lo que supone que no existe interacción con el ADN. En función de los resultados obtenidos, se propuso el siguiente modelo que describe los elementos principales que modulan la actividad de la colección. La estrategia desarrollada resultó novedosa y conveniente, siendo altamente productiva si ponderamos el tiempo invertido y la cantidad de compuestos activos encontrados, permitiendo generar buenos candidatos a drogas para las cinco parasitosis en estudio.