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Fil:Geremía, Roberto Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El presente estudio tiene por objeto: la biosíntesis e identificación de porfirinas formadas in vitro por sistemas de GR o fracciones de los mismos en presencia de ácido delta amino levúlico o porfobilinógeno; la investigación de la naturaleza química de la porfirina descripta por Falk como Pseudouroporifina y su identificación con la aislada de orina de porfiria humana, denominada originalmente "Porfirina 208", finalmente, siendo dicha porfirina de estructura isomérica III, el estadio de su significado biológico y posible intermediario en la biosíntesis del hemo. Se describen una serie de métodos aplicados durante el trabajo, en particular un micrométodo para la determinación cuantitativa de porfirinas, que ha surgido de nuestro laboratorio (114). Además algunas modificaciones interesantes a otras técnicas que han mejorado las mismas desde el punto de vista de su rendimiento. El empleo de distintos sistemas de incubación,, en diferentes condiciones, de atmósfera, temperatura, tratamiento previo, etc, llevó a la elección de un determinado sistema como el más eficaz, es decir que produce un mejor rendimiento, en lo referente a la biosíntesis de la Firiaporfirina III. Con iguales concentraciones de sustrato, a mayor tiempo de incubación, hay mayor síntesis; pero a los 90´ se alcanza aproximadamente, el máximo, de donde el mejor tiempo de incubación es, para nuestros fines, de 90´. El uso de solución fisiológica o de sacarosa 0,25M, como líquido de lavado o disolución, no produce ninguna modificación. Se han estudiado independientemente, cada una de las porfirinas aisladas de los distintos sistemas de incubación, comparativamente, cuando era posible, con los correspondientes isómeros provenientes de fuentes naturales; identificándose así dichas porfirinas. Se aprecia que la fracción "Uroporfirina" consiste de aproximadamente 60% de Uroporfirina III y aproximadamente de 30% de Firiaporfirina III, además de menores cantidades de porfirinas que poseen una movilidad correspondiente a una hexacarbóxilica y otras dos que se sitúan en una posición intermedia entre la Uro-porfirina I y la Uroporfirina III por cromatografía sobre papel. La fracción "Coproporfirina" consiste principalmente de Coproporfirina III y cantidades menores de profirinas hexacarboxílica pentacarboxílica y tricarboxílica, que no habían sido descriptas anteriormente. Estas porfirinas que se encuentran en pequeña cantidad, fueron detectadas utilizando la cromatografía en columna de carbonato de calcio, que demostró ser más sensible para la separación de porfirinas que la cromatografía sobre papel de Falk y Benson. Si el sistema se calienta previamente a 60°C durante más de 15´, ocurren cambios muy significativos en lo que atañe a la naturaleza de las porfirinas sintetizadas, así: la fracción "Uroporfirina" consiste casi exclusivamente de Uroporfirina I y desaparece la Firiaporfirina III; en tanto que el rendimiento de la fracción "Coproporfirina" disminuye considerablemente y ésta consiste sólamente de Coproporfirina I. Cuando se emplea ácido delta amino levúlico como sustrato, aproximadamente un 15% del ALA agregado no se utiliza en la biosíntesis y un 25% se transforma en porfobilinógeno; en tanto que cuando se usa porfobilinógeno como sustrato, aproximadamente un 40% del mismo queda sin utilizar. Utilizando Uroporfirinógeno III-C^14 y Coproporfirinógeno III-C^14 se demuestra por 1° vez su transformación a Protoporfirina IX, confirmándose que el Uroporfirinógeno III y el Coproporfirinógeno II, pero no el UPG I, ni el CPG I, son intermediarios en la biosíntesis del heso. Se han aislado e identificado las porfirinas libres formadas cuando se usaron los distintos porfirinógenos como sustratos, determinándose los porcentajes de los diferentes componentes de cada fracción. Se demuestra que la porfirina descripta por Falk como pseudouroporfirina, es igual a la aislada de orina de porfiria humana, designada como "Porfiria 208" y actualmente como firiaporfirina III. Por otra parte, mediante la técnica I otopica, se establece que el firiaforfirinogeno III, es un intermediario normal, siguiendo al uroporfirianogeno III en la biosíntesis de la protoporfirina IX. Y muy posiblemente la decarboxilación seria un proceso en etapas que ajustaria al siguiente esquema *Ver esquema en tesis*

Las porfirinas y sus derivados se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza. Son compuestos tetrapirrólicos que cumplen funciones fisiológicas fundamentales en todas las células vivas, formando parte como grupos prostéticos de una gran variedad de hemoproteínas, entre las que se hallan la hemoglobina, los citocromos, las peroxidasas, y la catalasa. La biosíntesis del hemo está estrictamente regulada. Si los mecanismos de control fallan o son defectuosos, la sintesis o acumulación de intermediarios en la cadena de dicha camino metabólico puede alcanzar niveles mayores que los normales. Esto trae como consecuencia la aparición de una serie de patologías conocidas como porfirias, entre las cuales se destacan por su importancia las porfirias hepáticas. Dentro de estas últimas se encuentra la porfiria aguda intermitente (PAI), caracterizada bioquímicamente por una sobreproducción hepática de ácido δ-aminolevúlico (ALA) y porfobilinógeno (PBG), metabolitos que son excretados por orina. La afección enzimática de esta porfiria se encuentra a nivel de la enzima Porfobilinógeno - Deaminasa (PBG-D). Actualmente se conoce una gran cantidad de drogas que pueden desencadenar una crisis de porfiria aguda, siendo las más comunes los hipnóticos, barbitúricos, sulfonamidas, esteroides, anestésicos y alcohol. A pesar de que el hígado es el órgano donde los intermediarios ALA y PBG se sintetizan en exceso, los síntomas clínicos predominantes pertenecen casi exclusivamente al sistema nervioso. Además, se ha estudiado extensamente la biosintesis de porfirinas en higado de distintas especies animales pero es muy poca la información existente acerca del metabolismo de las porfirinas en el tejido nervioso. Dado estos antecedentes se decidió estudiar la enzima PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. En la etapa inicial del presente trabajo se planeó determinar las condiciones óptimas para la extracción y medición de la actividad de PBG-D. Una vez obtenida la enzima de ambas fuentes se desarrolló un método para la purificación de la misma y empleando la fracción parcialmente purificada, se efectuaron estudios comparativos de caracterización y cinética. Por otra parte, aún se desconoce cuál es el mecanismo que ocurre en la neuropatía porfirica durante los ataques agudos de PAI. Las distintas hipótesis involucran al ALA como agentes neurotóxico, aunque todavía está en discusión si éste atraviesa o no la barrera hematoencefálica, una vez ocurrida la sobreproducción hepática. Por otro lado el camino del hemopodría estar también alterado en el tejido nervioso, contribuyendo a desencadenar los síntomas característicos de esta patología. Durante los últimos años se ha manejado la hipótesis que el ALA se autooxida generando especies reactivas de oxigeno (ROS) capaces de peroxidar los lípidos de las membranasy producir daño a nivel celular, actuando estas especies comoagentes etiológicos de la PAI. Considerando lo expuesto, fue objetivo de la presente Tesis investigar la captación de ALA y su metabolización a PBG y porfirinas empleando como modelo el sistema de particulado de cerebelo de rata. Para lograr este propósito en primer lugar habia que determinar la viabilidad de los particulados, medida como incorporación de leucina a proteínas y como captación de glucosa. Sobre esta base, nuestro interés fue analizar la respuesta del particulado al agregado exógeno de ALA, variando la cantidad de proteína, la concentración de sustrato ALA y el tiempo de incubación. Paralelamente a estos estudios se determinó la distribución de los metabolitos sintetizados y se identificaron las porfirinas formadas por HPLC. Además fue importante establecer la dependencia energética del proceso de incorporación de ALA a las células del particulado. En incubados a distintos tiempos y variando la concentración de sustrato ALA, se evaluó la formación de ROS, midiendo marcadores de daño celular (TBARS y dienos conjugados) y se estudió el efecto de "scavengers" de ROS como la SOD, la CAT y el DMSO sobre la captación de ALA y la biosíntesis de PBG y porfirinas. Por otra parte y teniendo en cuenta que a los pacientes con PAI se les administra como tratamiento ácido fólico y una dieta en carbohidratos se resolvió llevar a cabo un estudio en particulados de cerebelo acerca de la captación de glucosa en presencia de ALA y el efecto de los distintos "scavengers". Comparativamentese analizó el efecto del ácido fólico sobre la biosintesis de porfirinas en particulado y sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. Considerando la acción de las sulfonamidas como desencadenantes de una PAI y dado que la sulfamerazina (SMZ) produce una inhibición no competitiva reversible de la PBG-D de higado de rata, correlacionada con la inhibición encontrada in vivo e in vitro en la PBG-Dde sangre de rata, se estudió el efecto de la SMZ sobre la biosintesis de porfirinas en el sistema de particulados, asi como también sobre la actividad de PBG-D de corteza cerebral y de cerebelo de rata. El conocimiento de la respuesta que brinden las células nerviosas al agregado de ALA exógeno es de sumo interés pues podrá contribuir posiblemente al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

El estudio del pigmento presente en la glándula de Harder de ratas blancas, demuestra que es una mezcla de porfirinas cuyo componente principal es protoporfirina, pero que contiene en cantidades mucho menores una porfirina tricarboxílica y coproporfirina de la serie isomérica III. La concentración de porfirinas en la glándula de animales adultos es de 0,15 µg por mg de tejido fresco. Se demuestra la presencia de todas las enzimas relacionadas con la biosíntesis de la protoporfirina 9, lo que avala la naturaleza secretora de porfirinas de esta glánflula. Se estudian además algunas propiedades de los sistemas catalíticos. La δ-ALA sintetasa, primera enzima de esta secuencia, está localizada en las mitocondrias. Utiliza como sustratos glicocola y succinil-CoA, siendo cofactores necesarios de la reacción fosfato de piridoxa], ATP, Mg(++) y aerobiosis. Diferentes condiciones ensayadas para obtener mayor actividad demuestran que es fundamental un pretratamiento de las partículas mitocondriales con agentes quelantes y sulfhidrílicos. El producto de la reacción inhibe la actividad catalítica de la sintetasa. La segunda enzima de este camino, la δ-ALA dehidratasa, se encuentra en la fracción citoplasmática, no asociada a partículas subcelulares. Se logra purificarla unas 150 veces respecto del extracto crudo, la que se comporta como homogénea en diferentes corrilas electroforéticas. Se establece su naturaleza sulfhidrílica, presentando actividad máxima en anaerobiosis. Es estable al calor, su acción es óptima en buffer fosfato a pH 6,8 y a temperaturas más altas que las fisiológicas (55°C). No se determina requerimiento de metales pero es inhibida fuertemente por EDTA. Sus propiedades cinéticas la incluyen dentro de las actividades de las otras δ-ALA dehidratasas de origen animal, y no justifican la acumulación de protoporfirina presente en este órgano, por un incremento excesivo de su actividad catalítica. El complejo porfobilinogenasa-Uro'gen sintetasa y cosintetasa- es también "soluble". Se detectan ambas actividades y se comprueba la labilidad del sistema sintetizante de Uro'gen III, ya sea por precalentamiento del sistema como por estudios de estabilidad. El sistema descarboxilante de los porfirinógenos, que lleva a coproporfirinógeno III, está en el sobrenadante de mitocondrias y es inestable al calor. Se detectan en esta etapa todos los intermediarios conocidos de la cadena biosintética, es decir, los porfirinógenos que poseen 7-, 6-, 5- y 4-CO0H. La coprogenasa, sistema que sintetiza el último de los intermediarios tetrapirrólicos comunes a los caminos divergentes de hemo, proteínas y clorofilas - la protoporfirina 9 - se encuentra localizada en mitocondrias y requiere oxígeno para su actividad. Todos estos resultados demuestran la biosíntesis "de novo" de la proto 9 en la glándula de Harder de rata a partir de sus precursores primarios, la presencia de todos y cada uno de los sistemas enzimáticos relacionados, y, por ende, la existencia de una funcionalidad similar a la de otros sistemas de vida.

Agrobacterium radiobacter produce un polisacárido extracelular (EPS), el succinoglicano, cuya unidad repetitiva (U.R.) es un octasacárido constituído por Glc, Gal, piruvato y succinato en relación 7:1:1:1 (Amemura et al; 1981, Carbohydr. Res. 91:59-65): Glcß1--3Glcß1--3Glcß1--6Glcß1-- 6Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--4Glcß1--3Gal—4-6-4Pyr (ver en versión PDF). Este polisacárido tiene gran importancia en la industria del petróleo, y el producto comercial, se extrae de la bacteria en estudio debido a que lo produce en cantidades elevadas. En otros sistemas, se ha demostrado que la biosíntesis de EPS se realiza fundamentalmente en cuatro etapas (Ielpi et al, 1993, J. Bacteriol, 175: 2490-2500). En la primera, se sintetizan los nucleótido-azúcares precursores. En una segunda etapa, se forma la U.R. por transferencia secuencial de los distintos monosacáridos que la componen a partir de los respectivos nucleótido-azúcares a un prenil-fosfato aceptor ubicado en la membrana plasmática. Estas reacciones están catalizadas por enzimas específicas, las glicosiltransferasas. Una vez completada la U.R., ésta actúa como monómero en una reacción de polimerización, siendo el producto final el EPS. Es probable que la polimerización y el transporte al exterior celular (cuarta etapa) del polímero sean simultáneos. En este estudio, se describe la biosíntesis "in vitro" del succinoglicano en A. radiobacter. Se obtuvieron y caracterizaron algunos prenil difosfato azúcares intermediarios y el producto final, es decir el succinoglicano sintetizado "in vitro". Para estudiar la posible formación de compuestos relacionados con la síntesis de EPS, se realizaron incubaciones con células permeabilizadas con EDTA (García et al, 1974, Eur. J.Biochem. 43:93-105) en presencia de UDP-Glc y/o UDP-Gal uno de los dos marcado con [14C]-Glc. La mezcla de incubación se centrifugó y el precipitado de células se lavó con buffer acuoso y luego se trató con solventes orgánicos, que extraen los lípido-azúcares formados. Los lavados se unieron al sobrenadante y en esta fracción se investigó la presencia de EPS. Al realizar incubaciones con células provenientes de la cepa silvestre en presencia de UDP-[14C]-Glc, si bien se observó la síntesis de numerosos compuestos, algunos de ellos de propiedades novedosas, ninguno presentó las propiedades esperables para los compuestos intermediarios, es decir, los prenil fosfo-azúcares. Sin embargo, fue posible observar polímero en los lavados acuosos aunque en muy baja cantidad. En caso de incubar en presencia de UDP-[14C]-Gal se pudieron obtener algunos compuestos de interés, uno de ellos liberaba Gal, pero en cantidades no adecuadas como para ser analizadas. Cuando se incubó en presencia de ambos dadores, uno de ellos radioactivo, se obtuvo menor cantidad de radioactividad en los extractos orgánicos que en el caso de incubar en presencia de un solo nucleótido. Este hecho se atribuyó a la dilución de la marca radioactiva, debido a que la cepa silvestre contiene la UDP-Gal-4-epimerasa, enzima que cataliza la interconversión de UDP-Glc en UDP-Gal. Se buscó, entonces resolver el problema utilizando una mutante, defectiva en la síntesis de esta enzima, de forma tal de poder realizar incubaciones con ambos nucleótidos sin observar el efecto de dilución mencionado anteriormente. En efecto, al utilizar la cepa SGN-1, defectiva en la síntesis de la epimerasa, se pudo lograr la síntesis de los siguientes compuestos: Gal-P-P-prenol, celobiosil- galactosa-P-P-prenol y los prenil difosfato derivados de un octasacárido y de su derivado piruvilado, estrechamente relacionados con la U.R. del succinoglicano. La cantidad de polímero obtenida fue sensiblemente mayor que en el caso de la cepa silvestre. Mediante incubaciones en dos etapas, se demostró también que los prenilfosfo-azúcares analizados eran los precursores del polisacárido. Por otro lado, se estudió el efecto de los dadores de grupos no glicosídicos sobre la síntesis del polímero. El PEP estimula discretamente la formación de polímero, probablemente por un aumento en la piruvilación de la U.R., que es, aparentemente un sustrato mas adecuado para la polimerasa, es decir la enzima o grupo de enzimas que catalizan la polimerización de la U.R. El SuccCo-A ejerce un efecto dual. A una concentración de 0,1 mM estimula en forma notoria la polimerización, mientras que a una concentración diez veces mayor se observó una reducción gradual en dicha estimulación. Finalmente, estos estudios se extendieron a una bacteria estrechamente relacionada, patógena de plantas, Agrobacterium tumefaciens que también produce succinoglicano. En esta cepa, se habían aislado y caracterizado parcialmente varios prenil-fosfo-azúcares, pero no se había logrado su polimerización (Staneloni et al, 1984, J. Gen. Microbiol., 130: 869-879). Con la experiencia lograda en A. radiobacter, se logró obtener succinoglicano "in vitro"también en A. tumefaciens.

En el presente trabajo se estudió la síntesis de un lípido-trisacárido y su papel en la biosíntesis de la porción azúcar de las glicoproteínas. Se pueden considerar tres aspectos en esta investigación: Biosíntesis del Dolicol-P-P-N-acetilglucosamina. Microsomas de oviducto de gallina incubados con dolicol-P, Mg++, detergente y UDP 14C GlcNac catalizan la transferencia de la GlcNac a un compuesto soluble en la fracción lipídica. Por hidólisis ácida suave del lípido-azúcar, seguida de cromatografía en papel, se obtiene unicamente 14C GlcNac. La formación del lípido- de N-acetilglucosamina se incrementa por la adición de cantidadas crecientes de dolicol-P. Se estudiaron también las condiciones óptimas de incubación. Se compararon estos resultados con los obtenidos a partir de microsomas de hígado de rata. Biosíntesis del Dolico-P-P-di-N-acetilquitobiosa. lncubando dolicol-P-P-N-acetilglucosamina radioactivo y UDPGIcNac, no marcado, con microsomas de oviducto de gallina, en presencia de Mg++ y detergente, se obtiene la formación de un nuevo lípidoazúcar. Este nuevo compuesto es lábil al tratamiento ácido suave y el resto hidrofílico fue identificado por cromatografía en papel y por digestión con β-N-acetilglucosaminidasa como la di-N-acetilquitobiosa (2-acetoamido-2deoxi-0- β -D-glucopiranosil-( 1-4)-2 acetoamido-2 deoxi-D-glucosa).Se estudió también la síntesis de este disacárido en distintos tejidos y las condiciones óptimas para obtener un mejor rendimiento. Se presentan evidencias de que este lípido-disacárido, al igual que el de GlcNac son derivados del dolicol-pirofosfato. La biosíntesis de estos dos lípido-azúcares había sido descripta anteriormente en este Instituto, (110), con preparaciones de microsomas de hígado. Biosíntesis del lípido-trisácarido. Manosa puede ser transferida desde guanosina difosfato manosa al dolicol-P-P-di-N-acetilquitobiosa cuando estos sustratos se incuban con microsomas de oviducto de gallina en presencia de Mg++ y detergente. Por hidrólisis-ácida suave del compuesto formado se obtiene un oligosacárido que por cromatografía en papel con distintos solventes y por acción de diferentes glicosidasas parece ser el siguiente trísacarido: β-manosil-β-N-acetilglucosaminil-( 1-4)-N-acetilglucosamina. Se estudiaron las condiciones experimentales para la formación de este lípido-trisacárido. El lípido-trisacárido puede ser sintetizado con microsomas preparados a partir de otros tejidos. En ciertas condiciones experimentales se puede transferir más moléculas de manosa formándose un lípido-oligosacárido de mayor tamaño. Parte de estos resultados se han presentado en la IX y X Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigaciones Bioquímicas (151) (152) y han sido publicadas en el Biochemical and Biophysical Research Communications, (153).

Fil:Kotler, Mónica Lidia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Sopena de Kracoff, Yolanda Elvira. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

• Se estudian las condiciones de determinación de actividad del sistema descarboxilante que transforma uroporfirinógeno III en coproporfirinógeno III (Porfirinógeno carbozi-liasa) en eritrocitos de pollo, hallándose que la reacción está favorecida por anaerobiosis, pH aproximadamente neutro, glutation y EDTA. El MgCl2 no tiene ningún efecto y la cisteína y el β-mercaptoetanol son inhibidores. • Se realiza una purificación de dicho sistema, basada en procesos de intercambio iónico sobre DEAE-Celulosa (en tanda o "batch" y en columna) y precipitaciones salinas. Se obtiene de ese modo una proteína activa, homogénea de acuerdo a su comportamiento electroforético. Ciertas evidencias indican que podría tratarse de una sola especie molecular. • Se estudian algunas características del sistema enzimático: es relativamente estable en un estado intermedio de pureza, es lábil al calor y parace poseer grupos sulfhidrilos y disulfuros que deben mantenerse como tales para que no se pierda actividad. Se encontró un efecto activador no clásico del glutation. • Durante el curso de la descarboxilación enzimática del uroporfirinógeno se detectan los porfirinógenos de 8 a 4 carboxilos y durante la del firiaporfirinógeno, los de 7 a 4 carboxilos. • Se verifica la existencia de dos etapas en la reacción de descarboxilación: 1) 8-COOH → 7-COOH y 2) 7-COOH → 4-COOH porfirinógeno, siendo la velocidad de la primera mayor que la de la segunda. • La velocidad de cada una de las etapas mencionadas tiene diferente susceptibilidad frente a diversos agentes: calentamiento del sistema enzimático, oxígeno, sales, uroporfirina III. Todos ellos inhiben en mayor grado la segunda etapa. El aumento de la temperatura de reacción hace incrementar en mayor proporción la velocidad de la primera etapa. • Se estudia la cinética de las reacciones de descarboxilación enzimática, determinándose los siguientes valores de Km aparentes: 5x10^(-6) M para el uroporfirinógeno III y 1,3x10^(-6) M para el firiaporfirinógeno III. Se observan efectos de inhibición por sustrato tanto con uroporfirinógeno como con firiaporfirinógeno. El uroporfirinógeno inhibe su propia descarboxilación y probablemente la de firiaporfirinógeno a coproporfirinógeno. El firiaporfirinógeno inhibe también su propia descarboxilación y, además, la del uroporfirinógeno. En base a los resultados obtenidos, se discuten en una forma general el mecanismo de descarboxilación para la serie III y las inhibiciones por sustrato. • Se describen las características de la descarboxilación del uroporfirinógeno I a coproporfirinógeno I, que presenta diferencias frente a la serie III. Aparte de ser menos veloz, es distinta la distribución cuantitativa de los productos de descarboxilación parcial. El intermediario de 7 carboxilos no se acumula como en el caso de la serie III y el de 5 carboxilos se encuentra presente en mayor cantidad que en la serie III.

En esta tesis se estudia la biosíntesis del munano,uno de los principales componentes de la pared celular de la levadura. Se desarrolla una técnica de obtención de la enzima a partir de la descripta por Algranati, Carminatti y Cabib (1). La enzima se prepara reproduciblemente en forma particulada. Este resultado es coherente con el hecho que debe sintetizar un componente estructural de la célula como es el manano en la pared celular. Dos métodos rápidos de dosaje que se desarrollan, permiten acelerar la obtención de los resultados. Empleando GDP-manosa14C en la manosa, en el primero se separa el exceso de CDP-manosa14C del manano 14C formado sometiendo la mezcla de reacción a una electroforesis, mientras que en el segundo se separan por precipitación del manano con etanol 66%. Mediante gradientes de sacarosa se intenta fraccionar e identificar a la partícula subcelular a la cual se encuentra unida la enzima. Se estudiaron varias propiedades de la enzima. Se determinó que requiere específicamente Mn++ para su actividad. No se pudo detectar un requerimiento de aceptor, de manera que la enzima tendría un aceptor endógeno asociado. Se estudió la estructura del producto, comparandola con la estructura del manano natural. Se determina que posee las mismas uniones químicas y que la enzima une por lo menos tres manosas en forma consecutiva. Con estos resultados se demuestra que lo que se sintetiza es efectivamente manano. Como el manano posee tres tipos de uniones químicas en su estructura a1->6 al->2 y a1->3, es posible que exista más de una enzima responsable de su síntesis. Se determinó que en la reacción la guanosina aparentemente se libera como una mezcla de GDP y GMP. Este resultado podría ser explicado por 1a acción de dos enzimas distintas. Se estudia algunas propiedades de 1a unión que mantiene al manano formado por la enzima unido a una partícula subcelular sedimentable, a diferencia del manano purificado, que es perfectamente soluble. Se determinó que la unión es muy sensible a cambios del pH y es posible destruirla por acción de enzimas específicas. El conocimiento del mecanismo de la biosíntesie del manano,junto con los estudios que deberán efectuarse sobre la formación de los demás componentes de la pared celular, podrá servir para llegar finalmente a sintetizar una pared celular in vitro.