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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016

Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Las S-layers son estructuras externas de una sola especie de (glico) proteína, Se calcula que aproximadamente 5×105 monómeros de la proteína S-layers son necesarios cubrir una célula bacilar procariótica. Las funciones biológicas que se han sugerido para las S-layer son aún hipotéticas y requieren de mayor comprobación experimental. Se las asocia con roles de protección contra enzimas hidrolíticas, cambios de pH y estrés, la captación de moléculas y iones. Otra posible función que cumplirían sería la de adhesina, facilitando que la bacteria se adhiera a distintas superficies y ayudar a mantener la forma y rigidez de la célula. Durante el transcurso de mi tesis de Doctorado, he elegido a la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus, la opción de este microorganismo se debió a las características probióticas y la importancia del mismo en la industria alimentaria. Se caracterizó una nueva función biológica para la proteína S-layer de Lactobacillus acidophilus ATCC4356 que no había sido descripta previamente. La capacidad de murein-hidrolasa es una característica nueva que cumpliría un rol adaptativo en esta bacteria. La actividad lítica de la proteína S-layer de demostró sobre la pared celular y células enteras de Salmonella entérica serovar Newport el cual fue usada como patógeno modelo. Esta actividad respaldaría la característica probiótica de la cepa de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 (Prado Acosta et al. 2008). También se utilizó a la S-layer como compuesto sinérgico con el antibiótico nisina, esto sirvió para disminuir la concentración inhibitoria minima casi un 50 % en organismos patógenos del tracto intestinal como Bacillus cereus y Staphylococcus aureus (Prado Acosta et al. 2009). Nuestros resultados también mostraron una variación de la expresión de S-layer en Lactobacillus acidophilus creciendo en condiciones de alta salinidad y se mostró que son de gran importancia para la supervivencia de la célula en estas condiciones.