El retículo endoplasmático (RE)es el compartimiento subcelular involucrado en la síntesis, modificación post-traduccional y plegamiento de proteínas y glicoproteínas que serán destinadas a secreción, membrana plasmática o distintas organelas de los sistemas endocítico y exocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales más frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas. Numerosas proteínas son incapaces de alcanzar su conformación nativa sin la adición de N-oligosacáridos. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados proteicos son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia los complejos de Golgi se lleva a cabo exclusivamente cuando las proteínas se han plegado correctamente y se han ensamblado los multímeros. Este importante fenómeno, que asegura la integridad funcional de las proteínas que salen del RE,ha sido denominado "control de calidad". En el caso de las glicoproteínas, la estructura y el grado de procesamiento de sus N-oligosacáridos resulta ser una señal para la retención en el RE o el transporte hacia los complejos de Golgi. La N-glicosilación de proteínas comienza en la mayoría de las células eucariotas, con la transferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol-P-P-oligosacárido), a cadenas polipeptídicas nacientes en el lumen del RE.Sin embargo la Glc no es un componente normal de las N-glicoproteínas maduras. Inmediatamente luego de la transferencia, los residuos de Glc son removidos por las glucosidasas I (GI) y II (GII). Los N-oligosacáridos libres de Glc son reglucosilados transitoriamente por la UDPG-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT)y deglucosilados posteriormente por la GII. De acuerdo al modelo actualmente aceptado, la calnexina (CNX), la calreticulina (CRT), la GII y la GT intervienen en el control de calidad de plegamiento de glicoproteínas en el RE. A medida que las glicoproteínas van adquiriendo sus conformaciones nativas, alternan entre formas no glucosiladas y monoglucosiladas por efecto de las actividades catalíticas opuestas de la GII y de la GT. Las dos chaperonas moleculares no convencionales con propiedades de lectinas, CNX y CRT, que reconocen exclusivamente N-oligosacáridos monoglucosilados, unirían glicoproteínas en proceso de plegamiento o incorrectamente plegadas, reteniéndolas en el RE. Los ciclos de deglucosilación y reglucosilación continuarían hasta que el plegado correcto de las glicoproteínas se haya completado. Cuando las mismas adoptan su conformación nativa, se convertirían en sustrato de la GII, pero no de la GT, y se liberarían de las lectinas. Las glicoproteínas bien plegadas continuarían su camino por la vía secretoria hacia su destino mientras que las que se encuentran en proceso de plegamiento, serían retenidas en el RE y eventualmente translocadas al citoplasma para ser degradadas en el proteasoma. ' En este ciclo la GT funcionaría como un sensor del estado conformacional de las glicoproteínas, marcándolas o no con el residuo de Glc que determinará su unión a CNX o CRT. La GT fue purificada a homogeneidad a partir de Drosophila melanogaster,Rattus norvegicus y Schizosaccharomyces pombe,y demostró ser una proteína soluble del RE que depende de Ca2+ para su actividad y que utiliza UDP-Glc como dador de Glc. En cuanto a la glicoproteína aceptora, en un ensayo libre de células, ésta debe estar desnaturalizada para funcionar eficientemente como aceptor. La enzima reconoce el residuo más interno de GlcNAc de los N-oligosacáridos, y amino ácidos hidrofóbicos expuestos en las conformaciones no nativas de las glicoproteínas sustrato. Experimentos presentados en este trabajo de tesis demuestran que: (a) la GT de S. pombe es una enzima conformada por dos dominios: el dominio C-terminal (400 amino ácidos, altamente conservados entre GTS, 20% de la molécula), responsable de la interacción con UDP-Glc; y el dominio N-terminal (1100 amino ácidos, pobremente conservados entre GTs, 80% de la molécula) posiblemente responsable de la interacción de la GT con amino ácidos hidrofóbicos, confiriéndole a la enzima especificidad por glicoproteínas no totalmente plegadas. La unión entre ambos dominios se puede clivar proteolíticamente, pero ellos interaccionan a través de uniones no covalentes y no pueden separarse sin pérdida de la actividad enzimática. Esto explicaría el porqué la GT solo glucosila N-oligosacáridos muy cercanos al sitio mal plegado de la parte proteica (ver Discusión). Esta estructura de dos dominios está conservada desde levaduras a eucariotes superiores. (b) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a la GT de S. pombe, expresados separadamente en una misma célula S. pombe GT pueden formar una enzima activa y ser capaces de transferir Glc a glicoproteínas mal plegadas. (c) Los dominios N-terminal y C-terminal correspondientes a GTS de distintas especies, resultan ser intercambiables. (d) El dominio C-terminal correspondiente a la GT de S. pombe requiere la presencia del dominio N-terminal para plegarse correctamente y formar un complejo biológicamente activo, y/o para ser estable en el lumen del RE.