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El glaucoma, una de las principales causas de ceguera irreversible, se caracteriza por una pérdida progresiva de las funciones visuales, que se asocia a la muerte de células ganglionares retinianas (CGRs) y atrofia de la cabeza del nervio óptico (NO). El principal factor de riesgo es el aumento de la presión intraocular (PIO). Aunque el glaucoma fue concebido como una enfermedad limitada al ojo, los axones de las CGRs son extraoculares, con componentes intraorbitales e intracraneales. En este trabajo de Tesis se examinaron los efectos del glaucoma experimental agudo y crónico sobre el sistema visual consciente (SV-C) y el sistema visual no formador de imagen (SV-NFI). El SV-C en la rata, se compone de las CGRs clásicas y sus axones que proyectan al colículo superior (CS) y al núcleo geniculado lateral (NGL). El SV-NFI se compone por las CGRs intrínsecamente fotosensibles que expresan melanopsina (CGRsm) y proyectan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ), al núcleo pretectal olivar (NPO) y al intergeniculado (IG), que participan en la sincronización del reloj circadiano y el reflejo pupilar, entre otros. El modelo de glaucoma agudo consistió en un aumento de la PIO a 70 mm de Hg durante 90 min (hipertensión ocular aguda, HOA), en tanto que el glaucoma crónico se indujo a través de inyecciones intracamerales de condroitín sulfato (CSU), una vez por semana, durante 15 semanas. A los 7 días post-HOA se observó una alteración significativa de la función y estructura retinianas, con una pérdida significativa de CGRs, así como cambios astro- y microgliales en el CS y una disminución en el transporte anterógrado desde la retina al CS y NGL, pero no a los NSQ y al NPO. El número de CGRsm, los niveles de melanopsina y el reflejo pupilar consensual permanecieron inalterados aún a las 4 semanas post-HOA. La administración de CSU por 6 semanas indujo alteraciones en la función retiniana y en la vía visual, una disminución en el transporte anterógrado a todas las áreas de proyección y cambios gliales a nivel del NO, el CS y la retina. En el CS, estas alteraciones incluyeron una marcada respuesta micro- y oligodendroglial y una moderada respuesta astrocitaria, que se acompañaron de una disminución del contenido lipídico. A las 15 semanas de glaucoma crónico, estas alteraciones fueron más marcadas e incluyeron alteraciones en los axones, sin afectar el número de neuronas coliculares. La minociclina previno algunas de las alteraciones inducidas por la hipertensión ocular crónica, como el déficit en el transporte anterógrado desde la retina al CS. En cuanto al SV-NFI, el glaucoma crónico indujo una caída significativa en el número de CGRsm y los niveles de melanopsina, así como en el transporte desde la retina a los NSQ y el NPO, con una disminución en el reflejo pupilar consensual. En suma, los resultados obtenidos en esta Tesis aportan datos de relevancia respecto a la participación de las áreas visuales post-retinianas en el daño glaucomatoso. Palabras clave: células ganglionares, glaucoma, glía, hipertensión ocular, minociclina, sistema visual consciente, sistema visual no formador de imagen, transporte axonal.

En la fase aguda de la enfermedad de Chagas, la infección por T. cruzi produce una intensa respuesta inflamatoria en diversos tejidos del organismo incluso en el corazón, donde los miocardiocitos constituyen un importante blanco. Si bien la reacción inflamatoria es importante para el control inicial de la infección, un desequilibrio o una mala resolución de la misma puede generar daños y alteraciones en la funcionalidad cardíaca. Las células cardíacas responden a la infección mediante la expresión de enzimas inflamatorias como óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) y metaloproteasas (MMPs) y citoquinas como TNF-α e IL-6. Esta respuesta está mediada por la activación de vías de señalización que incluyen al factor de transcripción nuclear-ĸB (NF-ĸB) y a las quinasas reguladas por señales extracelulares-proteínas quinasas activadas por mitógenos (ERK1/2-MAPK), cuya participación es fundamental en procesos inflamatorios. Los receptores activados por factores de proliferación peroxisomal γ (PPARγ) son factores de transcripción dependientes de ligando que han sido implicados en la regulación del metabolismo lipídico y de procesos inflamatorios. En este trabajo evaluamos el aporte de 15-deoxi-Δ12,14-prostaglandina J2 (15dPGJ2), ligando natural de PPARγ y de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en la resolución de la respuesta inflamatoria en cultivos primarios de miocardiocitos neonatales de ratón infectados con la cepa letal pantrópica/reticulotrópica (RA) de T. cruzi. Los resultados de esta evaluación evidencian que 15dPGJ2 es capaz de inhibir la expresión y actividad de diferentes enzimas inflamatorias como NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de las citoquinas proinflamatorias TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. Los efectos inhibitorios ejercidos por 15dPGJ2 involucran participación de mecanismos dependientes e independientes de PPARγ. La contribución de su receptor en los efectos ejercidos por 15dPGJ2 fue confirmada al silenciar la expresión mediante ARN de interferencia (siARN-PPARγ). Por otro lado, a partir de la utilización de inhibidores específicos de ERK1/2 y de NF-ĸB, demostramos que 15dPGJ2 también ejerce sus efectos de manera independiente a PPARγ, a través de estas vías. IL-10 es una de las principales citoquinas antiinflamatorias y fue identificada originalmente como un factor inhibidor de la síntesis de citoquinas proinflamatorias y modulador de ciertas funciones asociadas a la activación de macrófagos y/o monocitos. En este trabajo se describe que la adición de IL-10 exógena inhibe la activación de las vías de señalización de ERK1/2 y de NF-ĸB y reduce los niveles de expresión y actividad de NOS2, MMP-9 y MMP-2, así como la expresión de TNF-α e IL-6 inducidas por la infección. La señalización por IL-10 a través de su receptor promueve fosforilación de STAT3, el cual actúa como factor de transcripción induciendo la expresión de proteínas supresoras de la señalización por citoquinas-3 (SOCS-3). Tanto la infección con T. cruzi como IL-10 inducen fosforilación de STAT3 y la expresión del ARNm de SOCS-3. El silenciamiento de la expresión de esta proteína mediante ARN de interferencia (siARNSOCS- 3) pone en evidencia la participación de la vía STAT3/SOCS-3 en los efectos ejercidos por IL-10. El conocimiento más profundo sobre el papel de ligandos de PPARγ y de IL-10 podría ser de gran utilidad para formular estrategias alternativas o coadyuvantes de la terapéutica clásica en la infección por T. cruzi.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015

KSHV es un oncovirus implicado en Sarcoma de Kaposi (KS) y otros cánceres asociados a SIDA. KS es un neoplasma caracterizado por la proliferación de células ahusadas y la intensa angiogénesis. Los mecanismos a través de los cuales KSHV causa la respuesta angioproliferativa de KS se desconocen y la reproducción de todos los aspectos de KS mediante infección experimental por KSHV aún no ha podido ser demostrada. El receptor acoplado a proteína-G (vGPCR) de KSHV puede estimular cascadas de señalización que inducen angiogénesis y transformación celular. Identificar estas cascadas puede tener significancia terapéutica. Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un medidor involucrado en angiogénesis tumoral que puede ser regulada por antinflamatorios (AINEs). En la primera parte de este trabajo demostramos que vGPCR regula la actividad y la expresión de COX-2 vía ERK-1/2. Encontramos que la inhibición de COX-2 impide la angiogénesis inducida por vGPCR y que la administración del AINE Celecoxib retarda el crecimiento tumoral con disminución en la vascularata y producción de VEGF. Así, COX-2 sería uno de los componentes moleculares del cambio angiogénico de vGPCR y un posible blanco terapéutico. En la segunda parte mostramos que la transfección con KSHV clonado en un Cromosoma Artificial Bacteriano (KSHVBac36) en preparaciones de médula ósea murinas enriquecida en precursores de células endoteliales (mEC) es suficiente para inducir tumorigénesis y llevar al cambio fenotípico angiogénico. Las células mEC transfectadas con KSHVBac36 (mECK36) estaban infectadas con KSHV, secretaban VEGF, eran angiogénicas in vivo e indujeron en ratones inmunodeficientes la formación de sarcomas de células ahusadas vascularizados que expresaban LANA y marcadores característicos de KS. La inhibición de la expresión de vGPCR en las mECK36 utilizando siRNA condujo a la inhibición de su angiogenicidad y tumorigenicidad. Estos resultados definen un modelo animal para estudiar la patogénesis de KS mediada por KSHV y señalan a vGPCR como uno de sus principales oncogenes angiogénicos.

El objetivo principal de esta tesis fue avanzar en el esclarecimiento del “efecto glucosa” sobre la regulación de la biosíntesis del hemo con el propósito de elaborar nuevas y/o más eficaces terapias para el manejo de las crisis de las porfirias agudas (PAs). Con este fin se generó un modelo murino de diabetes mellitus tipo 1 y se utilizó el vanadato (V) como un agente insulino-mimético. Ratones machos CF1 fueron diabetizados con una única dosis de estreptozotocina (STZ 170 mg/kg peso) y recibieron V (0,2 mg/ml) en el agua de bebida. El estudio se prolongó 32 días a partir de la inyección de STZ. Se estudió la expresión de los ARNms de la delta aminolevulinato sintetasa (ALA-S1) y de la ferroquelatasa (FQ) así como los niveles de sus proteínas y de las proteínas participantes en la vía PI3K/Akt. En los animales diabéticos a los 32 días de inyectados con STZ el ARNm y la proteína del ALA-S1 aumentaron observándose también una caída en la fosforilación de Akt y un incremento en la formación del complejo nuclear FOXO-PGC-1α. El vanadato revirtió este efecto a través de la activación de la vía PI3K/Akt reduciendo los niveles nucleares de dicho complejo. A los 32 días de inyectados con STZ el estado diabético produjo un aumento en el ARNm de la FQ que no fue acompañado por un incremento en los niveles de su proteína mientras que el vanadato provocó una caída en ambos parámetros. La inducción del ARNm de la FQ se debió a un incremento en la O-Glicosilación de Sp1 mientras que el vanadato revirtió este efecto. De acuerdo con estos resultados, la FQ es un segundo punto de control de la vía biosintética del hemo y el V es un posible agente terapéutico para los ataques de PAs.

Moragas, M. (2020). Estudio de los reservorios virales en la infección por HIV-1 en pediatría: caracterización de las formas virales latentes y su comportamiento durante el tratamiento antirretroviral combinado. (Tesis de doctorado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina

La isquemia es un componente central de diversas enfermedades retinianas que pueden provocar ceguera irreversible. Al presente, no existen tratamientos efectivos frente al daño isquémico retiniano. En este trabajo de Tesis se demostró por primera vez, que el post-condicionamiento isquémico (PostC) inducido por la aplicación de pulsos breves de isquemia en forma posterior a una isquemia prolongada, revierte significativamente las alteraciones funcionales e histológicas provocadas por una isquemia retiniana deletérea. En cuanto a los mecanismos involucrados en este fenómeno, los resultados obtenidos sugieren la participación de la síntesis de novo de proteínas y la actividad de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa. Además, se demostró que el daño isquémico, al menos en parte, es causado por un aumento en las concentraciones sinápticas de glutamato y que el PostC podría proteger a la retina al disminuir este parámetro. A continuación, se realizó una caracterización del daño de la retina y la vía visual en un modelo de retinopatía diabética experimental inducido por la inyección de estreptozotocina (STZ). A nivel retiniano, se observaron alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas significativas. En estadíos tempranos luego de la inyección de STZ se observaron alteraciones axo-gliales en la porción distal del nervio óptico, que podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual diabética. El condicionamiento isquémico (aplicación de pulsos semanales de isquemia) revirtió significativamente todas estas alteraciones, tanto a nivel de la retina como de la vía visual. Asimismo, los resultados obtenidos sugieren que la disminución en los niveles de VEGF y la restauración de la actividad de glutamina sintetasa podrían participar activamente en la protección inducida por el condicionamiento isquémico frente a las alteraciones provocadas por la retinopatía diabética. Finalmente, se demostró que las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles en particular, y el sistema visual no formador de imagen en general, se preservan en etapas avanzadas de diabetes. En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales en la comprensión de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia aguda y por diabetes, así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la inducción de tolerancia isquémica. La demostración de que el sistema visual no formador de imagen es menos susceptible al daño diabético representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico de transducción de la información luminosa.

La tesis se centra en el estudio de diferentes sistemas antioxidantes presentes en parásitos humanos. Entamoeba histolytica, un parásito intestinal, se expone a cantidades elevadas de especies reactivas del oxígeno (ERO) durante la invasión de tejidos. En primer lugar, esta tesis abarca estudios bioquímicos realizados para llegar a un mejor entendimiento de las propiedades cinéticas y estructurales de una rubredoxina reductasa (EhNROR), una proteína flavodiférrica (EhFDP1), una rubreritrina (EhRr) y dos ferredoxinas (EhFd1-2) presentes en E. histolytica. Dichas proteínas componen sistemas enzimáticos que podrían contribuir a la detoxificación in vivo de O2 y H2O2, y por lo tanto jugar un papel clave en la virulencia del parásito. Se han hecho muchos esfuerzos para entender los mecanismos por los cuales los tripanosomátidos neutralizan las ERO pero se sabe poco sobre las proteínas responsables de la reparación de los daños causados por ellas. La metionina es un aminoácido susceptible de ser oxidado a metionina sulfóxido (MetSO). La reducción de MetSO a metionina es catalizada por las metionina sulfóxido reductasas (MSR), enzimas presentes en casi todos los organismos. MsrA y MsrB son las MSR más conocidas y reparan metionina-S-sulfóxido (Met-S-SO) y metionina-R-sulfóxido (Met-R-SO), respectivamente. Recientemente fue descripta una enzima de Escherichia coli (EcfRMsr), específica para Met-R-SO no peptídica. La segunda parte de esta tesis comprende la caracterización de los dos alelos de TcfRMsr presentes en el genoma diploide de Trypanosoma cruzi. Se llevó a cabo la clonación, expresión, purificación y caracterización enzimática de los dominios catalíticos N-terminales de ambos alelos.

Objetivo: Estimar la prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares en personas mayores de 18 años en la ciudad de Funes. Métodos:Se realizó un diseño descriptivo, transversal y observacional. De una muestra aleatoria, se reclutaron entre Setiembre 2011 y Diciembre 2014, 379 personas (173 varones y 206 mujeres) a quienes se administró cuestionario de factores de riesgo, toma de tensión arterial,medidas antropométricas, y determinaciones de glicemia y lípidos sanguíneos. Resultados: El 3,43 % de la muestra tenía enfermedad cardiovascular previa. La prevalencia de hipertensión arterial fue de 37,7 (32,9 – 42,5). La prevalencia de diabetes fue 8,4% (5,64 - 11,16). La prevalencia de hipercolesterolemia fue 35,1% (30,3 - 39,8). La prevalencia de tabaquismo fue 30,1% (25,5 - 34,7). La prevalencia de sobrepeso/obesidad fue 71,2% (66,7 - 75,7). El 48,5% (43,5 - 53,5) eran sedentarios. El 46,8% (39,4 - 54,2) de varones tuvieron perímetro de cintura mayor a 102 cm. y 49,8% (43,0 - 56,6) de mujeres mayor a 88 cm. Conclusiones: La prevalencia de factores de riesgo cardiovasculares es alta en la población mayor de 18 años de la ciudad de Funes. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas para hipertensión arterial, taba- quismo, diabetes y sedentarismo, comparados con la encuesta nacional de factores de riesgo 2013 para la región. No se pudieron comparar perímetro de cintura (no se midió en la encuesta nacional) y dislipidemias (se tomaron distintos criterios para su categorización) y la prevalencia de sobrepeso y obesidad fue más alta en la muestra, alcanzando esto último significación estadística.

En la presente tesis se desarrollaron nanopartículas de ovoalbúmina (OVAn) por medio de tratamiento térmico controlado para encapsular diferentes compuestos bioactivos. En primer lugar, se estudió la estabilidad fotoquímica de retinol encapsulado en OVAn y en partículas biopoliméricas obtenidas por la disposición electrostática de pectina de alto metoxilo sobre los nanocomplejos retinol-OVAn. Los resultados mostraron que en ambos sistemas el deterioro fotoquímico del retinol fue menor comparado con el retinol sin encapsular, siendo las biopoliméricas superiores a OVAn. Posteriormente se obtuvieron nanocomplejos entre OVAn y acido linoleico conjugado (CLA), viendo que los mismos aumentaban drásticamente la solubilidad acuosa del CLA. Los sistemas fueron sometidos a un protocolo consenso de digestión gastrointestinal in vitro observándose que las nanopartículas eran capaces de retener y preservar mas del 90% del CLA encapsulado tanto en la fase gástrica como intestinal. Finalmente, estos sistemas OVAn-CLA fueron evaluados por su actividad citotóxica frente a una línea celular de adenocarcinoma de colon humana HT29. Los resultados mostraron que las nanopartículas no eran toxicas para las células siendo el CLA es responsable de la citotoxicidad. Además, se determinó que el principal mecanismo de muerte celular fue apoptosis. Por último, es importante remarcar que estos sistemas de encapsulación con gran capacidad de solubilización y unión de compuestos bioactivos hidrofóbicos, podrían utilizarse como estrategia para diseñar nanoingredientes funcionales para alimentos.