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En líneas celulares de origen leucémico se han encontrado deleciones en el brazo corto del cromosoma 9, donde se localizan los genes del interferón de tipo I, lo que en un principio hizo suponer que el interferón se comportaba como un gen supresor de tumor. Se propuso ver si la producción de interferón estaba alterada en las leucemias linfoblásticas agudas (LLA), y si esas alteraciones génicas estarían relacionadas con la capacidad de producción de interferón a por las células malignas al ser inducidas con virus Sendai. Se determinó la capacidad de las células leucémicas de 21 pacientes de LLA, de la línea celular establecida K 562 y de dadores normales de producir interferón a "in vitro" al ser inducidos con virus Sendai con un priming de interferón α. La producción de interferón a por los blastos leucémicos y células normales fue muy variable oscilando entre 633 a 8850 pg/ml/5x10 6 células, no siendo estadísticamente significativo, tampoco se hallaron diferencias entre los subgrupos de LLA. En 4 de los 7 casos estudiados por Southern blot se pudo estudiar la producción de interferón α, presentando uno de ellos deleción de genes de interferón α. De las 21 leucemias en dos casos produjeron una cantidad de interferón α mínima. Esto sugiere que la malignidad en las LLA con baja producción de interferón α podría deberse a la pérdida de algún gen supresor de tumor. Se investigó la frecuencia y asociación de alteraciones del p 16, el interferón α y el interferón β en un total de 39 casos de LLA. De ellos, diez pacientes (25,6 %) presentaron anormalidades de al menos uno de los tres genes estudiados. Se encontró en un porcentaje del 13% deleciones en los genes del interferón α y β, así como también en los recientemente identificados genes supresores de tumor p15 y p16 (23%) los cuales se encuentran próximos a los genes el interferón. Estos datos indican que en las LLA, representando un cuarto de las LLA totales estudiadas el gen p16 está delecionado con mayor frecuencia que los genes de los interferones de tipo 1. Además de p16, el 37,5% está asociado con deleciones del interferón, sugiriendo una asociación entre ambas. Estos datos sugieren que la ausencia de p16, inhibidor de las ciclinas, podría modificar el ciclo celular normal y favorecer la transformación blástica. Su asociación con la deleción de los genes de los interferones de tipo I podría constituir eventos de la leucemogénesis. El porcentaje de deleciones, a su vez dependió del fenotipo de la célula leucémica, siendo mayor en los casos de LLA T que en aquellas precursoras B. Para un mejor tratamiento de la enfermedad es necesario partir de un buen diagnóstico, para lo cual se buscó detectar clonalidad, de tipo B o T por medio de la identificación de fragmentos reordenados, ya sea de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (clonalidad B) o de la cadena γ del receptor de los linfocitos T (clonalidad T). A su vez por medio de un mapeo de restricción se llegó a una correcta identificación del subtipo de reordenamiento Vγl en las LLA T. Esto cobra importancia, sobre todo para el seguimiento posterior de la enfermedad mínima residual, sin embargo no es suficiente para la determinación del linaje celular.

Para conocer los cambios, que la edad produce en la microdureza de la dentina y su posible influencia sobre la instrumentación de los conductos radiculares, se realizaron dos experiencias: La primera consistió en analizar la dureza dentinaria en raíces distases y palatinas de primeros molares inferiores y superiores, de edades conocidas, divididas en tres grupos etarios: Jóvenes (20 a 30 años, Adultos (40 a 50 años) y Adultos Mayores (> de 60 años). La segunda consistió en evaluar mediante un mecanismo de censores conectado a un sistema computarizado, las fuerzas que durante el trabajo mecánico son generadas por limas convencionales de acero, de acero flexibles y un sistema rotatorio (Profile). La determinación de la microdureza se hizo sobre cortes transversales rizados a 2 mm del ápice (Nivel 1) y a 4 m de aquél (Nivel 2), en los que se establecieron tres zonas (periconducto, intermedia y vecina al cemento) en el espesor dentinario extendido entre el conducto y el cemento. Esta experiencia se dividió en dos estudios (A y B) según el indenter del micródurometro fuera accionado con una carga de penetración de 50 o 100 grs. En el Estudio 'A' comprobamos que una carga de 50 grs. era insuficiente, puesto que la elasticidad dentinaria rechazaba el indenter -fenómeno que denominamos 'efecto rebote'- produciendo improntas que no reflejaban la realidad. Por el contrario, los obtenidos con una carga de 100 grs. (Estudio 'B'), permitieron comprobar que: a) la edad sólo tendría una manifiesta influencia en dientes menores de 30 años, ya que en edades mayores, la dureza dentinaria entraría en un período de estabilidad, b) la dureza a nivel del ápice de la raíz distal mostró ser significativamente menor que la detectada en la palatina, c) las diferencias entre los Niveles 1 y 2 fueron muy evidentes, especialmente en la raíz distal, d) la dureza de la dentina del periconducto fue significativamente menor que en las restantes, cualquiera fuera la edad del diente y nivel de la raíz estudiados. En cuanto a las fuerzas que los instrumentos producen sobre la pared dentinaria, se comprobó que los manuales de acero de uso mostraban un evidente incremento a medida que aumentaba la edad, por el contrario, las producidas por el sistema mecanizado fueron constantes y muy similares en los tres grupos etarios, observándose además respecto a las anteriores, un marcado incremento cuando eran generadas por el movimiento de impulsión y rotación. Se concluye, que la microdureza dentinaria pareciera no experimentar con la edad un incremento regular en todas las piezas dentarias, como tampoco dentro de un mismo diente. Aumentaría en forma progresiva hasta los 30 años, para luego entrar en un estado de equilibrio. Los sectores menos duros y por ende más vulnerables -cualquiera sea la edad del diente-, se encuentran siempre a nivel apical y dentro de él, en el espesor dentinario que delimita al conducto. Por otra parte, el sistema Profile genera más fuerza y presión que los instrumentos manuales, especialmente en el movimiento de impulsión y de rotación.

Bocai, N. I. (2019). Estudio de la neurotoxicidad de péptidos amiloides y proteína tau asociados a demencias humanas en el sistema nervioso de Drosophila. (Tesis de posgrado). Bernal, Argentina : Universidad Nacional de Quilmes.

La melatonina caracterizada originalmente en la glándula pineal fue más tarde identificada en la retina de diversas especies, así como las enzimas involucradas en su síntesis, la serotonina-N-acetiltransferasa (NAT) y la hidroxiindol-O-metiltransferasa (HIOMT). El hámster dorado ha sido considerado frecuentemente el modelo clásico para el estudio de la melatonina pineal, sin embargo, la melatonina retiniana en esta especie ha recibido relativamente poca atención. El objetivo de este trabajo de tesis consistió en examinar la biosíntesis del metoxiindol en la retina del hámster, así como elucidar algunos de los mecanismos involucrados en la regulación de su síntesis y su posible rol fisiológico a nivel local. En este sentido, se describe por primera vez la presencia de un ritmo en el contenido retiniano de melatonina en el hámster dorado, con valores máximos en la segunda mitad de la noche. La síntesis de melatonina en la retina del hámster es independiente de la actividad pineal. Asimismo, se demuestra la capacidad de las retinas aisladas de sintetizar melatonina. La síntesis de melatonina es regulada directamente por la señal fótica ambiental, sin indicación de la existencia de un ritmo de naturaleza endógena en los experimentos realizados en este trabajo. El GABA, postulado como un neurotransmisor retiniano regulatorio de procesos asociados a oscuridad, estimula la producción in vitro de melatonina retiniana, probablemente a través de receptores de tipo A, en tanto que antagonistas específicos del receptor GABAA suprimen el incremento in vitro de melatonina en oscuridad. El "turnover" de GABA es máximo en la fase de oscuridad y precede al aumento en el contenido de melatonina. En conjunto, estas evidencias sugieren que el GABA actúa como intermediario entre la señal de oscuridad y la inducción de la síntesis del metoxiindol. El AMPc ha sido postulado como la señal intracelular involucrada en la inducción génica de la NAT retiniana. La existencia de una correlación temporal entre el ritmo en el contenido de AMPc y el de melatonina (ambos regulados de manera análoga por la señal fótica ambiental) avala resultados previos. Sin embargo, en este trabajo se postula adicionalmente que el GMPc participa en la regulación de la síntesis de melatonina retiniana, tanto por sus efectos in vitro, como por la correlación temporal entre las variaciones diarias de ambas moléculas. Considerando que el GABA estimula la acumulación de GMPc, pero inhibe la de AMPc, se sugiere que el efecto gabaérgico sobre la síntesis de melatonina podría estar mediado por el incremento en los niveles de GMPc retinianos. Por otra parte, se demuestra que la melatonina estimula la producción de GMPc, a través de una acción dual sobre la síntesis y degradación, ambos efectos tendientes al incremento en los niveles del nucleótido cíclico. La activación de la enzima de síntesis, así como la inhibición de la enzima de degradación podrían ocurrir a través de la disminución de los niveles de calcio citoplasmático. En este sentido, la melatonina inhibe en forma inmediata (luego de 10 seg) la captación de 45Ca2+ en fracciones sinaptosomales crudas. La melatonina incrementa la captación de 3H-glutamato, a través de un mecanismo independiente del calcio extracelular, así como la liberación de 3H glutamato, por un mecanismo dependiente del catión. La exposición más prolongada a melatonina (durante 20 min) estimula la captación de 45Ca2+ por fracciones crudas sinaptosomales. Considerando que análogos permeables del GMPc provocan efectos similares a los de la melatonina sobre estos parámetros, el metoxiindol podría actuar a través del incremento en el contenido del nucleótido. En este trabajo de tesis, se describe también la presencia de receptores específicos, de alta afinidad, con un perfil farmacológico compatible con el descripto para receptores de melatonina de tipo ML-1. Los resultados sugieren además que estos receptores podrían estar acoplados con una proteína G inhibitoria. De este modo, la melatonina disminuye significativamente los niveles retinianos de AMPc, quien a su vez podría actuar como un segundo mensajero del metoxiindol y/o regular negativamente su propia síntesis. En todos los casos, los efectos de la melatonina fueron dependientes del horario, mostrando una alta correlación con la variación diaria en la concentración de receptores al metoxiindol. La densidad máxima se observó a la medianoche, coincidiendo con el horario de máxima sensibilidad. La variación diaria en la concentración de sitios receptores podría deberse a mecanismos de "up y down-regulation" inducidos por el ligando endógeno. En conjunto, los resultados obtenidos permiten postular la participación de la melatonina retiniana en los mecanismos de transducción y procesado de la información fótica como una señal "senso-parácrina", es decir una molécula sintetizada y liberada por los fotorreceptores en respuesta a un estímulo sensorial (la oscuridad) y que actúa localmente modulando diversos aspectos de la fisiología retiniana.

La determinación de la forma del arco inferior y la conformación del arco de trabajo es un factor preponderante en la mecánica ortodoncica como en la estabilidad post-tratamiento. Es importante comprender que ante las diferentes formas de arco que se pueden presentar, son insuficientes las formas en que se presentan los arcos preformados, siendo indispensable la necesidad de individualizar los arcos de acero para cada caso a tratar. La técnica desarrollada en este trabajo puede ser reproducida fácilmente y brinda al profesional una variada cantidad de formas diferentes de arco, esto es una ventaja sobre aquellos métodos que poseen unas pocas formas.

El presente trabajo de tesis realizado en un modelo celular tuvo como finalidad la comprobación de la hipótesis de que el hinchamiento hipotónico promueve la liberación de Óxido Nítrico (NO). Utilizando miocitos cardíacos de rata demostramos, a partir de la medición de la fluorescencia de DAF-FM, que el hinchamiento hipotónico promueve la liberación de NO. La utilización de inhibidores como L-NAME (inhibidor inespecífico de las NOS), nitroguanidina (inhibidor especifico de nNOS), wortmanina (inhibidor de eNOS) y rianodina+ácido ciclopiazónico (inhibidores de la función del retículo sarcoplasmático (RS)), y a través del uso de una maniobra no farmacológica que consistió en realizar los experimentos en miocitos de ratones que tienen delecionado funcionalmente el gen NOS1 para la nNOS (NOS1KO) pudimos comprobar que la isoforma responsable en la producción de NO durante el hinchamiento hipotónico era la nNOS ubicada en el RS. Luego, con el objetivo de evaluar los mecanismos por los que se traducía la deformación de la membrana plasmática en la activación de la nNOS durante el hinchamiento hipotónico, evaluamos la fluorescencia de DAF-FM en presencia de colchicina (inhibidor de la polimerización de los microtúbulos) y de dorsomorfina (inhibidor de la proteína dependiente de AMP (AMPK)). En base a los resultados obtenidos pudimos comprobar que el citoesqueleto estaría sensando la deformación de la membrana y lo traduciría en la activación de AMPK con el consecuente aumento de la producción de NO mediado por la nNOS. A través de la medición de la amplitud del transitorio de Ca2+ y el acortamiento celular de los miocitos cardíacos en ausencia y presencia de diferentes inhibidores como los antes mencionados para inhibir las NOS y además ODQ (inhibidor de la guanilato ciclasa soluble (GCs)) y KT5823 (inhibidor de la proteína quinasa G (PKG)) pudimos observar que el NO estaría generando soporte contráctil a través de un mecanismo dependiente de GMPc/PKG durante el efecto inotrópico negativo (EIN) asociado al hinchamiento hipotónico. Este soporte contráctil se debería a un mecanismo dependiente de GMPc/PKG que promueve que el sitio Ser2808 del receptor de rianodina (RyR2) esté más fosforilado provocando que este receptor esté más sensibilizado frente a un dado Ca2+ citosólico generándose un mayor transitorio de Ca2+ y así el soporte contráctil. Por otro lado, observamos que exponer a los miocitos adultos a una solución hipotónica mejora su supervivencia y que el NO no estaría mediando este efecto.

La alergia a las proteínas de la leche de vaca (ALV) es la alergia alimentaria que se presenta con mayor prevalencia en el mundo y en nuestro país, pudiendo afectar hasta un 10% de la población pediátrica. En las últimas décadas se han producido cambios en la epidemiología de las reacciones alérgicas y, en particular, las alergias alimentarias han despertado una especial atención porque constituyen lo que se ha llamado la segunda ola epidémica de alergia. Además, se ha agravado la forma en que se presentan, reportándose mayor incidencia de anfilaxias causadas por alimentos. Por estos motivos, existe un marcado interés en comprender la fisiopatogenia de estos desórdenes inflamatorios y el desarrollo de terapias correctivas del defecto inmunológico que se produce en estos pacientes. Dado que las reacciones IgE-dependientes son las más prevalentes y las que originan reacciones anafilácticas, resulta crítico comprender las bases moleculares y celulares de la síntesis de la IgE. En el presente trabajo de Tesis se decidió abordar el estudio de la asociación entre la ALV y el desarrollo de pólipos juveniles (PJ) colorrectales en pacientes pediátricos que presentan sangrado rectal al momento del diagnóstico, e investigar la biología de la IgE. A partir de la caracterización del infiltrado inflamatorio alérgico que domina el estroma de los PJ, en los cuales la frecuencia de células mononucleares y eosinófilos está significativamente elevada, estudiamos distintos marcadores de una respuesta TH2-dependiente. Encontramos que las citoquinas tipo 2, interleuquina- (IL-) 4, IL-5 e IL-13, se encuentran significativamente elevadas en el estroma de los pólipos, como así también las alarminas IL-33 y TSLP, mediadores pro-inflamatorios que intervienen en las primeras etapas de una reacción alérgica. A partir de la historia clínica y los resultados positivos de la serología para IgE de los pacientes con PJ, estudiamos la localización y mecanismos de síntesis de la IgE. Encontramos centros germinales activos en la lámina propia de los PJ y marcadores biológicos que indican una síntesis local de IgE a través de mecanismos de recombinación para cambio de isotipo directo y secuencial. Asimismo, encontramos que en centros germinales individuales se sintetizan más de un isotipo de inmunoglobulina y que, según un análisis sin distinción del isotipo, se emplean genes variables de las familias VH1/7, VH3 y VH5 en la síntesis de las regiones variables de las cadenas pesadas. Como control se analizaron en todos los casos biopsias de tejido colónico adyacente a los pólipos, donde no encontramos un infiltrado inflamatorio, ni IgE, o citoquinas tipo 2. Por lo tanto, en el estroma de los PJ existen centros germinales en los que se sintetiza IgE, donde el nivel de IgE presente allí se correlaciona con la concentración de IgE presente en el plasma de cada individuo. Estos resultados en su conjunto permitirían alcanzar un mejor conocimiento de la regulación de los procesos alérgicos, de la localización y mecanismos de síntesis de IgE, y sobre la asociación entre el sangrado rectal, la presencia de pólipos colorrectales y la síntesis mucosal de IgE. Por lo tanto, es importante estudiar en pacientes con sangrado rectal la presencia de pólipos y la potencial asociación con una enfermedad alérgica para indicar la remoción de los pólipos, y definir una conducta terapéutica.

La enfermedad de Alzheimer (EA) y las demencias familiares Británica (DFB) y Danesa (DFD) se caracterizan por la acumulación progresiva de péptidos amiloides y proteína tau hiperfosforilada en el cerebro. Nuestra hipótesis es que la toxicidad de péptidos amiloides depende de una vulnerabilidad neuronal intrínseca asociada al envejecimiento. Para estudiar ello, generamos líneas de Drosophila melanogaster transgénicas para los péptidos Aβ42 (EA), ABri (DFB), ADan (DFD) y Bri2-23, el producto salvaje del precursor de ABri y ADan como control. Utilizando el sistema GAL4/UAS, demostramos que los niveles moderados de amiloides fueron suficientes para provocar toxicidad en el ojo y el sistema nervioso central (SNC) dependiente del envejecimiento. Ensayos de morfometría, Western blots, análisis histoquímicos y comportamentales mostraron que ADan fue más agresivo que ABri y Aβ42, en forma concurrente con los fenotipos en humanos. Grupos neuronales específicos mostraron resistencia a la toxicidad (circuito “pdf”) y sólo algunos evidenciaron estrés de retículo endoplásmico a pesar de la sobre-expresión pan-neuronal de los amiloides. Estos resultados sustentan la hipótesis de vulnerabilidad neuronal selectiva. Finalmente, se desarrolló un rastrillaje genético novedoso (utilizando un paradigma comportamental asociado al SNC) cuyos resultados preliminares sugieren que genes moduladores podrían participar en el proceso de neurotoxicidad de Aβ42.

Los cuadros de inflamación e infección del aparato reproductor masculino constituyen una de las principales causas de infertilidad. La orquitis autoinmune experimental (OAE) fue inducida por inmunización activa, en la rata, con antígenos espermáticos y adyuvantes y constituye un modelo útil para estudiar inflamación testicular y autoinmunidad específica de órgano. La OAE se caracteriza por la presencia de un infiltrado linfomonocitario intersticial y lesión de los túbulos seminíferos con células germinales que sufren apoptosis y descamación. Nos propusimos estudiar, en la OAE, las principales quemoquinas y moléculas de adhesión involucradas en la migración y extravasación de linfomonocitos. Mediante técnicas de ELISA se detectó, en las ratas con orquitis, respecto de controles, un aumento en la concentración testicular de MIP-1? durante el período de inmunización mientras que MCP-1 aumentó durante el desarrollo completo del cuadro incluyendo el período de lesión severa. Se observó un aumento en el número de linfomonocitos testiculares que expresan los receptores específicos de dichas quemoquinas, CCR2 y CCR5. Por citometría de flujo, se detectó una disminución en el número linfomonocitos CD44+ en sangre periférica, simultánea a un aumento de dichas células en el intersticio testicular. A nivel del endotelio testicular, aumentó el número de células PECAM-1+ que expresan VCAM-1. Los resultados sugieren que las quemoquinas y moléculas de adhesión estudiadas constituyen un componente del circuito de amplificación de la respuesta inmune, esencial para el reclutamiento linfomonocitario y la inducción de una orquitis autoinmune severa, en el contexto de una inflamación crónica.

Los receptores P2X7 son canales de calcio activados por ATP conformados por subunidades de dos pasos de membrana que se asocian como homotrímeros. Sus efectos son mediados por activación de la vía de las MAPK que incluye a BRaf y ERK 1/2. En el sistema nervioso central, regulan la liberación de neurotransmisores y citoquinas, y la activación glial frente a situaciones inflamatorias. Mediante distintos estudios genéticos se encontró que pacientes con trastornos depresivos poseen, con una incidencia significativa, una variante polimórfica del gen P2X7, que consiste en un cambio de un único nucleótido que produce la sustitución de Glutamina por Arginina en la posición 460 (Gln460Arg). El objetivo principal de esta tesis consiste en investigar la relación funcional entre esta variante polimórfica del receptor y la aparición de trastornos psiquiátricos. En particular, se estudiaron las cascadas de señalización activadas por el receptor P2X7, poniendo énfasis en el ingreso de calcio extracelular tras dicha activación, el rol de la cascada de las MAPK y los efectos funcionales y transcripcionales que derivan de dicha activación. Primeramente, se observó que en homocigosis la variante mutada de P2X7 tiene la misma funcionalidad que el receptor wild-type (WT). En cambio, cuando ambas subunidades fueron coexpresadas se produjo una marcada disminución en la entrada de calcio y en la activación de la MAPK ERK 1/2. Se demostró además que ambas subunidades interactúan físicamente en la membrana celular de células coexpresoras, asociándose para formar trímeros funcionales de P2X7 compuestos por subunidades WT y Gln460Arg. A su vez, nuestro grupo colaborador en el Max-Planck en Munich, Alemania, demostró que solamente los ratones knock-in que expresan ambas variantes del receptor P2X7 humano, y no aquellos que expresan una única variante, muestran alteraciones del comportamiento similares a aquellas que presentan pacientes con depresión. A continuación, se buscaron proteínas involucradas en la transducción de señales de P2X7 de interés en el marco de mecanismos inflamatorios o con un posible rol en depresión. Se detectó asociada a BRaf a la proteína Poli ADP-ribosa polimerasa 1 (PARP1), enzima clave en la respuesta celular a procesos inflamatorios. Se demostró que P2X7 activa a PARP1, aumentando los niveles totales de poli ADP-ribosilación. Estos resultados identifican a PARP1 como un modulador clave de la transducción de señales de P2X7, y describen por primera vez a P2X7 como activador de PARP1. Además se realizó un microarray de expresión génica con el fin de caracterizar las consecuencias de la coexpresión de ambas variantes a nivel transcripcional. Con estos datos se realizó un análisis bioinformático global de los perfiles de expresión génica, con el cual se hallaron alteradas distintas vías de señalización relacionadas con inflamación y depresión. También identificamos genes candidatos con expresión alterada que resultan de máximo interés en el mismo contexto: CHUK (o IKKα, quinasa del inhibidor de NFκB α) y RCAN1 (regulador de calcineurina 1). Esta expresión diferencial detectada en el microarray fue posteriormente confirmada en distintos modelos, validando y profundizando dichos hallazgos. En conclusión, mediante la caracterización de las vías de transducción de señales asociadas a la activación de las distintas variantes de P2X7, el análisis de su impacto transcripcional y su asociación con nuevas moléculas se describen por primera vez los mecanismos moleculares y celulares que podrían proveer una explicación a la asociación entre la presencia de la variante mutada de P2X7 y la aparición de trastornos psiquiátricos como la depresión.