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La contaminación en suelos por metales pesados, en particular por plomo, es una problemática ambiental de gran importancia; la movilidad y biodisponibilidad de dicho contaminante es fuertemente dependiente de los componentes bióticos y abióticos del suelo. Debido a la importancia toxicológica que la contaminación de Pb reviste en nuestro país, en esta tesis se propone analizar la interacción de este metal con los componentes del suelo y su posible remediación con plantas. Por lo tanto, los objetivos generales del presente trabajo son la determinación de la especiación del metal y su interacción con los componentes del suelo, y el estudio sobre la capacidad de acumulación del metal por parte de una planta de cultivo (Brassica napus, colza), analizando el efecto de dicha planta sobre la especiación del metal. En el estudio sobre la especiación química del metal en el suelo y su evolución temporal, se observó que el Pb se asocia rápidamente con las fracciones minerales, quedando una muy baja fracciónn en forma soluble e intercambiable al cabo de 60 días, que es en principio la fracciónn biodisponible. Luego, mediante el cultivo de Brassica napus en suelos con agregado de Pb reciente y otro con contaminación consolidada por Pb, se analizó la interacción e influencia de la rizosfera en la especiación del metal. El efecto resultó en una mayor concentración de Pb en la zona rizosférica del suelo con contaminación reciente, particularmente en la fracción mineral, y en la permanencia de fracciones intercambiables de Pb en la etapa de fructificación de la planta. En la madurez fisiológica de B. napus, no se detectó contenido de Pb en la fracción intercambiable. Brassica napus resultó ser una especie acumuladora de Pb en suelos con contaminación reciente. Se cuantificó su concentración en hojas, resultando mayor en hojas jóvenes y en granos. Se observaron efectos negativos en la ultraestructura celular (particularmente cloroplastos), y en el contenido de foto pigmentos, los cuales se cuantificaron exitosamente mediante metodos no invasivos. Aun así, no se observo un efecto negativo en su desarrollo fenológico. EN suelos con contaminación consolidada, no se detectó contenido del metal en los organos estudiados de B. napus. Se concluye entonces que la presencia de Pb recientemente incorporado al suelo resulta en la acumulación del metal por Brassica napus, mientras que si el metal ha permanecido en el suelo previamente sembrado, este no se encuentra disponible para la planta debido a que este evoluciona hacia formas químicas mas estables, no biodisponibles.

Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Tesis de Maestría