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La Pampa Húmeda es la principal región agrícola de Argentina y una de las más importantes de Sudamérica. Allí, el modelo de producción agrícola prevalente implica un uso intensivo de agroquímicos, cuyos residuos ponen en riesgo tanto la salud humana como el equilibrio de los ecosistemas. Considerando la extensión de la región, la necesidad de preservar la calidad de los suelos y evitando limitar la actividad económica, las técnicas de remediación de bajo costo y aplicación in situ resultan la mejor opción para eliminar los niveles residuales de glifosato. La rizorremediación, entendida como el uso de plantas y los microrganismos asociados a su raíz para remover los contaminantes del medio ambiente, surge entonces como la tecnología más promisoria. En este contexto, el objetivo general del presente trabajo de tesis es generar el conocimiento que permita desarrollar un sistema de rizorremediación capaz de mitigar el impacto asociado al uso de glifosato en suelos de la Pampa Húmeda Argentina bajo explotación agrícola intensiva. Para alcanzar dicho objetivo, se desarrollaron e implementaron metodologías para evaluar la tolerancia radicular y foliar a glifosato en especies vegetales con valor productivo. Posteriormente se realizó el aislamiento y caracterización fenotípica y genotípica de cepas bacterianas tolerantes y degradadoras de glifosato. Durante la caracterización, dos cepas fueron seleccionadas para profundizar su estudio, proceso que involucró la secuenciación de sus genomas completos. Por último, se realizaron ensayos de interacción planta-microorganismo y un ensayo de microcosmos en donde se expusieron diferentes sistemas de rizorremediación a una dosis agronómica de glifosato en suelo. Entre las especies vegetales evaluadas, L. corniculatus fue seleccionada como candidata por ser capaz de tolerar la exposición a 5,0 mg Kg-1 de glifosato por vía radicular y 700 g ha-1 por vía foliar. Se obtuvo un banco de cepas puras y se realizó la caracterización fisicoquímica de los suelos y el estudio de las comunidades microbianas presentes. Se observó que, al momento de explicar las diferencias entre comunidades microbianas, el efecto rizosférico prevalece sobre las características edáficas o aplicaciones crónicas con glifosato. Casi la totalidad de los microorganismos aislados pertenecen a la clase Alphaproteobacteria, y cumplieron los requerimientos de: tolerar la máxima concentración de glifosato reportada en suelos III agronómicos, utilizar glifosato como única fuente de fósforo, y poseer distintas capacidades de promoción de crecimiento vegetal, mostrando todas las cepas al menos tres resultados positivos. Se secuenció el genoma completo de Ochrobactrum sp. P6BS-III y Rhizobium sp. P44RR-XXIV, dos cepas que presentaron excelente performance en los ensayos previos, y cuyo genoma no había sido secuenciado previamente o estudiado en profundidad. Mediante comparación in silico genoma a genoma se obtuvo información complementaria respecto a la estructura del genoma de Rhizobium sp. P44RR-XXIV. A la vez, el genoma de Ochrobactrum sp. P6BS-III aportó una gran cantidad de genes al pool génico del género, muchos de ellos sin función conocida. Por último, se estudió la interacción planta-microorganismo entre cepas bacterianas degradadoras y L. corniculatus, mediante ensayos de inoculación en placas verticales, estudios de imágenes utilizando microscopía confocal y microscopía electrónica, y ensayos de microcosmos. En los ensayos en placas verticales las cepas estudiadas pudieron coexistir con la especie vegetal sin provocar ningún signo de daño en ésta, aunque no existieron diferencias significativas para los parámetros biométricos analizados. Las imágenes obtenidas a partir de microscopía evidenciaron los distintos patrones de colonización de Ochrobactrum sp. P6BS-III y Rhizobium sp. P44RR-XXIV en raíces de L. corniculatus. El ensayo de microcosmos develó que L. corniculatus inoculado con Ochrobactrum sp. P6BS-III podría atenuar casi completamente 5 mg Kg-1 de glifosato en suelo al cabo de 20 días, tiempo más que alentador para el sistema remediador propuesto.

El hexaclorociclohexano (HCH) es un compuesto organoclorado obtenido porsíntesis química que ha sido utilizado principalmente como plaguicida para protegercultivos agrícolas. El mismo fue utilizado en dos formulaciones, como grado técnico(mezcla de isómeros) y el isómero γ-HCH purificado también llamado lindano. Losisómeros del hexaclorociclohexano son contaminantes orgánicos peligrosos debido a supersistencia en el ambiente y a su elevada toxicidad. La aplicación no controlada y elmanejo inadecuado del HCH condujeron a la contaminación de suelos, biota y recursoshídricos. Se reportaron áreas altamente contaminadas con HCH en Japón, Canadá,Sudáfrica, India, Argentina, Alemania y Estados Unidos. La necesidad de remediarestos sitios contaminados condujo al desarrollo de nuevas tecnologías como labiorremediación, que presenta algunas ventajas frente a los métodos tradicionales.El phylum Actinobacteria se caracteriza por su versatilidad metabólica, en el queel género Streptomyces es reconocido por su gran potencial biotecnológico. Lascaracterísticas fisiológicas y genéticas de este género lo hacen apropiado para participaren los procesos de biorremediación, en comparación con otras bacterias. La cepaStreptomyces sp. M7 fue aislada de sedimentos altamente contaminados en la provinciade Tucumán (Argentina), posee la capacidad de remover lindano de medios líquidos ysuelo. Si bien se ha descripto una vía metabólica para la degradación del lindano en elgénero Sphingobium, no se conoce aún la vía de degradación de lindano porStreptomyces ni el análisis del contexto metabólico durante la degradación.En este trabajo, se determinó que Streptomyces sp. M7 posee la capacidad deutilizar los isómeros α- y β-HCH como fuente de carbono y de removerlos del medio decultivo. Además, es capaz de remover los isómeros α-, β- y γ-HCH en forma conjunta.Se determinó la liberación de iones cloruros al medio de cultivo como una medida de ladegradación de HCH. Asimismo, se identificaron intermediarios metabólicos durante ladegradación de los isómeros α- y β-HCH. Para dilucidar la vía de degradación del γ-HCH y comprender su contexto metabólico en Streptomyces sp. M7 se utilizaronmetodologías de avanzada, tales como proteómica cuantitativa libre de geles, RT-qPCRy diferentes análisis bioinformáticos. Se identificaron las enzimas pertenecientes a la víaalta de degradación del HCH. Las mismas fueron determinadas en mayor abundanciarelativa cuando se utilizó como fuente de carbono el γ-HCH. Asimismo, se demostróque la mineralización de lindano es factible debido a que fueron identificadas proteínaspertenecientes a una variante inusual de la vía baja de degradación. También, losresultados obtenidos permitieron descifrar el contexto metabólico en el cual tiene lugarla degradación del γ-HCH, demostrando que las etapas degradativas de esta vía estánsustentadas por un catabolismo activo que suministra energía y equivalentes dereducción en forma de NADPH.Los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis Doctoral contribuyerona dilucidar la vía metabólica por la cual Streptomyces sp. M7 es capaz de degradar elhexaclorociclohexano, aportando información sobre el metabolismo de compuestosclorados en actinobacterias y conocimientos para optimizar procesos degradativos enStreptomyces sp. M7.

Hipótesis: - La comunidad microbiana de un suelo limpio cambia debido a la contaminación con una mezcla compleja de hidrocarburos. - Dicho cambio esta relacionado con la carga inicial del contaminante. - La comunidad microbiana de sistemas contaminados se modifica durante un proceso de biorremediación. - La comunidad del suelo restablece sus condiciones originales al desaparecer el contaminante. Objetivo general: Estudiar los cambios producidos en la comunidad microbiana de un suelo limpio como consecuencia de la contaminación con un residuo petroquímico y durante el proceso de biorremediación. Evaluar la capacidad de biorestauración del suelo una vez finalizado el tratamiento. En forma particular, se plantearon los siguientes objetivos: a) Analizar la composición microbiológica del residuo petroquímico API, con el fin de determinar si los grupos microbianos predominantes intervienen en el proceso de biorremediación del residuo en suelo. b) Determinar la cinética de eliminación de los hidrocarburos durante el proceso de biorremediación, su influencia sobre la dinámica de las poblaciones microbianas cultivables y sobre la actividad de la comunidad microbiana completa, en suelo limpio y sistemas contaminados con distintas concentraciones del residuo petroquímico. c) Analizar los cambios en la estructura de las comunidades microbianas mediante técnicas convencionales de aislamiento e identificación de los grupos dominantes en puntos seleccionados durante el tratamiento, y mediante técnicas cultivo independiente. d) Evaluar el grado de restauración alcanzado comparando la estructura y función de las comunidades establecidas al finalizar el proceso de biorremediación con la comunidad del suelo limpio.

Fil:Ferreira, María Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2018

En la Patagonia argentina, la explotación de yacimientos hidrocarburíferos representa uno de los principales componentes de la matriz productiva regional. Entre las principales corrientes de desecho de esta actividad se encuentran los “recortes de perforación” o “drilling cuttings”, originados en las operaciones de perforación de pozos de gas y petróleo. Los recortes de perforación están compuestos por restos de fluidos utilizados en la operación, y los fragmentos de roca provenientes de las formaciones geológicas atravesadas durante la perforación. La gestión de este material residual complejo, que es generado en forma continua y en grandes cantidades, supone una problemática ambiental actual, tanto para las compañías operadoras de las áreas de explotación de gas y petróleo, como para las autoridades de aplicación ambiental. Los fluidos de perforación están compuestos por arcillas y una fase líquida (base), que puede ser acuosa u oleosa, a la cual se le agregan diferentes aditivos químicos según los requerimientos específicos del pozo a perforar. La formulación del fluido que se utilice en la perforación, en conjunto con el tipo de minerales e hidrocarburos presentes en la formación atravesada, determinarán el tipo (recortes base agua o base oleosa) y la toxicidad ambiental de los recortes de perforación resultantes. De manera genérica, se identifican cuatro características principales que representan la peligrosidad y/o toxicidad ambiental de este residuo: (i) elevado contenido de sales inorgánicas; (ii) alta concentración de hidrocarburos del petróleo en recortes base oleosa; (iii) contenido variable de metales pesados; y (iv) toxicidad potencial (poco explorada o desconocida) de otros aditivos utilizados en los fluidos de perforación (biocidas, dispersantes, desincrustantes, etc.). La principal diferencia entre los recortes de perforación de base acuosa y base oleosa, está dada por el elevado contenido de hidrocarburos de los segundos. Por consiguiente, esta característica requiere de distintos abordajes en las estrategias para su tratamiento y disposición final. De esta manera, el objetivo general del presente trabajo fue evaluar la viabilidad de diferentes estrategias de tratamiento y reutilización de recortes de perforación de pozos de gas y petróleo, mediante la aplicación de residuos y enmiendas orgánicas generados en los yacimientos hidrocarburíferos y zonas aledañas. Por un lado, se estudió el efecto de la aplicación de dos tipos de enmiendas orgánicas, disponibles en la región patagónica argentina (compost de residuos orgánicos urbanos (CROU) y compost de biosólidos (CB)), en las propiedades como sustrato de crecimiento vegetal de los recortes de perforación base agua, para su uso potencial como material de relleno para la revegetación y/o restauración de áreas degradadas. Por el otro, se evaluó la tratabilidad de los recortes de perforación base oleosa mediante la estrategia de biorremediación por compostaje, utilizando residuos orgánicos de cocina y jardín, generados en los yacimientos hidrocarburíferos. Considerando que los recortes de perforación base agua pueden asemejarse a un suelo salino-sódico de condiciones extremas, se realizó un ensayo de invernáculo para evaluar el crecimiento de una especie vegetal halotolerante (agropiro alargado o ii Thynopirum ponticum), en sustratos formulados con el recorte de perforación base agua y compost. El recorte de perforación fue sometido previamente a un pretratamiento de lavado para la reducción de sales, se formularon 6 tipos de sustratos utilizando dos proporciones en volumen (1:1 y 1:1,5 enmienda:recorte) de perlita, CB y CROU. La aplicación de ambos tipos de enmiendas orgánicas mejoró significativamente la fertilidad del recorte de perforación base agua. No obstante, el efecto diferencial en la aptitud como sustrato de crecimiento vegetal, entre los tratamientos con CB respecto de tratamientos con CROU, estuvo principalmente asociado a la mejora en las propiedades físicas del recorte de perforación. En el tratamiento con CB aplicado en mayor proporción se favoreció el lavado de sales, y en particular del catión sodio, probablemente debido a una mejora significativa en la estructura del recorte de perforación. Este efecto en las propiedades físicas del sustrato parece haber sido relevante, ya que rendimiento vegetal fue significativamente mayor en este tratamiento, respecto de los tratamientos con CROU y perlita. Para evaluar la viabilidad de la alternativa de biorremediación por compostaje de recortes de perforación base oleosa, se realizó un ensayo en reactores de 60 L aislados térmicamente donde se compostaron, durante 151 días, recortes base oleosa (RBO) y residuos orgánicos de cocina y jardín triturados (RO), utilizando chips de madera como agente estructurante en un 50 % en volumen. Se ejecutaron los siguientes tratamientos: solo recortes de perforación base oleosa (0 % RO), dos mezclas con dos proporciones de RBO y RO en volumen (33 y 75 % RO), y únicamente residuos orgánicos (100 % RO), como referencia del proceso de compostaje de los residuos utilizados. Durante el ensayo, se monitoreo la degradación de distintos tipos de hidrocarburos (totales, alcanos y poliaromáticos), además de variables del proceso, como temperatura, pH, conductividad eléctrica, y contenido de agua y nutrientes. La aplicación de residuos orgánicos en una proporción de 1:0,4 recorte:residuo (tratamiento 75 % RO) en peso seco, proveyó proporciones adecuadas de carbono y nitrógeno disponibles, microorganismos en cantidad y variedad, redujo la toxicidad inicial del residuo, y mejoró la disponibilidad de agua y oxígeno (dada la naturaleza arcillosa del recorte de perforación) resultando altamente eficaz en la remoción de todos los tipos de hidrocarburos, incluyendo poliaromáticos de elevado peso molecular, usualmente muy recalcitrantes. Por otro lado, la aplicación de una proporción de 1:0,1 (tratamiento 33 % RO) no fue más efectiva que no aplicar residuos orgánicos (tratamiento 0 % RO) en la biodegradación de hidrocarburos. Los resultados obtenidos alientan en considerar la viabilidad de estrategias que involucren la aplicación de estos residuos orgánicos, o de enmiendas producidas a partir de los mismos, como alternativa para el tratamiento, reuso o disposición de recortes de perforación base acuosa y base oleosa. Además, estas estrategias pueden contribuir en el reciclado y valorización de residuos orgánicos, y posibilitan el tratamiento simultáneo de más de una corriente de los desechos generados en los yacimientos o en localidades cercanas.