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En la presente tesis se estudió la relación entre el volumen celular y los flujos transmembranales de K+ en hepatocitos de goldfish (Carassius auratus) expuestos a condiciones anisosmóticas o a limitación energética. La respuesta de volumen fue luego comparada con aquella presentada por hepatocitos de trucha (Oncorhynchus mykiss) y de rata (Rattus rattus). El volumen celular fue estudiado utilizando video microscopía y microscopía de epifluorescencia, mientras que la medición de los flujos de K+ se estimó a partir de los flujos unidireccionales de 86Rb+. En hepatocitos de trucha y rata, la exposición a medio hiposmótico (180 mosM) a pH 7.45 produjo el aumento de volumen celular seguido por disminución regulatoria de volumen (RVD), respuesta que es mediada por el eflujo neto de KCl seguido de agua. Por el contrario, los hepatocitos de goldfish aumentaron su volumen pero no presentaron RVD en esas condiciones. En hepatocitos de goldfish, si bien la N-etilmaleimida pudo activar la salida de K+, esto no ocurriió cuando las celulas fueron expuestas a medio hiposmótico (120-180 mosM). Se desarrolló un modelo matemático con el fin de analizar las interacciones existentes entre el volumen celular, el potencial de membrana, y la masa de los principales solutos difusibles bajo condiciones anisosmóticas. Este modelo pudo ser utilizado para simular las respuestas volumétricas de los hepatocitos de las tres especies. Los resultados del modelo apoyan la idea de que la ausencia de RVD observada en hepatocitos de goldfish se debe a la ausencia de un elemento sensor de volumen. La comparación entre los resultados obtenidos con el modelo matemático y los resultados experimentales sugiere que los hepatocitos de goldfish poseen una capacidad restringida para desarrollar RVD. El bloqueo de metabolismo energético puede generar gradientes osmoticos por aumento de la osmolaridad intracelular. En el presente estudio, la inhibición de la glucólisis por ácido iodoacético (IAA)no alteró el volumen celular en hepatocitos de goldfish, mientras que en presencia de cianuro (CN), inhibidor de la fosforilación oxidativa, o de CN y IAA (IAA+CN), el volumen celular disminuyó un 3—7%.A pesar de que en los hepatocitos de goldfish la limitación energética no tuvo efecto sobre el eflujo de K+, el influjo disminuyó un 57-66% en presencia de CN y CN+IAA pero no se vio alterada por el IAA sólo. La pérdida de K+ intracelular luego de 20 min de exposición a CN o IAA+CN fue solo de un 4% del K+ intracelular total. En general, los resultados de este estudio sugieren que los hepatocitos de goldfish, a diferencia de las células de especies sensibles a la anoxia, evitan el desacople de los flujos transmembranales de K+ en respuesta a un gradiente osmótico o limitación energética. Esto podría explicar por un lado la incapacidad de estas células para presentar RVD, pero al mismo tiempo la extraordinaria capacidad para mantener las concentraciones intracelulares de K+, prolongando de esta manera la viabilidad celular.

En esta tesis se aborda el estudio de los parámetros que regulan las reacciones de transferencia electrónica (TE) en metaloproteínas que contienen dos tipos de sitios de cobre distintos. Para ello se utilizó una variedad de métodos espectroscópicos y electroquímicos, cuyos resultados fueron analizados en el marco de la teoría de Marcus de TE. El principal modelo de estudio es un fragmento soluble de la citocromo ba3 oxidasa de Thermus thermophilus (Tt-CuA), que contiene el centro binuclear de CuA, aceptor de electrones primario de la enzima. Mediante distintas estrategias de mutagénesis tales como mutaciones puntuales de primera esfera de coordinación o ingeniería de bucles, se investigaron los factores que determinan las propiedades electrónicas del sitio nativo, y que en última instancia determinan los mecanismos regulatorios de la TE. Desde la óptica de la termodinámica estadística, se logró racionalizar las contribuciones entálpica y entrópica al potencial de reducción del sitio de CuA y se verificó la aditividad de los efectos producidos por las distintas mutaciones de primera y segunda esfera de coordinación. Diferentes estudios espectroscópicos (RR, RMN, UV-Vis, EPR) revelan que la estructura electrónica del sitio de CuA puede ser descripta mediante una superficie de energía potencial con dos pozos que corresponden a estados fundamentales alternativos. Más aún, la población relativa de estos estados puede ser modulada a través de mutaciones de primera y segunda esfera, y en una mutante específica mediante el pH del medio. Empleando voltametría cíclica de films proteicos fue posible determinar los parámetros cinéticos de TE para ambos estados fundamentales de manera independiente. En particular, la mutante puntual de ligando axial M160H constituye el primer caso conocido en que resulta posible activar selectivamente dos estados fundamentales diferentes mediante un simple cambio de pH. Por otra parte, estudios realizados sobre sitios de cobre tipo 1 (T1) reconstruidos en el esqueleto proteico de Tt-CuA mediante ingeniería de bucles muestran claras diferencias en relación a los sitios T1 nativos. Grandes cambios espectroscópicos o notables desplazamientos de los potenciales redox demuestran el rol determinante de la matriz proteica sobre las propiedades estructurales y funcionales de los sitios redox. Estos sistemas novedosos presentan además la capacidad de modificar la coordinación del sitio activo a partir del agregado de un ligando exógeno sin perder su actividad redox, permitiendo el estudio de este tipo de fenómenos en un sistema biológico.

Desde el inicio de un cultivo celular, las células que lo conforman atraviesan una serie de presiones de selección donde sobrevivirán aquéllas que logren adaptarse a las condiciones desde el sistema in vivo al sistema in vitro. La mayoría de los cultivos celulares de vertebrados no progresan más allá de un número finito de divisiones y entran en senescencia replicativa. En muchas ocasiones, ya sea por inducción o espontáneamente, algunos cultivos celulares pueden adquirir una serie de características proliferativas anormales (independencia de anclaje, pérdida de inhibición de contacto, disminución de la limitación de la densidad de crecimiento, entre otras) proceso denominado transformación celular el cual a menudo se puede correlacionar con la tumorigenicidad. El objetivo general del presente plan de investigación es enunciar nuevos conocimientos en el campo de la Biología Celular y Molecular vinculados con la transformación celular in vitro acontecida en cultivos celulares provenientes de células fetales de conejo (Oryctolagus cuniculus). El cultivo inicial se originó a partir de células obtenidas de piel de la especie en cuestión mediante disgregación enzimática. La línea celular originada a partir de este cultivo se denominó JPCS1. Todos los estudios presentados en esta Tesis se realizaron cada cinco SCs (subcultivos), entre el SC 5 al SC 25 y cada diez SCs desde el SC 30 al SC 50. Para evidenciar la inestabilidad genética los estudios se realizaron tanto a nivel citogenético como molecular. A nivel citogenético se analizaron los cambios en la frecuencia del número cromosómico como así también la evolución del cariotipo de la línea celular durante su mantenimiento entre el SC 5 al 50. A nivel molecular, se utilizó como marcador de inestabilidad genética un conjunto de loci de microsatélites. Las características del control de crecimiento de la línea JPCS1 fueron evaluadas mediante el análisis de las curvas de crecimiento. En las mismas se obtuvo tanto el tiempo de duplicación poblacional media como la densidad limitante de proliferación celular. Asimismo, se realizó el estudio de curvas de crecimiento con independencia de suero donde se obtuvo la pendiente de la curva de crecimiento y la capacidad de proliferación celular en ausencia de suero. Asimismo, también fue analizado el crecimiento independiente de anclaje. Por último, la capacidad de migración celular fue investigada mediante la técnica de la herida. Los resultados de nuestras investigaciones llevados a cabo para dar cumplimiento con los objetivos de la presente Tesis Doctoral demuestran que la misma presenta inestabilidad cromosómica a partir del SC 10, previo a los cambios en los parámetros de crecimiento y migración celular, evidenciando una tendencia al aumento del número cromosómico (hiperdiploidización) cambiando el número modal desde 44 a 46 cromosomas. A partir de ganancias cromosómicas, en primera instancia por una trisomía en el cromosoma 18 a partir del SC 10 y en segunda instancia por trisomía en el cromosoma 6 a partir del SC 20 y posteriormente por tetrasomía del mismo cromosoma en el SC 40. Asimismo, la línea celular muestra un incremento en la frecuencia de la deleción de 10p -del(10)(p13)- a partir del SC 30. A nivel molecular, los resultados obtenidos demuestran que la línea JPCS1 exhibe estabilidad genética del panel de microsatélites utilizados, sin encontrarse nuevos alelos para estos marcadores ni desbalance de las variantes alélicas en los loci heterocigotas. En cuanto a los parámetros de crecimiento celular evaluados, la línea celular en cuestión presenta un acortamiento del ciclo celular demostrando un cambio abrupto entre los SCs 30 y 40, determinado por la disminución del tiempo de duplicación poblacional. Asimismo, se pudo evidenciar la existencia de una tendencia al aumento progresivo de la densidad limitante de la proliferación celular a medida que se incrementa el tiempo de cultivo, exhibiendo una disminución de la inhibición por contacto. Por otra parte, en las etapas más avanzadas del mantenimiento esta línea JPCS1 se caracteriza por exhibir crecimiento con independencia de las necesidades de factores de crecimiento, ya sea por producción autócrina o por presentar algún mecanismo de señalización intracelular alterado. La línea celular JPCS1 no demostró crecimiento con independencia de anclaje en ninguno de los SCs analizados. Por último la misma exhibió un aumento de la capacidad migratoria de las células a partir del SC 25, tendencia que se acentúa en el SC 40 demostrando una disminución de la inhibición por contacto en concordancia con los ensayos de proliferación celular. A partir de los resultados obtenidos en las investigaciones llevadas a cabo durante el desarrollo del presente trabajo de Tesis Doctoral se ha puesto en evidencia, mediante los diferentes estudios realizados que la línea celular JPCS1 originada a partir de células de embriones de Oryctolagus cuniculus luego de su mantenimiento en el sistema in vitro que el cultivo celular se encuentra transformado en el SC 40 proceso que no ha terminado, y que la inestabilidad genética a nivel cromosómico es un evento inicial del proceso de transformación.

El género Lasaea (Bivalvia, Lasaeidae), presenta una distribución cosmopolita y, a pesar de haber sido ampliamente estudiado en otras partes del mundo, cuenta con muy escasa información sobre su biología en las costas de América del Sur. El objetivo general de este trabajo es comprender el modo reproductivo de Lasaea en la costa de Patagonia argentina a partir de la morfología y anatomía de los ejemplares, en especial los aspectos relacionados con la modalidad vivípara; conocer el ciclo reproductivo en las localidades consideradas, su fecundidad y desarrollo larval. Asimismo, se propuso analizar el complemento cromosómico a fin de determinar variaciones en el nivel de ploidía y su posible relación con el mecanismo reproductivo de los ejemplares patagónicos. Se analizó inicialmente las generalidades morfológicas y estructura de la charnela en individuos recolectados en Caleta Córdova Norte (CCN) y Km 3, ambas localidades cercanas a la ciudad de Comodoro Rivadavia, en el centro del Golfo San Jorge, a partir de imágenes tomadas con microscopio estereoscópico y microscopio electrónico de barrido (scanning); se compararon así con individuos de Lasaea de distintas localidades patagónicas, desde el Golfo San Matías hasta el Estrecho de Magallanes y Canal de Beagle, encontrando sólo diferencias en la coloración y forma general del borde. Los resultados obtenidos se contrastaron con las descripciones originales realizadas por distintos autores para diversas especies de Lasaea, muchas de ellas citadas inicialmente bajo otras denominaciones. Los ejemplares de Lasaea analizados, corresponden a un eulamelibranquio con adaptaciones anatómicas acordes a las necesidades de incubación y consistentes con la estructura de un bivalvo del orden Veneroida con una historia de vida similar. La gónada en estos ejemplares, desarrolla como un ovotestis con una fracción masculina reducida (30 %) respecto del total; como carácter sobresaliente, se menciona la presencia de espermatozoides biflagelados móviles; característica nueva dentro del género Lasaea. A partir de la interpretación del tamaño del ovotestis maduro, se pudo distinguir un ciclo gonadal estacional con un periodo de desove y recuperación importante en los meses de verano seguido de un desove menor a comienzos del invierno. La observación de cortes histológicos, permitió ver una proliferación de ovocitos con vitelogénesis inicial durante todo el año, con máximos durante los meses de otoño-invierno. Los ovocitos con vitelogénesis avanzada presentan frecuencias máximas hacia fin de primavera y comienzo del verano, seguida por un periodo de mayor producción de nuevos ovocitos, coincidente con una emisión posterior de la gónada y su recuperación. La espermatogénesis también fue registrada durante todo el año; la frecuencia de individuos con más del 75 % del testículo ocupado por espermatozoides disminuye durante los meses de verano y en el invierno. La mayor frecuencia de espermatozoides fue coincidente con el ovario maduro con ovocitos en vitelogénesis avanzada, indicando una sincronía en la emisión de gametos femeninos y masculinos hacia la cámara suprabranquial. Al analizar el desarrollo gonadal de Lasaea en la costa patagónica, si bien no se aprecia un patrón definido respecto de la temperatura, se observa el máximo desarrollo gonadal hacia fines de invierno – comienzo de primavera, luego de la recupareción pos desove dada cuando la temperatura del agua disminuye. Los ejemplares patagónicos incuban sus embriones en la cámara suprabranquial hasta liberarlos como juveniles; en los dos sitios considerados (CCN y Km 3), se observaron animales incubando durante todo el año, con valores máximos durante los meses correspondientes a fin de primavera – verano. Las tallas de primera incubación variaron entre estas localidades consideradas, siendo 1,72 mm en CCN y 2,1 mm en Km 3. La proporción de animales incubando estadios embrionarios iniciales indica una relación significativa positiva con la cantidad de horas de luz, negativa con la temperatura del agua de mar. Por su parte, en los estadios finales, además del efecto significativo de la cantidad de horas de luz, se pudo observar una relación significativa positiva de la talla. Los ejemplares analizados de Lasaea en la costa del Golfo San Jorge, presentan una relación alométrica negativa entre número de embriones por animal y la talla en CCN (14,12 ± 4,84 embriones por animal) e isométrica en Km 3 (13,78 ± 5,70). Se observaron diferencias significativas entre localidades respecto del número de embriones en distinto estadio, pero no entre los estadios iniciales y finales de una misma localidad. Estos resultados indican una fecundidad distinta en cada localidad, sin una pérdida por mortalidad entre los embriones y juveniles próximos a ser liberados. A excepción de unos pocos casos, los embriones de una misma cohorte dentro de las branquias de un animal se encuentran en un mismo estadio de desarrollo; tanto para CCN como para Km 3, se pudo apreciar un intervalo entre los máximos de embriones iniciales y finales de aproximadamente dos a tres meses, dando idea que éste sería el tiempo de desarrollo desde un estadio de huevo o embrión incipiente hasta obtener un juvenil próximo a liberarse. Finalmente se analizó el complemento cromosómico en cuatro localidades patagónicas, sin que se encuentren diferencias significativas. A partir del apareamiento de homólogos, fue posible distinguir un cariotipo 2n = 48+6 conformado por tres pares de cromosomas metacéntricos, cinco pares submetacéntricos, diez pares subtelocéntricos, seis pares telocéntricos y seis cromosomas sin aparear (cromosomas B). Una técnica complementaria que permite visualizar las regiones de organizadores nucleolares (NORs) ha sido aplicada como indicadora del nivel de ploidía de las especies en estudio. Los resultados obtenidos mostraron un valor de mediana = 2 ± 1 NORs por célula, lo que indicaría que cada individuo tiene la cantidad de regiones de organizadores ribosomales acordes a un individuo diploide. Las características analizadas de los ejemplares patagónicos analizados permiten identificarlos como Lasaea miliaris, especie descrita originalmente por Philippi (1845) para el Estrecho de Magallanes. Los resultados obtenidos en este trabajo a partir del análisis de gametos, ciclo gonadal y complemento cromosómico, permiten asumir que Lasaea miliaris (Philippi, 1845) es una especie hermafrodita simultánea, con un mecanismo reproductivo de autofertilización.

El presente trabajo de tesis realizado en un modelo celular de taquicardia crónica inducido por marcapaseo rápido (MR) tuvo como finalidad la comprobación de la hipótesis de que la taquicardia crónica a través del aumento sostenido del calcio (Ca2+) intracelular y la producción de las especies reactivas de oxígeno (ROS) promuevan la activación de dos quinasas proapoptóticas, la proteína quinasa II dependiente de Ca2+-calmodulina (CaMKII) y la proteína perteneciente a la familia de las quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), p38MAPK, que conducen a la activación de la cascada apoptótica. Utilizando corazones enteros y cardiomiocitos de rata y ratón estimulados a baja (0,5Hz) y alta (5 y 8Hz) frecuencia en presencia y ausencia de diferentes compuestos farmacológicos, inhibidores específicos de las quinasas, demostramos que la muerte celular inducida por MR se asocia con el aumento de la activación de las quinasas, CaMKII y p38MAPK, sin embargo, solo la inhibición de CaMKII previno la muerte celular inducida por MR, concluyendo que p38MAPK no está involucrada en la muerte celular inducida por MR. Midiendo Ca2+ y ROS mostramos además que el Ca2+, y no así las ROS, es necesario para la activación de CaMKII durante el MR. Por otra parte, utilizando estabilizadores del receptor de rianodina (RyR2) e inhibidores de la retoma de Ca2+ mitocondrial y de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) demostramos que la activación de CaMKII inducida por MR conduce a un aumento en la probabilidad de apertura de los RyR2 que resulta en la pérdida de Ca2+ por el retículo sarcoplasmático (RS) y la sobrecarga de Ca2+ mitocondrial con la consecuente apertura del mPTP y la liberación de factores que inician la cascada apoptótica. Otro hallazgo importante y hasta ahora sin precedentes de este trabajo de tesis es que la activación de CaMKII durante el MR activa a la NADPH oxidasa resultando en un aumento en la producción de ROS intracelular. Estos ROS oxidarían a los RyR2 aumentando así su probabilidad de apertura. Finalmente, demostramos que la activación de la vía PI3K/AKT juega un papel protector al reducir la muerte celular inducida por MR. Los resultados obtenidos no solo aportan evidencias del rol crítico de la CaMKII en la muerte celular inducida por MR sino que además indican que su blanco de acción sería el RyR2. Se propone que la estabilización de los RyR2 podría resultar en una novedosa estrategia terapéutica para el tratamiento del remodelado adverso asociado con la taquicardia crónica.

La formación placentaria normal influencia el desarrollo embrionario a término. Alteraciones en factores que regulan la interacción materno-fetal temprana, tales como la disrupción de los niveles de óxido nítrico (NO), las metaloproteasas (MMPs) y desbalances en el estado oxidativo, son causa de placentopatía y anomalías embrionarias tempranas. Con la hipótesis que la exposición materna a alcohol desde antes de la preñez (17 días previos a la preñez) y hasta la organogénesis (día 10 de gestación (D10) genera cambios en la expresión y actividad de MMPs y de moléculas de la matriz extracelular, afecta la regulación del sistema nitridérgico, incrementa las especies reactivas del oxígeno en la interfase trofoblásticodecidual y en el embrión, y conduce a anomalías de la placentación temprana y disrupción del desarrollo embrionario durante la organogénesis, se plantearon los siguientes objetivos, luego de la administración perigestacional de 10% de alcohol a hembras murinas: 1) determinar los efectos materno en variables biométricas y reproductivas; 2) en el embrión: a) analizar la morfogénesis embrionaria, la calidad histológica y la adhesión celular, b) evaluar la expresión de moléculas de la MEC y MMPs, c) evaluar la expresión y actividad de las óxido nítrico sintasas (NOS), d) analizar los cambios en el sistema oxidativo y sus consecuencias en macromoléculas embrionarias. 3) En el tejido trofoblástico-decidual (T-D): a) analizar cambios histológicos y nucleares; b) evaluar la expresión de colágenos, proteoglicanos, ácido hialurónico y MMPs; c) analizar las alteraciones en el sistema nitridérgico; d) determinar el estado oxidativo y efectos lipídicos, proteicos y nucleares. La ingesta perigestacional de alcohol induce, al D10, pérdida de los sitios de implantación, aumento de las reabsorciones, retraso del desarrollo embrionario, disminución del crecimiento y anomalías morfológicas e histológicas embrionarias por disrupción de la expresión de cadherinas y de MMPs, colágenos y proteoglicanos, efectos posiblemente relacionados con alteraciones del sistema nitridérgico, aumento de estrés oxidativo y efectos nitrosativos y apoptóticos. El tejido trofoblástico y decidual de las hembras tratadas presentó cambios en la morfología nuclear, alteraciones del lecho vascular, disminución de los colágenos fibrilares en la MEC y alteraciones en la expresión y actividad de MMP-2. El sistema nitridérgico también fue afectado por la exposición a alcohol, evidenciado por alta concentración de nitritos, aumento de estrés oxidativo y lipoperoxidación. En conclusión, el daño histomorfológico embrio-placentario temprano por exposición perigestacional a alcohol, vinculado a alteraciones en las moléculas de la MEC, podrían ser producto, al menos en parte, de desbalances en la producción de agentes moduladores como las especies reactivas de oxígeno y el óxido nítrico en la interfase materno-embrionaria temprana.

Objetivo de la tesis: - Estudiar la reactividad química en medio acuoso de los insecticidas cloronicotinoides con radicales inorgánicos y estados excitados, denominados en conjunto especies reactivas de importancia ambiental, para evaluar la capacidad de los métodos abióticos en detoxificar las aguas contaminadas con estos insecticidas. Para alcanzar este objetivo se plantearon los siguientes objetivos específicos, para cada una de las especies reactivas estudiadas: - Investigar la naturaleza de los intermediarios de corta vida generados durante el ataque de las especies reactivas a los insecticidas a fin de establecer los sitios de mayor reactividad de las moléculas. - Identificar los productos de degradación primaria de los insecticidas. - Postular los mecanismos de reacción involucrados. - Evaluar la toxicidad de los insecticidas y de las mezclas de insecticidas con sus productos de degradación.

Las células pueden detectar, generar y responder a un amplio rango de señales externas, químicas y físicas, integrar y analizar esta información y, en consecuencia, cambiar su morfología, dinámica, comportamiento y, eventualmente, destino. A nivel celular, las respuestas biológicas a fuerzas externas se originan en dos tipos de estructuras especializadas: adhesiones focales (célula-matriz extracelular) y uniones adherentes (célula-célula). Las adhesiones focales son complejos de proteínas dispuestos en ensamblados multi-moleculares que unen la matriz extracelular, a través de receptores integrales de membrana, a componentes del citoesqueleto. Estos sitios de adhesión son estructuras planas, alargadas de unos pocos micrones cuadrados que a menudo están localizadas en la periferia de las células, y que además funcionarían como organelas de señalización en el proceso de mecanotransducción celular. Uno de los retos que se presenta para estudiar el sistema es el de poder integrar y combinar distintas técnicas que nos permitan analizar la dinámica intracelular, la biomecánica de la célula/sustrato, detección de las fuerzas generadas en/por la célula, y observar la respuesta global de la célula en las distintas condiciones. Entonces, el estudio de la estructura, mecánica y dinámica de las proteínas de adhesiones focales en respuesta a un estímulo mecánico en células vivas requiere de técnicas que permitan visualizar y caracterizar en forma integrada la dinámica de eventos localizados en la célula. Estos métodos deben contar con una resolución espacio-temporal alta, de forma tal que permitan detectar eventos transientes y altamente localizados. En este contexto, se han implementado, en este trabajo de Tesis, distintas microscopías y espectroscopías de alta resolución espacial y temporal, en combinación con técnicas de biología molecular y celular. Con el objetivo de caracterizar las propiedades mecánicas de sustratos y células, en una primera etapa se implementó un modo de operación avanzado en microscopía de fuerza atómica (AFM), denominado PF-QNM (del inglés, Peak Force Quantitative Nanomechanical Property Mapping). Este modo permite obtener simultáneamente la imagen de topografía, junto con los mapas cuantitativos sobre las propiedades de elasticidad, adhesión, dureza, disipación de energía y deformación superficial. Se utilizaron sistemas modelo con distintas propiedades mecánicas de manera tal de cubrir el amplio rango que va desde GPa a kPa, y estudiar las propiedades de sustratos (vidrio, membranas de silicona y geles de poliacrilamina), así también como la línea celular utilizada en la Tesis. A nivel de adhesión focal, la estrategia fue transfectar células de epitelio mamario de ratón (HC11), con proteínas componentes de la adhesión (por ejemplo, zixina, FAK, vinculina, paxilina) fusionadas a proteínas fluorescentes visibles. De esta forma, empleando microscopías y espectroscopías de fluorescencia, es posible visualizar la expresión de las proteínas, registrar su localización y evolución en el tiempo y, mediante diferentes análisis, extraer información cuantitativa de dinámica, cinética y organización de los complejos de adhesión focal. El análisis de la dinámica y difusión de los complejos de adhesión focal y sus interacciones, fueron realizados mediante la espectroscopía por correlación de fluorescencia (FCS). Se caracterizaron los coeficientes efectivos de difusión de las proteínas mencionadas. El análisis de la correlación cruzada de las fluctuaciones de fluorescencia de pares de proteínas de adhesión focal (FCCS) permitió evidenciar la interacción entre distintas proteínas adhesivas de la adhesión focal. La cinética de disociación de proteínas desde la adhesión focal fue evaluada mediante la recuperación de la fluorescencia luego del fotoblanqueo (FRAP) en diferentes condiciones. Para estudiar los cambios generados en la organización y dinámica de adhesiones focales en células vivas en respuesta a un estímulo mecánico externo global, se empleó un dispositivo de tracción equibiaxial adaptado para ser usado en simultáneo con el microscopio confocal FV1000. La tensión mecánica aplicada por el dispositivo de tracción es capaz de inducir cambios en el área de las células vivas al igual que en las adhesiones focales. En respuesta al estiramiento mecánico se observó un mayor reclutamiento y translocación de la proteína zixina acompañado de una disminución significativa de su constante de disociación. Con el fin de correlacionar las propiedades mecánicas del sustrato y la fuerza de tracción generada por la célula a nivel de las adhesiones focales, sin perder de vista la organización y dinámica de las proteínas en la adhesión focal, se implementó la Microscopía de Fuerzas de Tracción (TFM). Esta técnica posee la sensibilidad necesaria para medir la fuerza de tracción generada por la célula sobre un sustrato elástico y transparente, la cual se puede combinar con otras técnicas de microscopía de fluorescencia como FRAP o FCS. El análisis de los datos TFM para la proteína zixina permitió obtener los mapas de deformación y de fuerzas de tracción, a la vez que se evaluó la cinética de disociación mediante FRAP.