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El trasplante es el tratamiento de elección en muchos pacientes con órganos o tejidos lesionados por distintas causas de manera irreversible, en un gran número de ellos significa una oportunidad de vida y en otros una mejora significativa de la calidad de la misma. La primer barrera con la que se encuentra un trasplante es la de superar aquellas reacciones por parte del sistema inmune. El Complejo Mayor de Histcompatibilidad (CMH) constituye un grupo de antígenos de la superficie celular que definen la naturaleza propia o alogénica de las células, tejidos u órganos trasplantados, y generalmente son los responsables de generar respuesta inmune en un trasplante. Estos antígenos se expresan mayoritariamente en linfocitos. Este sistema está codificado por una serie de genes localizados en el brazo corto del cromosoma 6. Estos genes son heredados en forma mendeliana codominante en un bloque o haplotipo desde cada uno de los cromosomas del padre y de la madre, constituyendo ambos haplotipos el perfil HLA de cada individuo. Los cromosomas de los padres también pueden transmitir a sus hijos otros determinantes antigénicos menores que aún no han sido completamente identificados, y al igual que los anteriores pueden estimular y generar una respuesta inmune. En el caso de individuos no relacionados genéticamente como en el caso de trasplante con donante cadavérico no es posible identificar haplotipos y se habla de match de determinantes individuales. En trasplante clínico los más estudiados e importantes del CMH son los antígenos A, B, y DR, pudiendo existir una compatibilidad perfecta de seis match (rara vez), diferentes grados de compatibilidad o nula compatibilidad en el caso de cero macth. De acuerdo al tipo de trasplante son los requerimientos de compatibilidad con los que debe cumplir. El laboratorio de histocompatibilidad es el encargado de realizar los exámenes entre receptor y donante con la finalidad de determinar el grado de compatibilidad entre ellos, algunas de las pruebas a realizar son la tipificación HLA, pruebas cruzadas (crossmatch) linfocitarias, detección y monitoreo de anticuerpos anti HLA (PRA) como también la construcción y actualización de la seroteca del laboratorio de histocompatibilidad.

La resistencia bacteriana a los antibióticos -lactámicos constituye uno de los problemas clínicos más preocupantes en la actualidad y ha sido reconocida por la comunidad científica la urgente necesidad de llevar a cabo programas para la identificación de nuevos compuestos antibacterianos que puedan paliar esta situación. Uno de los mecanismos de resistencia más importantes constituye la expresión de enzimas capaces de inactivar a los -lactámicos denominadas -lactamasas. Las enzimas serín--lactamasas (SBLs), las cuales presentan una Ser esencial en el sitio activo, fueron las primeras enzimas identificadas capaces de inactivar a estos antibióticos. Las -lactamasas dependientes de Zn(II), denominadas metalo--lactamasas (MBLs), fueron identificadas inicialmente en cepas inocuas. Sin embargo, a partir de finales de la década de 1980, nuevas y más eficientes MBLs fueron identificadas en diversas cepas de Enterobacterias y patógenos oportunistas, lo cual promovió el estudio e identificación de los rasgos moleculares y biofísicos que participan durante el mecanismo catalítico y evolución en estas enzimas. El estudio del mecanismo catalítico en las enzimas SBLs permitió el diseño de inhibidores basados en el mecanismo. Hoy en día estos inhibidores se administran junto con los -lactámicos para el tratamiento de infecciones. Sin embargo, debido a que el mecanismo catalítico en las MBLs es fundamentalmente distinto, no ha sido posible identificar inhibidores en base al mecanismo y no hay inhibidores de uso clínico disponibles. Durante el presente trabajo de Tesis se diseñaron y sintetizaron 4 bistiazolidinas que presentan dos anillos de tiazolidina fusionados por un átomo de nitrógeno, un grupo carboxilato similar al carboxilato presente en las posiciones 3 de penicilinas y carbapenemes y en posición 4 de cefalosporinas junto con un grupo tiol que provee un motivo de unión a metal. Estos compuestos constituyen 2 pares de enantiómeros que difieren en la presencia de un grupo gemdimetilo similar al encontrado en las penicilinas. Los mismos fueron ensayados como inhibidores de MBLs de distintas subclases: NDM-1, IMP-1 y BcII (B1), Sfh-I (B2), L1 y GOB-18 (B3). Por otro lado, las MBLs constituyen un sistema modelo ideal para el estudio de la evolución de proteínas, ya que es posible desarrollar un sistema que permita la evolución dirigida de estas enzimas en el laboratorio. Previamente, se había obtenido por estas técnicas una variante evolucionada de BcII que confería mayor resistencia a la bacteria hospedadora contra un antibiótico pobremente hidrolizado por la enzima silvestre. En este trabajo de Tesis exploramos la hipótesis acerca de si la dinámica conformacional en proteínas puede constituir un rasgo evolutivo susceptible de ser optimizado para conferir una mayor capacidad de adaptación a un nuevo desafío funcional. Como conclusiones generales podemos mencionar: 1) Las bistiazolidinas ideadas y sintetizadas para ser ensayadas como inhibidores de MBLs, fueron capaces de inhibir la actividad carbapenemasa de NDM-1, una enzima que se ha diseminado muy rápidamente entre diferentes cepas patógenas en todo el mundo. 2) Asimismo, estos compuestos demostraron ser capaces incluso de inhibir la actividad de enzimas de subclase B1, B2 y B3. Estos resultados indican que las bistiazolidinas son capaces de unirse eficientemente y ejercer un efecto inhibitorio en enzimas con diferentes topologías en los sitios activos. 3) Con excepción del caso de los derivados de la serie L- con Sfh-I, no se observó una clara diferencia en la potencia inhibitoria debida a la estereoquímica de los compuestos ni en la presencia o ausencia del grupo gemdimetilo. Para el caso de Sfh-I se observó una clara preferencia por los derivados de la serie L-, los cuales mostraron una disminución de dos órdenes de magnitud en cuanto a los valores de Ki. 4) Mediante experimentos de RMN demostramos que estos compuestos son capaces de penetrar al interior de la bacteria atravesando la membrana externa de E. coli e inhibir a la enzima in situ. Asimismo, los experimentos de muerte celular llevados a cabo en bacterias que expresan MBLs dan cuenta de la capacidad de estas bistiazolidinas de restaurar la susceptibilidad hacia los -lactámicos. 5) A partir de las estructuras cristalográficas podemos observar que las bistiazolidinas presentan la capacidad de unirse a los sitios activos de las MBLs en diferentes conformaciones. En general, salvo para el caso de L-CS319 con Sfh-I, las bistiazolidinas se unen al sitio activo mediante coordinación del grupo tiol entre ambos iones Zn(II) a distancias similares para Zn1 y Zn2, desplazando a la molécula de agua/hidróxido a puente. El carboxilato de estos compuestos queda interactuando con residuos estructuralmente equivalentes en enzimas de subclase B1 y B3 (Lys224 y Ser223, respectivamente). Para el caso de los derivados de la serie D-, la unión de los compuestos es ligeramente diferente, presentando una interacción entre el N de fusión de anillos con el Zn2, similar a lo observado en las estructuras cristalográficas de aductos enzima:-lactámico. 6) En el caso de L-CS319 unido a Sfh-I se observó que este compuesto se une por medio del carboxilato al sitio metálico, mientras que el grupo tiol se posiciona dentro de la región hidrofóbica 3. Esto contrasta con la estructura reportada entre la enzima B2 CphA y D-captopril, en donde si bien en este caso también el compuesto se une por medio del carboxilato al metal, el tiol queda en una posición más expuesta sobre la superficie del sitio activo. Es posible que la diferencia de potencia inhibitoria de los derivados de la serie L- se deba a que solo estos compuestos presentarían la capacidad de unirse de esta forma a Sfh-I. Dado que las enzimas de subclase B2 son carbapenemasas exclusivas, la topología de los sitios activos de estas enzimas serían capaces de ejercer una mayor restricción en cuanto a qué compuestos pueden ingresar y unirse en los mismos. 7) Por último estudiamos cómo es modulada la flexibilidad conformacional en las MBLs durante la evolución. El estudio por RMN de las variantes BcII wt, BcII G262, BcII N70S y BcII G262/N70S nos permitió establecer que (1) el análisis de las señales en los espectros 1H-15N HSQC indican perturbaciones precisas en la estructura y dinámica proteica que dan cuenta del efecto de las mutaciones en la afinidad por Zn(II); (2) el impacto de las mutaciones en la dinámica depende fuertemente del contexto genético, es decir, es epistático; y (3) la vía exitosa acumula mutaciones sucesivamente incrementando la dinámica de los bucles del sitio activo principalmente en la escala de micro a milisegundos, dando origen a un perfil de sustrato más amplio. Estos resultados nos permiten sugerir que la dinámica conformacional en escalas de tiempo catalíticamente relevantes es un importante rasgo biofísico en la evolución de proteínas.

En el presente trabajo de Tesis se profundiza el conocimiento sobre los mecanismos de interacción con el ADN de factores de transcripción con homeodominio que poseen aminoácidos particulares en sus respectivas hélices de reconocimiento, pertenecientes a las familias BEL, KNOX y PHD finger de Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos indican que las proteínas KNOX y BEL interactúan en forma similar, pero no idéntica, con el ADN. Estas diferencias pueden atribuirse principalmente al aminoácido de la posición 54 del homeodominio y, probablemente, son esenciales para la función de estas proteínas in vivo si se tiene en cuenta la conservación de este residuo en las proteínas de cada familia. Además, señalan que la formación del heterodímero BLH3(BEL)-STM(KNOX) produce un aumento en la afinidad de unión al ADN cuya magnitud depende de la secuencia del sitio de unión y, frente a la secuencia con un único núcleo TGAC, de las concentraciones relativas de cada una de estas proteínas. La proteína HAT3.1 de la familia PHD finger representa un caso extraordinario de divergencia dentro de la estructura del homeodominio. Los resultados aquí presentados señalan que esto se debe, en parte, a la presencia de los residuos H51 y W54, no encontrados en ningún otro homeodominio hasta el momento. Sin embargo, HAT3.1 interacciona específicamente con el ADN empleando mecanismos conservados de unión, constituyendo un claro ejemplo de la plasticidad de este dominio como motivo de unión a ADN y, por lo tanto, de su importancia en términos evolutivos para generar nuevas especificidades de interacción proteína-ADN.

En esta Tesis, por primera vez, se combina el análisis de los datos históricos de salinidad disponibles con series de tiempo de corriente y simulaciones numéricas de alta resolución, en un esfuerzo por comprender los procesos que ocurren en el activo e importante sistema estuarino del Río de la Plata. Con ese fin, se analizan las primeras series relativamente largas de corrientes ADCP colectadas en dos puntos del estuario. Se encuentra que la marea sólo explica alrededor de un 25% de la varianza. Aproximadamente otro 25% está asociado con actividad de ondas internas en los puntos de adquisición de datos, que corresponden a zonas de fuerte estratificación. Estas ondas son forzadas por la brisa tierra-mar y por la marea y son muy frecuentes durante la primavera y el verano. El 50% restante de energía está forzado por el viento en las escalas de tiempo sinóptica a intra-estacional. El estuario responde en una escala de tiempo de alrededor de 6 horas a la variabilidad del viento, con una estructura esencialmente barotrópica frente a vientos con una componente dominante perpendicular al eje del estuario y con una fuerte estructura baroclínica, con inversión en la dirección de las corrientes entre capas superiores e inferiores, para vientos con una componente paralela al eje del estuario. Aunque este tipo de respuesta es característica de cuencas semi-cerradas, no es típica de estuarios y es observada en el Río de la Plata como consecuencia de su gran ancho. Se utilizó el modelo hidrodinámico Estuary Coastal and Ocean Model (ECOM) juntos con datos CTD de campañas sinópticas históricas para evaluar las implicancias de la circulación forzada por el viento en la estratificación. Se encuentra que, aunque la estructura de cuña salina es una consecuencia de la intensa descarga continental en la región, los vientos predominantes favorecen su mantenimiento. Solamente bajo vientos intensos o persistentes del sudeste la estratificación puede quebrarse completamente. Sin embargo, la estructura vuelve a establecerse en un período de tiempo relativamente corto después de que los vientos se relajan. Los eventos con estas características son poco frecuentes en la región. Esto tiene un fuerte impacto sobre la biología ya que las especies que alberga el estuario requieren de ciertas condiciones de salinidad para su reproducción exitosa. Además, se caracterizó la respuesta de los campos de salinidad al forzante del viento y se encontraron indicios de eventos de surgencia a lo largo de la costa uruguaya frente a vientos del noreste, característicos de la estación cálida. Los resultados modifican el esquema conceptual vigente respecto de la señal estacional como principal característica del campo de salinidad en el Río de la Plata. Esta señal es el resultado de la mayor frecuencia de ocurrencia de vientos provenientes de direcciones determinadas a lo largo de las diversas estaciones. Situaciones caracterizadas como típicas de “invierno” o “verano” pueden ocurrir a lo largo de todo el año con gran variabilidad. La pluma de agua de baja salinidad impactaría en la plataforma continental en forma de pulsos alternativos hacia el noreste o el sudoeste en una escala del orden de los tres a cuatro días. Se identificaron los principales forzantes de variabilidad en las diferentes escalas de tiempo mediante una simulación de largo período realizada con el modelo Hamburg Shelf Ocean Model (HamSOM). Se encuentra que el primer modo de variabilidad en la escala interanual de la elevación de la superficie libre está forzado simultáneamente por la descarga continental y por el viento y ambos están asociados a los ciclos del ENSO. La variabilidad en la escala estacional explica un muy bajo porcentaje de varianza y está compuesta por una onda anual y una semianual, forzada por viento y descarga, respectivamente. La variabilidad en la escala subanual explica alrededor del 90% de la varianza y está forzada por el viento. Se encontró que los eventos extremos de crecidas en el estuario presentan a lo largo del tiempo una mayor frecuencia de ocurrencia y una mayor intensidad de respuesta. Por último, la arquitectura de modelado aplicada a la circulación barotrópica resultó exitosa mostrando ser una herramienta robusta para pronóstico y para el estudio de la variabilidad climática futura en respuesta al cambio climático.