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Se extendió el estudio de 1a acción del amoníaco a los disacáridoe benzoilados, para compararlos resultados obtenidos con los de las amonólisis de los monosacáridos acilados y los disacáridos acetilados. Se ha hecho una revisión del estado actual de las reacciones y métodos de benzoilación de los monosacáridos y disacáridos. Se hizo una revisión de la reacción de amonólisis de los derivados acilados de los monosacáridos y disacáridos que conduce a 1a formación de las N,N'-diacil-aldosilidendiaminas y a las N-acil-aldosilaminas. Se estudió la reacción de benzoilación de la celobiosa, lactosa y maltosa y se efectuó 1a amonólisis de la octa-O-benzoíl- celobiosa, octa-O-benzoíl-lactosa y hepta-O-benzoílmaltosa. Se encontró que la reacción de amonólisis era de carácter general también para los disacáridos benzoilados estudiados, obteniendose ademásde las N,N'-dibenzoíl-aldobiosilidendiaminas y N-benzoíl-aldobiosilaminas esperados, los mono-O-benzoíl-derivados. En el caso de la maltosa, en la cual se realizó 1a amonólisis de una hepta-O-belzoílmaltosa, no se obtuvieron derivados N-acilados. Las conclusiones anteriores se basan en los siguientes hechos cuyo detalle se encuentra en la parte teórica y experimetal de este trabajo: a.) De la celobiosa se preparó la octa-O-benzoíl-celobiosa y por la amonólisis de esta última se obtuvieron los siguientes productos: Celobiosa de pf. 232-234° con 48,8% de rendimiento; mono-O-benzoíl-celobiosa de [α]D +82° (a las 24 horas, en etanol) con 6,5% de rendimiento; N-benzoíl- celobiosilamina de [α]D +33,8 (piridina) con 0,9% de rendimiento; N,N'-dibenzoíl-celobiosilidendiamina de pf. 148-150° y [α]D -33,2 (agua) con 7,9% de rendimiento. Se prepararon los siguientes derivados: una octa-O-benzoíl- celobiosa isómera de la obtenida por benzoilación directa de la celobiosa; la hepta-O-acetil-N-benzoíl-celobiosilamina y la octa-O-acetil-N,N'-dibenzoíl-celobiosilidendiamina. Por benzoilación de la mezcla de amonólisis cruda se obtuvo una penta-O-benzoíl-N-benzoílcelobiosilamina cuya benzoilación dió lugar a 1a hepta-O-benzoíl- N-benzoíl-celobiosilamina. b.) De la lactosa se preparó la octa-O-benzoíl-lactosa y por amonólisis de esta se obtuvo la N,N'-dibenzoíl-lactosilidendiamina de pf. 196-198° y [α]D -20,9° (agua) con 9,6% de rendimiento; lactosa de pf. 220-222° con 28,3% de rendimiento y una mono-O-benzoíl-lactosa. Se prepararon la octa-O-acetil-N,N'-dibenzoíl-lactosilidendiamina y por benzoilación de la mezcla de amonólisis cruda y separación por cromatografía en columna, se obtuvo la hepta-O-benzoíl- N-benzoíl-lactosilamina. c.) De la maltosa se prepararon la octa-O-benzoíl-maltosa y una hepta-O-benzoíl-maltosa. Por amonólisie de 1a hepta-O-benzoíl-maltosa obtuvimos maltosa de pf.129-130° con 18,5% de rendimiento, mono-O-benzoíl-maltosa de pf. 140-145° de [α]D +117,7 (16 horas, agua) con 44% de rendimiento y una di-O-benzoíl-maltosa de pf. 90-92° y [α]D +92,1(etanol) con 0,4 % de rendimiento. Se preparó la hepta-O-acetíl-O-benzoíl-maltosa, por acetilación de la mono-O-benzoíl-maltosa. La obtención de derivados O-benzoilados se atribuye a1 efecto estérico debido a la influencia mutua de las dos mitades del disacárido y a la menor polaricazión del carbonilo del grupo benzoilo debido al efectormesomérico ejercido por el núcleo bencénico, en comparación con la del grupo acetilo, lo cual se traduce en una mayor estabilidad del grupo benzoilo frente a la reacción de amonólisis. Comparativamente la amonólisis del benzoílo es más lenta que la del acetilo y la migración del pirmero al carbono 1 podria ser mayor, lo cual se traduciria en un aumento del rendimiento de las N,N'-dibenzoíl-a1dobiosilidendiaminas. El rendimiento del azúcar libre es menor que en el caso de los disacáridos acetilados y en su lugar obtuvimos los derivados mono-O-benzoilados de 1a celobiosa, lactosa y maltosa.

La reacción de Wohl, utilizada como método de degradación de monosacaridos, consiste en tratar con amoniaco los nitrilos acilados de los ácidos aldónicos. Se obtienen asi los 1,1-bis(amido)-1-deoxi-polioles con un átomo de carbono menos, que por hidrólisis ácida dan los correspondientes monosacáridos. Los mismos 1,1-bis(amido)-l-deoxi-polioles resultan de la amonólisis de monosacáridos total o parcialmente acilados, de estructuras piranósicas, furanósicas_o aldehídicas. Así por ejemplo cuandola l,2,3,4,6-penta- O-benzoíl-D-glucosa, la 1,2,3,5,6-penta-O-benzoíl-D—glucosa o la 2,3,4,5,6-penta-O-benzoíl-D-glucosa se tratan con amoníaco en metanol, se obtiene el 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-D-glucitol. Para explicar la formación de los derivados bis(amido) de los monosacáridos, Isbell y Frush (J.Am.Chem.Soc., 71, 1579 (1949) propusieron un mecanismo basado en las transposiciones intramoleculares de los grupos acilos. Si bien no existen dudas acerca de la hipótesis básica de dichos autores, ya que la intramolecularidad ha sido demostrada experimentalmente, Su mecanismono aclara todos los detalles de 1a reacción. Con el objeto de disponer de una mayor información sobre el tema, Gros, Ondetti, Sproviero, Deulofeu y Deferrari (J.Org.Chem., 27, 924 (1962) determinaron en que extensión participa cada grupo benzoílo de la 1,2,3,4,6-penta-O-benzoil-D-glucosa en las transposiciones intramoleculares que tienen lugar durante su amonólisis. Encontraron que las contribuciones de los benzoilos de C-1, C-2, C-3, C-4 y C-6 a la formación del 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-D-glucitol son respectivamente O; 0,12; 0,76; 0,82 y 0,31 moles. Llamó la atención el pequeño valor correspondiente al grupo 2-O-benzoílo, cuya proximidad al carbono 1 hacía pensar que seria uno de los que más fácilmente podría transponerse para formar uno de los grupos benzamidos del producto de amonólisis. Este resultado indujo a estudiar, en la primera parte de esta tesis, las contribuciones de los grupos 2-O-benzoílos de las penta-O-benzoíl-D-glucosas de estructuras furanósica y aldehídica, con el objeto de determinar en que medida influiria en la misma la modificación de la estructura cíclica hemiacetálica y la presencia de un grupo aldehido libre en el monosacárido benzoilado. Se recurrió para este estudio al mismo método experimental utilizado por Gros et alia, que consiste en la marcación con carbono-14 del grupo benzoílo cuya contribución se desea determinar, habiéndose sintetizado las siguientes sustancias: a) 3,5,6-tri-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-D-glucosa. b) 2-0-benzoíl-(carbonilo 14C)-3,5,6-tri-O-benzoíl-D-glucosa. c) 1-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-2,3,5,6-tetra-O-benzoíl-D-glucosa. d) 2-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-1,3,5,6,tetra-O-benzoíl-D-glucosa. e) 2-0-benzoíl-(carbonilo 14C)-3,4,5,6-tetra-O-benzoíl-D-glucosa. f) 1,2-di-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-3,5,6-tri-O-benzoíl-D-glucosa. g) 3,5,6-tri-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-1,2-di-O-benzoíl-D-glucosa. h) 3,4,5,6-tetrapO-benzoíl-(carbonilo 14C)—2-O-benzoíl-D—glucosa. i) 3,5,6-tri-0-benzoíl-(carbonilo 14C)—1,2-O-isopropiliden-D-glucosa. j) 3,4,5,6-tetra-O—benzoíl—(carbonilo14C)-1,1-bis(etiltio)-l-deoxi-D-glucitol. k) 2-0-benzoíl-(carbonilo 14C)-3,4,5,6-tetra-O-benzoíl-1,1-bis(etiltio)-1—deoxi-D—glucitol. l) 2-0-benzoíl-3,4,5,6-tetra-O-benzoíl-(carbonilo 14C)—1,1-bis(etiltio-1-deoxi-D-glucitol. m) 2-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-3,4,5,6-tetra-O-benzoíl-l-sulfonato de sodio-D-glucitol. n) 2-O-benzoíl-3,4,5,6-tetra-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-1-sulfonato de sodio-D-glucitol. Las sustancias b, c, d, e, f, g, h, m y n fueron amonolizadas con metanol amoniacal, habiéndose aislado los 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-D— glucitoles radiactivos. En base a las medidas de radiactividad se calcularon las contribuciones de los grupos l y 2-O-benzoílos de la 1,2,3,5, 6-penta-0-benzoíl-D-glucosa y de los grupos 2-O-benzoílos de la 2,3,5,6 tetra- O-benzoíl-D-glucosa, de 1a 2,3,4,5,6-penta-0-benzoíl-D—glucosa y de su derivado bisulfítico. Se encontró que el grupo 1-O-benzoílo de la primera sustancia no contribuye a la formación del derivado 1,1-bis(benzamido), pasando totalmente al medio. El valor de la contribución del grupo 2-O-benzoílo de la 1,2,3,5,6-penta-O- benzoíl-D—glucosa (O,lO-0,13 moles) resultó del mismo orden que el correspondiente al benzoílo de la misma posición en la l,2,3,4,6-penta -O-benzoíl-D-glucosa, encontrado por Gros et alia, indicando que no existe una influencia debida a la naturaleza del cíclo hemiacetálico. Esta analogía en el comportamiento de los derivados benzoilados piranósico y furanósico de la D-glucosa resultó confirmada al obtenerse iguales valores para las contribuciones de los grupos 2-O-benzoilos de la 1,2,3,5,6-Penta-O-benzoíl-D-glucosa y de 1a 2,3,5,6-tetra-O—benzoíl-D— glucosa, hecho similar al encontrado en la serie de los derivados benzoilados de la D-glucopiranosa. En el caso de los derivados benzoilados de la D-glucosa sin cíclo hemiacetálico (2,3,4,5,6-penta-O-benzoíl-D-glucosa y su derivado bisulfítico), la contribución del grupo 2-O-benzoílo a la formación del l,l-bis(benzamido)-1- deoxi-D-glucitol, es del orden de 0,80 moles por mol de sustancia. Esta marcada diferencia entre los valores de las contribuciones de los grupos 2-0-benzoílos de las penta-O-benzoíl-D-glucosas de estructuras ciclicas hemiacetálicas y de cadena abierta de átomos de carbono con un grupo aldehido, sólo puede explicarse admitiendo que para ambos tipos de sustancias, las primeras etapas de la reacción son diferentes. De otra forma se llegaría a una etapa intermedia que sería independiente de la estructura del compuesto amonolizado (con un benzoílo más en posición 4 o 5 en el caso de los derivados de cadena abierta). Las escasas contribuciones de los grupos 2-O-benzoílos de las penta -O-benzoíl—D-glucosas que poseen-ciclos hemiacetálicos son interpretadas como debidas a una comparativamente menor velocidad de amonólisis de dichos grupos. Se llega a esta conclusión comparando los rendimientos obtenidos por amonólisis de derivados parcialmente benzoilados. En efecto, la 3,5,6-tri-O-benzoíl-D-glucosa da un rendimiento en 1,1-bis(benzamido)- l-deoxi-D—glucitol (16%) sensiblemente menor al obtenido a partir de la 2,3,5,6-tetra-O-benzoíl-D-glucosa (62%). Si la baja contribución del benzoílo en carbono 2 de la última sustancia se debiera a que la mayor parte del mismo es amonolizado pasando al medio, no se podría obtener el alto rendimiento indicado. En lo que respecta a los valores de los rendimientos de las reacciones de amonólisis de monosacáridos benzoilados, se estudió la posible influencia de algunos subproductos y productos laterales sobre las cantidades de 1,1-bis(benzamido)-l-deoxi-D—glucitol aisladas. Se comprobó que la presencia de amidas, D-glucosa y D-glucosilamina no influyen en la solubilidad del derivado bis(benzamido) en el medio del que se aisla. Se efectuó además la determinación del rendimiento en 1,1-bis(benzamido) -1—deoxi-D—g1ucitol obtenido por amonólisis de la l,2,3,4,6-penta- o-benzoil-D-qlucosa, por el método de dilución isotópica, habiéndose encontrado un valor (24,5-25,7%) sólo escasamente superior al obtenido por aislamiento. Cuando 1a amonólisis de los derivados benzoilados de los monosacáridos se efectúa en propanol-2 amoniacal se obtienen productos que conservan un grupo benzoílo esterificando al hidroxilo primario. (Gros, Lezerovich, Recondo, Deulofeu y Deferrari: Anal.Asoc.Quím.Arg., 50, 185 (1962). En esas condiciones, a partir de la 1,2,3,4,6-penta-O-benzoíl-D- glucosa resulta el 1,1-bis(benzamido)-l-deoxi-6-O—benzoíl-D-g1ucitol. En 1a segunda parte de esta tesis se extiende esa reacción a los casos de la 1,2,3,5,6-penta-O-benzoíl-D-glucosa, de la 2,3,4,5,6-penta-O- benzoíl-D-glucosa y de su derivado bisulfítico, que dan también 1,1-bis (benzamido)-1-deoxi-6-O-benzoíl-D-glucitol por anonólisis en propanol-2 amoniacal. La 1,2,3,4,6-penta-O-benzoíl-D—galactosa da 1,1-bis (benzamido)-1-deoxi-6-O-benzoíl-D-galactitol. Se ha realizado un estudio para comprobar si el grupo 6-O-benzoílo del 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-6-O-benzoíl-D-glucitol es el mismo 6-0-benzoílo originalmente presente en la 1,2,3,4,6-penta-O—benzoí1-D-glucosa, o si proviene total o parcialmente de transposiciones de benzoílos de otras posiciones hacia el hidroxilo primario. Para esto fueron preparadas y amonolizadas en propanol-2 amoniacal las siguientes sustancias: a) 1,2,3,4-tetra-O-benzoíl-6-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-D—g1ucosa. b) 1,2,3,6-tetra-O-benzoíl-4-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-D-g1ucosa. c) 1,2,3-tri-O-benzoíl-(carbonilo 14C)-4,6-di-O-benzoíl-D-glucosa. Los 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-6-O-benzoíl-D-glucitoles radiactivos obtenidos fueron a su vez amonolizados en metanol amoniacal, resultando los 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-D—glucitoles correspondientes. La comparación de las medidas de radiactividad permitió establecer que en su mayor parte (0,91 moles por mol de sustancia) el grupo 6-O-benzoílo del 1,1-bis(benzamido)-1-deoxi-6-O-benzoíl-D-glucitol proviene del 6-0-benzoílo de la 1,2,3,4,6-penta-0—benzoíl-D-glucosa. E1 resto tiene su origen en la transposición parcial del grupo 4-O-benzoílo hacia el hidroxilo del carbono 6; habiéndose comprobadoque no existen transposiciones de los grupos l, 2 y 3-O-benzoílos hacia dicha posición. En forma análoga se ha comprobado que se produce una transposición parcial (0,11 moles por mol de sustancia) del grupo 2-0-benzoílo del derivado bisulfítico de la 2,3,4,5,6-penta-O-benzoíl-D-glucosa por acción del propanol-2 amoniacal hacia el hidroxilo del carbono 6.

La terapia antiangiogénica se basa en estrategias moleculares que intentan bloquear la neovascularización tumoral y así detener la progresión de la masa neoplásica. Las células endoteliales suelen responder al estímulo estrogénico. La angiogénesis implica la proliferación del endotelio junto a la remodelación de la matriz extracelular, donde participan, las metaloproteinasas (MMPs) y sus inhibidores (TIMPs). En el presente trabajo se investigaron los posibles mecanismos antiangiogénicos del potente antiestrógeno nafoxidina y el intrincado papel del TIMP-1 en la vascularización y progrésión tumoral. Se encontró que el tratamiento in vitro de células endoteliales humanas de vena umbilical (HUVEC) con dosis no citotóxicas de nafoxidina disminuye de manera dosis-dependiente la proliferación. Nafoxidina redujo también la adhesión, la capacidad de extensión sobre el sustrato y la migración de las células endoteliales, e indujo un aumento en la activación de la MMP-2 y en la secreción de TIMP-1. Además, inhibió significativamente la invasión y la formación de cordones endoteliales sobre Matrigel. La acción antiangiogénica de nafoxidina podría asociarse a acciones indirectas, mediadas a través del aumento del TIMP-1, como también a efectos directos del antiestrógeno sobre las células HUVEC. Los cotratamientos in vitro con nafoxidina y el éster de forbol PMA indicaron que la acción antiangiogénica podría estar relacionada con la inhibición de vías de señalización intracelular dependientes de la proteína quinasa C. El cotratamiento con el inhibidor de fosfodiesterasas IBMX y el derivado de CAMP dbcAMP sugirieron la participación de múltiples vías de señales en la acción antiangiogénica de nafoxidina. Otros ensayos in vitro con el inhibidor de fosfolipasa D n-butanol, el ionósforo A23187 y el bloqueante de canales de calcio verapamilo indicaron la importancia de estas vías de señales en la formación de capilares endoteliales. Finalmente, se exploraron in vivo los efectos de nafoxidina y TIMP-1, empleando un modelo singénico de carcinoma mamario en ratones BALB/c y un melanoma murino inoculado en hídridos C57BL/6j-CBA transgénicos que sobrexpresan TIMP-1 humano en hígado y lo vuelcan a la circulación. Los datos obtenidos en animales ratifican La complejidad de los mecanismos regulatorios que operan in vivo durante la vascularización tumoral y diseminación metastásica. Este trabajo aporta elementos útiles para el futuro diseño de ensayos clínicos con nuevos agentes antiangiogénicos para el tratamiento del cáncer.

Fil:Bouso, Oscar. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Fil:Hanelo, María Olga. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El antiguo trabajo de Clöes sobre la preparación de la Ciafenina, contemplando la posibilidad de obtener benzonitrilos a partir del benzoato de potasio y el cloruro de cianógeno, fué el punto de partida de numerosos trabajos llevados a cabo en la Cátedra de Química Orgánica a cargo del Profesor Enrique V. Zappi. Continuando con estos trabajos, nos abocamos a estudiar las reacciones similares a las experiencias de Bouse y Hanelo, pero reemplazando las sales alcalinas y alcalinotérreas por las sales de los metales plata, mercurio y plomo, con el objeto de aportar nuevos elementos de juicio en lo referente a la influencia que tiene en el rendimiento de nitrilos, el catión empleado, según surge de la experiencia acumulada en trabajos anteriores. Ya que la Teoría Moderna postula la ionización completa de las sales aún al estado sólido, puede suponerse que la reacción entre el cloruro de cianógeno y las sales metálicas sea en realidad una reacción entre el cloruro de cianógeno y el anión (radical ácido), con independencia del catión empleado. Para discriminar si el menor rendimiento observado en trabajos anteriores, para los elementos mas pesados, responde a una influencia real del catión ó a razones de estabilidad térmica de las sales que no permiten llevar la reacción a sus condiciones de temperatura óptima. A los efectos de dilucidar este punto, se determinó la estabilidad térmica de las sales de elementos mas pesados, quedando estas limitadas, por razones varias, a la de plata (P.A. 107,88), mercurio (P.A. 200,61) y plomo (P.A. 207,21). Las substancias utilizadas en la experimentación fueron, en general, preparadas y purificadas en el laboratorio. Las sales se obtuvieron por doble descomposición entre la sal sódica del ácido benzoico y los nitratos de plata, mercurio y acetato de plomo, purificándolas por cristalización y lavado. El cloruro de cianógeno fué preparado en un primer intento, por la técnica desarrollada en el Inorganic Synthesis, pero algunas dificultades presentadas, determinaron que se lo preparara por la técnica de Held, modificada por Zappi, Bouso y Cagnoni, y de acuerdo a las siguientes ecuaciones: a) 4CNK + SO4Zn.7H2O = Zn(CN)2.2CNK + SO4K2 + 7H2O b) Zn(CN)2.2CNK + 4Cl2 = 2ClCN + 2ClK + Cl2Zn En la parte experimental se dan en forma breve las técnicas de preparación y algunas propiedades de los benzoatos utilizados, como así también en lo que se refiere al cloruro de cianógeno. Se consigna una descripción completa del aparato utilizado y de la técnica de trabajo empleada para efectuar la reacción fundamental, es decir, la acción del cloruro de cianógeno sobre los benzoatos de plata, mercurio y plomo respectivamente. La reacción común a todas las experiencias es la siguiente: R-COOMe + ClCN = ClMe + CO2 + R-CN R-: radical orgánico. Me: Ag, Hg/2, Pb/2. La parte fundamental del presente trabajo consistió en un análisis riguroso de los resultados y la comparación de los mismos con los obtenidos por Bouso y Hanelo, con el fin de establecer la influencia del catión en el rendimiento del bensonitrilo, y arribar a las conclusiones finales. Se llega a constatar, a pesar de lo expuesto en trabajos anteriores, que no puede determinarse con presición de rendimiento de la reacción: R-COOMe + ClCN = R-CN + ClMe + CO2 que dependa del peso atómico de los cationes. La variación de rendimiento que se observó entre los benzoatos de plata (P.A. de la plata 107,88) y de bario (P.A. del bario 137,36) por un lado, y los benzoatos de mercurio (P.A. del mercurio 200,61) y de plomo (P.A. del plomo 207,21) por el otro, no varían en la relación que lo hacen los pesos atómicos de los cationes. La temperatura influye notoriamente en los rendimientos de la reacción en cuanto al benzonitrilo bruto se refiere (benzonitrilo + ciafenina) en todas las series estudiadas. La temperatura óptima de reacción está alrededor de los 200°C, hallándose limitada la misma a la estabilidad térmica de las sales empleadas. Se confirma que la reacción entre el cloruro de cianógeno y los benzoatos metálicos tiende a ser cuantitativa, dependiendo esto de la técnica empleada y de la intimidad de contacto de las fases reaccionantes. Se ratifica que el cloro del cloruro de cianógeno queda en la parte mineral de los productos de reacción. Se constata que la ciafenina es un producto constante de la reacción, independiente de la naturaleza del catión empleado. Los resultados experimentales se reunen en varias tablas; se intercalan dos gráficos comparativos de los rendimientos del benzonitrilo bruto en función de la temperatura y de los pesos atómicos de los cationes. Se concluye el presente trabajo con una bibliografía extensa (49 citas bibliográficas) en la que se han incluido las últimas investigaciones efectuadas sobre el tema.

El estilbestrol a1 igual que las hormonas esteroides, inhibe selectivamente la cadena de transporte de electrones mitocondrial. La NADH oxidasa es mucho más sensible que la succinato oxidasa, ubicándose inicialmente su sitio de acción en el segmento NADH-(Q,cit b). Se ensayó un fraccionamiento de la cadena, con el objeto de eliminar sectores no involucrados, utilizándose particulas NADH y succinato citocromo c reductasa. En adelante se utilizaron segmentos funcionales, ya que las modificaciones preparativas introducidas por el fraccionamiento, alteraban las respuestas al estrógeno. Se utilizó el segmento NADH-citocromo b. Con el estilbestrol y análogos, se determinaron por espectrofotometría diferencial modificaciones en los niveles de óxido-reducción de los componentes de la región "NADH flavoproteína" en primer lugar citocromo b y en segundo lugar flavoproteínas y otros componentes que contribuyen a las variaciones espectrofotométricas a 465-510 nm. Se determinó que el estilbestrol produce desplazamientos del nivel de estado estacionario de óxido-reducción del citocromo b hacia la oxidación en el sistema aeróbico y coincidentemente una inhibición de la reducción directa en el sistema inhibido por cianuro. Se tituló el efecto del estrógeno y análogos sobre este sistema NADH-citocromo b y se encontró que actúan con la misma especificidad que sobre la respiración mitocondrial, sobre la NADH oxidasa y sobre la NADH-Q reductasa, segmento funcional utilizado posteriormente. Los dimetiléteres (fisiológicamente inactivos) no inhiben la transferencia de electrones. La concentración I (50) para estos efectos fué para Stil: 2 μM. Sobre la NADH-oxidasa midiendo consumo de O2 polarográficamente, se obtuvo un valor 0.75 μM. Se encontró que el ascorbato potencia significativamente la inhibición por estilbestrol. La antimicina A modifica el flujo de electrones hacia el b por acción sobre dicho componente, además del bloqueo que produce a un sitio inmediato posterior. No se observa efecto del Stil cuando el parámetro utilizado es reducción del b en sistema anaeróbico por cianuro más antimicina A. El ascorbato es capaz de antagonizar el efecto del antibiótico y restablecer el efecto de Stil. En el sistema cerrado, con cianuro como inhibidor terminal el citocromo b se mueve libremente en presencia de Stil, en un equilibrio de óxido-reducción sumamente sensible a las variaciones del flujo de electrones desde el NADH. Se ensayó el agregado de Q2 y fumarato. En todos los casos, la reoxidación del citocromo b resulta dependiente de la concentración del estrógeno, en función de su efecto primario: inhibición del transporte a un sitio anterior a b. Por lo tanto b no es el sitio de acción del estrógeno. Queda abierta la cuestión de una posible influencia sobre la conformación del mismo, pero no en relación con el sitio de acción fundamental. El citocromo b, según criterios cinéticos no se encontró alineado en la cadena principal, sino en posición de salto tal como ocurre en general en este tipo de preparaciones no fosforilantes. La reoxidación observada del citocromo b en el sistema cerrado por cianuro se efectuaría a través de una vía paralela a la vía principal, insensible al cianuro. En cuanto a las variaciones espectroscópicas a 465-510 nm (flavoproteínas), en el sistema aeróbico, Stil no modifica la reducción y sí la reoxidación. En sistemas cerrados, inhibidos con cianuro se produce una curva bifásica de reducción y sí el estrógeno se agrega a la flavoproteína ya reducida, se logra un pequeño aunque significativo desplazamiento hacia la oxidación. Agregando ascorbato al medio de reacción la acción de Stil se potencia, al igual que el caso observado del citocromo b y el sector NADH-deshidrogenasa se resuelve en dos componentes de óxido-reducción, uno de bajo potencial del lado sustrato y otro del lado O2 del sitio sensible al Stil. El succinato resulta capaz de reducir a este último, además de su correspondiente flavoproteína. Se ensayó la acción de Stil y análogos sobre el segmento NADH-Q exógena de la cadena respiratoria con idénticos resultados que los comentados para el segmento NADH-citocromo b. Se mantiene el requerimiento de OH fenólicos libres. Las concentraciones inhibidoras 50 %(I50) son para Q2 μM 4.0 (Stil); 7.5 (Hex); 15 (Stil MME)y para Q0 (Stil) 18; (Hex) 15 y (Stil MME) 30. Los dimetiléteres no resultaron activos en ninguno de los sistemas ensayados. Se determinó que la disminución de la actividad enzimática en presencia de Stil es proporcional a la cantidad de enzima presente y depende de la concentración del inhibidor en la mezcla de reacción. La inhibición se revierte por simple dilución de la mezcla enzima/inhibidor. La naturaleza reversible de la inhibición permitió un tratamiento cinético en el estudio de la inhibición sobre el segmento NADH-Q. Se descarta una probable competencia entre Stil y quinona ya que los gráficos (Lineweaver y Burk) obtenidos dan una inhibición no competitiva de Stil con relación al sitio fundamental de entrada de la quinona. Los valores de Ki obtenidos confirman la naturaleza no competitiva de la inhibición en cuanto a la reacción de quinona con la cadena al sitio fundamental de entrada. Se hace un cálculo relativo de las contribuciones respectivas a dos sitios de entrada de la quinona exógena. Se analiza una supuesta competencia que resulta de la aparición de una actividad NADH-Qo insensible al estrógeno a altas concentraciones de quinona. Esta actividad seria la consecuencia de una interacción directa de Qo con el grupo flavina de bajo potencial de la NADH-deshidrogenasa. Como se esperaba, dicha actividad resultó competitiva con respecto al NADH. Se ensaya el efecto de Stil sobre reacciones que involucran directamente a dicho grupo flavina tales como transhidrogenasa y ferricianuro reductasa. El estilbestrol no afecta estas actividades de acuerdo con lo encontrado para la actividad NADH-Qo reductasa a altas concentraciones de la quinona. Se descarta el grupo flavina como sitio de acción del inhibidor. En experimentos de preincubación de la enzima con Stil no directamente comparables se obtienen variaciones de las actividades NADH-citocromo c reductasas y ferricianuro reductasa que se deberían a cambios conformacionales de la NADH deshidrogenasa particulada funcional. En correspondencia se obtiene aumentada reactividad a mercuriales. Todos estos resultados localizan el sitio sensible sobre el sector NADH deshidrogenasa en las proximidades del componente I (excluyendo al grupo flavina), dejando un segundo componente redox del lado oxígeno. La naturaleza de este segundo componente es por el momento discutible ya que se han propuesto dos esquemas diferentes. Se ha ensayado el efecto de Stil y rotenona, resultando aditivas las inhibiciones ó dando respuestas análogas cuando se ensayaron separadamente. Esto indicaría que ambos inhibidores afectarían al mismo componente enzimático, no necesariamente al mismo grupo ya que se encontraron diferencias en presencia de ferricianuro y ascorbato. Pueden suponerse diferentes mecanismos de acción dada la diferencia de estructuras. Se ha postulado un probable mecanismo de acción en lo que respecta a la acción del estilbestrol y análogos, no comprobado, pero que responde a los hechos experimentales observados. El estilbestrol actuaría en este sistema por su capacidad de producir radicales libres H., capaces de ceder electrones a un sustrato orgánico adecuado, grupos disulfuro u otros equivalentes. El agregado de acido ascórbico potenciaría al sistema por regeneración del difenol a partir de la doble quinona, explicándose así la mayor actividad del sistema acido ascórbico-estilbestrol que el del estilbestrol aislado. El monometiléter tendría menor eficacia ya que daría l H. por mol en lugar de dos. El otro radical sería menos reactivo ya que puede estabilizarse por resonancia. Finalmente los dimetiléteres inactivos formarían bisradicales pero no H., cumpliéndose de esta manera la proporcionalidad del efecto con el número de OH fenólicos libres. Los experimentos de preincubación aunque no directamente comparables, sugieren la formación de grupos sulfhidrilos libres ya que se observa aumentada reactividad a mercuriales. El ferricianuro interferiría la reacción a nivel de la enzima compitiendo con el grupo Prot-S, por el electrón cedido por el átomo de hidrógeno. Esta hipótesis sería válida exclusivamente para el estilbestrol y análogos en coincidencia con los requerimientos para su acción estrogénica, no así para los estrógenos naturales en los cuales no se requieren OH fenólicos libres para la inhibición, como lo prueba la acción de los dimetil-derivados del 17 estradiol.

El control estacional de la reproducción a través de la información fotoperiódica se basa en la melatonina como mensajero clave que actúa sobre los componentes del eje hipotalámicohipofisario-gonadal (H.H.G.). Esta hormona es producida en la glándula pineal por la enzima AANAT, y se une a los receptores MT1 y MT2 del hipotálamo, hipófisis y ovario, modulando la secreción de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), la hormona luteinizante (LH) y los esteroides sexuales estradiol y progesterona, respectivamente. La vizcacha de las llanuras de Sudamérica (Lagostomus maximus) posee caracteres reproductivos únicos, como poliovulación natural de hasta 800 oocitos por ciclo estral, inhibición de la atresia folicular, una preñez prolongada con reabsorción embrionaria selectiva y reclutamiento folicular, y una pseudo-ovulación con generación de cuerpos lúteos accesorios durante la gestación. Presenta dos períodos reproductivos al año, siendo el que va de abril a agosto más eficiente que el que abarca de octubre a febrero. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia del fotoperíodo sobre el funcionamiento del eje H.H.G. de la vizcacha. En primer lugar se determinó la secuencia del ARNm de la prepro-GnRH hipotalámica. Se encontraron dos isoformas que difieren únicamente en el largo de la secuencia 5’-UTR. La variante de GnRH determinada fue mGnRH, y presentó un alto grado de conservación entre caviomorfos emparentados, mientras que la secuencia del péptido asociado a GnRH (GAP) mostró alta una variabilidad. El análisis de la expresión del sistema melatoninérgico a lo largo del ciclo reproductivo de la vizcacha arrojó como resultado la co-localización de GnRH con ambos receptores de melatonina en núcleos hipotalámicos que controlan la reproducción, el área preóptica y los núcleos supraóptico y supraquiasmático. Además, se determinó un incremento de la expresión de AANAT y de los niveles de melatonina conforme progresa la gestación, y los menores niveles de MT1 y MT2 hipotalámicos se registraron en la etapa media de la preñez. Esto indicaría que el sistema melatoninérgico contribuye al mantenimiento de la extensa gestación de la vizcacha. El efecto de la disponibilidad lumínica se determinó en vizcachas en fase folicular y en fase lútea inducida. En el primer caso, la exposición contínua a la luz redujo los niveles séricos de melatonina pero incrementó la expresión de AANAT y en el ovario aumentó el número de folículos antrales y de cuerpos lúteos, los niveles de progesterona y la expresión de MT2 , mientras que la oscuridad constante incrementó los niveles de GnRH y MT1 , los niveles séricos de estradiol y la expresión de MT1 en el ovario. En animales en fase lútea, la luz incrementó los niveles de melatonina y de LH, mientras que la oscuridad estimuló la expresión de AANAT y del MT1 hipotalámico. Estos resultados indicarían que los desajustes fotoperiódicos y hormonales alteran la respuesta del hipotálamo, de la hipófisis y del ovario de manera diferencial en función de la etapa del ciclo estral. La expresión hipotalámica de los receptores de estrógenos α (REα) y β (REβ) también varió con la disponibilidad lumínica; en animales en fase folicular se observó un incremento de los niveles de REα con la luz y un aumento de REβ con la oscuridad. Por otro lado, en animales en fase lútea, la luz constante aumentó la expresión hipotalámica del REβ. En ensayos de pulsatilidad, se observó que la melatonina estimula la secreción de GnRH y de LH en hembras con ovulación inducida. Asimismo, se determinó el efecto inhibitorio del neuroestradiol sobre la secreción de GnRH, mientras que la incubación con melatonina revirtió ese efecto. Por otro lado, la incubación conjunta de melatonina con estradiol o con un agonista del REβ incrementó la liberación de GnRH, sugiriendo que la interacción de melatonina y estradiol resulta necesaria para la actividad del eje H.H.G. En conclusión, este es el primer trabajo que demuestra que en la vizcacha, la regulación de cada órgano a través de la información fotoperódica, así como su respuesta a la melatonina y el contexto hormonal del ciclo estral, confluyen en la modulación del eje reproductivo de manera de ajustar el inicio de la actividad del eje H.H.G. con la estación más favorable para la reproducción. Esta regulación particular, dependiente de la etapa del ciclo estral y de la disponibilidad lumínica, demuestra la relevancia de la información ambiental para llevar a cabo una gestación exitosa y remarca la importancia de esta especie como un valioso modelo de regulación neuroendócrina de la reproducción en mamíferos.