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Los polisacáridos juegan un papel esencial en el metabolismo celular y en el funcionamiento de los organismos. Son sintetizados empleando enzimas glicosiltransferasas (GTs), cuyas propiedades determinan el tamaño y la estructura del producto final. Muchas GTs están localizadas en membranas celulares, dificultando su purificación y caracterización. En este trabajo de Tesis se estudian bioquímica y biofísicamente dos GTs que participan en la síntesis del polisacárido xantano producido por Xanthomonas campestris. La primer GT es GumI, de la cual sólo había escasos antecedentes genéticos. En esta Tesis se presenta la primera caracterización bioquímica y funcional de GumI, demostrando su actividad glicosiltransferasa previamente propuesta. Se realizaron ensayos de complementación funcional, demostrando su actividad manosiltransferasa in vivo. Además, se demostró que GumI está unida a la membrana, y que la interacción está mediada por interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. GumI fue purificada y su actividad fue estudiada in vitro, obteniéndose los parámetros óptimos de reacción. GumI dio origen a una nueva familia, GT-94, en la clasificación Carbohydrate Active EnZymes. Finalmente, mediante ensayos de cristalización se obtuvieron agujas bidimensionales que al presente no fueron aptas para resolver la estructura de GumI por cristalografía de rayos-X. La segunda GT es GumK, cuya estructura cristalina se resolvió en el laboratorio y, como GumI, es una GT monotópica de membrana. Se profundizó sobre las bases moleculares de la unión a sus sustratos y a la membrana. Se realizaron diferentes mutaciones sobre la zona propuesta de unión a la membrana, demostrando la complejidad de dicha interacción. Además, se realizaron estudios por simulación computacional con el fin de obtener la estructura del complejo GumK/UDP-GlcA. El modelo obtenido explicaría la especificidad por este sustrato. Estudios realizados en este trabajo mediante diversas técnicas -tales como proteólisis limitada, fluorescencia, dicroísmo circular, calorimetría isotérmica de titulación, resonancia magnética nuclear y dispersión de rayos-X a bajo ángulo- sugieren fuertemente la presencia de cambios conformacionales disparados por la unión de UDP-GlcA.

La fecundación es un proceso complejo que requiere de múltiples eventos coordinados que llevan a la fusión del espermatozoide con el ovocito. Algunos de estos eventos requieren de interacciones proteína-carbohidrato. Una amplia evidencia experimental, obtenida en distintas especies, sugiere que glucosidasas de la superficie del espermatozoide podrían actuar a modo de lectina reconociendo azúcares específicos de la envoltura de los ovocitos (zona pelúcida en mamíferos o envoltura vitelina en anfibios) facilitando la unión de los gametos durante la fecundación. Además de este rol, se ha propuesto que glucosidasas del ovocito, que son liberadas luego de la fecundación, actuarían sobre los azúcares de las glucoproteínas que conforman su envoltura, modificando los sitios de unión al espermatozoide y contribuyendo de este modo con el bloqueo de la polispermia. La presencia de glucosidasas se ha reportado en los gametos de casi todas las especies de vertebrados estudiadas. Entre ellas, la enzima de origen lisosomal N-acetil--D-glucosaminidasa (EC 3.2.1.52), que metaboliza residuos de N-acetil glucosamina y/o N-acetil galactosamina terminales desde glucoconjugados, ha sido ligada tanto a la unión de las gametos como a la prevención de la polispermia en diversas especies de animales. En los anfibios, se ha informado que una Hex presente en los gránulos corticales de los ovocitos de X. laevis es liberada durante la reacción cortical (Greve y col., 1985), y que hidroliza residuos N-acetil glucosamina terminales de ZPC (Vo y col., 2003), una de las glucoproteínas que componen la envoltura vitelina (EV) de los ovocitos. La hidrólisis de estos residuos inhibe la fecundación, sugiriendo que los mismos actuarían como receptores espermáticos y que la Hex estaría asociada al bloqueo de la polispermia (Hedrick, 2008). Sin embargo, hasta el momento no se ha descripto la estructura molecular de ninguna Hex de anfibio, ni se han caracterizado las isoformas presentes en sus gametos. Por otra parte, son escasas las evidencias experimentales sobre el rol de la Hex en la fecundación en otras especies de anfibios. En este trabajo de tesis, utilizando secuencias conservadas de la región N-terminal, central y C-terminal de Hexs caracterizadas en mamíferos, se logró identificar la secuencia de ADNc de una putativa Hex de X. laevis a partir de una biblioteca de transcriptos. El ORF completo contenido en este ADNc se secuenció a partir del clon XL250c11ex obtenido del Instituto Nacional de Biología Básica de Japón (NIBB) y la secuencia se anotó en el GenBank (n° acceso JN127371). El ORF secuenciado (1662 pb) codificó un polipéptido de 553 residuos de aminoácidos. Estudios realizados in silico permitieron verificar que este polipéptido presenta una alta homología con las subunidades de Hexs previamente caracterizadas (>56 % identidad aminoacídica) y que conserva todos los residuos de aminoácido que conforman el sitio activo de las Hexs. La identidad Hex de esta proteína fue confirmada por la transfección del ADNc JN127371 en células de ovario de hámster chino (CHO). Estudios de Western blot, utilizando anticuerpos -Hex desarrollados en esta tesis, permitieron verificar la expresión de un polipéptido del tamaño esperado en los extractos celulares totales provenientes de las células transfectadas. Además, estos extractos mostraron un aumento de su actividad Hex cuando fueron comparados con los extractos provenientes de cultivos transfectados con un plásmido control. El gen codificante para la Hex caracterizada fue identificado en X. tropicalis. El estudio de su secuencia y la comparación por homología con ADNcs de ORF completo, tanto de X. laevis como de X. tropicalis, permitió predecir que dos Hexs distintas podrían ser originadas desde él, por medio del splicing alternativo de dos de sus exones. En los mamíferos, tres isoformas de la Hex (HexA, HexB y HexS) han sido caracterizadas, cada una compuesta por la homo o heterodimerización de dos subunidades distintas denominadas  y . Estas subunidades pueden diferenciarse por sus sitios activos (Lemieux y col, 2006) y fue encontrado que están codificadas en genes separados que se cree que evolucionaron desde un gen ancestral común (Proia, 1988). El estudio de los sitios activos de las dos Hexs generadas por splicing alternativo a partir del gen caracterizado en Xenopus, y su comparación con los de las subunidades  y  que constituyen las Hexs de humano, mostró que una de estas Hex presenta un sitio activo de tipo , mientras que la otra presenta un sitio activo de tipo . Esto sugiere que en los anfibios las distintas isoformas de la Hex podrían generarse por splicing alternativo desde un mismo gen; a diferencia de los mamíferos donde se generan por subunidades codificadas en genes separados. Este hallazgo nos permitió hipotetizar, que el splicing alternativo pudo ser un mecanismo ancestral para la generación de las distintas isoformas de la Hex antes de que el gen ancestral de la Hex se duplicara y divergiera durante el curso de la evolución. Utilizando anticuerpos específicos obtenidos a partir de la expresión transgénica en E. coli de un fragmento N-terminal de la Hex codificada en el ADNc JN127371 se inmunocaracterizaron las Hexs presentes en los ovocitos de R. arenarum. La Hex fue encontrada tanto en el interior del citosol como en los gránulos corticales de los ovocitos. Esta localización fue confirmada por estudios de actividad enzimática realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato. La Hex de gránulos corticales fue liberada al espacio perivitelino durante la reacción cortical permitiendo suponer su participación en el bloqueo de la polispermia. En los espermatozoides de R. arenarum la Hex fue encontrada en las membranas apicales (plasmática y/o acrosomal externa) provenientes de la cabeza, en el contenido acrosomal y en los espermatozoides reaccionados. Estos hallazgos permiten suponer que la Hex de espermatozoides podría estar vinculada a la unión inicial de los gametos, y que podría participar en el pasaje del espermatozoide reaccionado a través de la EV del ovocito. El rol biológico de la Hex, y de otras glucosidasas, en la fecundación de R. arenarum, fue estudiado mediante ensayos de fecundación in vitro y experimentos de unión de espermatozoides a EVs aisladas. En estos ensayos se demostró que la inhibición de la Hex con el inhibidor específico competitivo 2-acetamido-2-deoxi-D-glucono-1,5-lactona disminuyó la tasa de fecundación de los ovocitos, de manera concentración dependiente. Además, tanto este inhibidor, como el pretratamiento de las EVs aisladas con una Hex comercial pura, fueron capaces de inhibir la unión de los espermatozoides a la EV, demostrando que la Hex presente en los espermatozoides de R. arenarum está involucrada en la unión primaria con el ovocito, reconociendo alguno de sus azúcares sustrato en la EV. Experimentos realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato, mostraron que la fucosidasa es la principal actividad glucosídica en los gránulos corticales de los ovocitos de R. arenarum, permitiendo suponer su participación en la prevención de la polispermia. La adición de fucosa como azúcar competidor en los ensayos de fecundación in vitro redujo significativamente la tasa de ovocitos fecundados. Sin embargo, la adición de fucosa no interfirió la unión de los espermatozoides a las EVs asiladas. Estos resultados sugieren que la fucosidasa participa en alguna de las etapas del proceso de fecundación de R. arenarum, pero no en la unión de los gametos a nivel de la EV.

La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas.

La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasa autocatalítica descripta inicialmente en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.). Se había propuesto que la UPTG era capaz de iniciar la síntesis de α-glucanos unidos a proteína in vitro y que tendría una función de proteína iniciadora de la biosíntesis del almidón. La UPTG de tubérculo de papa se purificó hasta aparente homogeneidad, se desarrollaron anticuerpos policlonales específicos contra la misma y se clonaron cADNs correspondientes a la UPTG por screening de genotecas de expresión de papa. Ensayos de Northern blot y Western blot mostraron que tanto el ARN mensajero como la proteína UPTG están presentes en un nivel semejante en todos los tejidos de la planta. Algunas de las secuencias clonadas se expresaron en E. coli obteniéndose UPTG recombinante enzimáticamente activa. Se encontró que tanto las proteínas recombinantes como la purificada de tubérculo pueden ser glicosiladas a partir de UDP-Glc, UDP-Xil o UDP-Gal y que la glicosilación es reversible. Dos cADNs obtenidos fueron secuenciados totalmente, esto permitió detectar un muy alto grado de identidad (~ 90%) entre la secuencia de la UPTG y varias secuencias de proteínas vegetales de función aún no determinada que localizan específicamente en la región trans del aparato de Golgi. La secuencia de la UPTG no presenta zonas hidrofóbicas que puedan corresponder a regiones transmembrana ni un posible péptido señal que permita su entrada a plástidos o al sistema de endomembranas de la célula. Estos resultados sugieren que la enzima localizaría en el lado citoplásmico del aparato de Golgi y no en los plástidos en donde ocurre la síntesis del almidón, por lo tanto están en contra de un posible rol de la UPTG en la síntesis de este polisacárido. En ningún organismo que no sea vegetal se encontró una proteína que pueda considerarse homóloga a la UPTG. Esta característica, sumada a su localización indicarían una posible función relacionada con la síntesis de los polisacáridos complejos de la pared, función exclusiva del aparato de Golgi de las células vegetales. La especificidad de la UPTG por distintos nucleótidos azúcares y la reversibilidad de la reacción de glicosilación hacen pensar que la UPTG podría estar formando parte de un sistema complejo que acople el transporte de nucleótidos azúcares con la síntesis de polisacáridos estructurales.

La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasa autocatalítica descripta tanto en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.) como en endosperma de maíz (Zea mays), involucrada en la síntesis de polisacáridos. Encontramos diferentes isoformas de UPTG de papa las cuales se expresaron en E. coli y se caracterizaron bioquímicamente. Las isoformas UPTG1 y UPTG2 no sólo presentan características cinéticas diferentes sino que además se expresan diferencialmente en los diversos tejidos de la planta. Se encontró una alta expresión de los transcriptos de UPTGl en estolones, tubérculos y raíces mientras que la expresión de los mensajeros de UPTG2 era elevada en todos los tejidos analizados, principalmente en hojas y tallos. El análisis del ADN genómico de papa sugiere la existencia de nuevas isoformas de UPTG, lo que sumado a la presencia de proteínas homólogas a la UPTG en otras especies vegetales, muestran que dichas glicosiltransferasas autocatalíticas constituirían una pequeña familia multigénica presente sólo en plantas superiores. Los estudios bioquímicos de la reacción de glicosilación de la UPTG mostraron que un único residuo de glucosa, xilosa o galactosa se une a la enzima en configuración β, con un tipo de unión que se comportaria más bien como las del tipo N. Además, el análisis de la reversibilidad de la reacción de glicosilación mostró que la UPTG catalizaría la ruptura del enlace glicosídico. El estudio de la naturaleza del inhibidor de la UPTG en maíz reveló que éste seria la isoforma SS1 de la sacarosa sintetasa presente principalmente en el endosperma. La isoforma SS1 ha sido relacionada recientemente con la biosíntesis de polisacáridos de pared celular y su asociación con la UPTG de maíz aporta una nueva evidencia a favor de dicha hipótesis. Los resultados de esta Tesis muestran que la UPTG de papa podía ser fosforilada in vitro. El tratamiento con fosfatasa de la proteína UPTG recombinante mostró que la defosforilación de la UPTG incrementa su glicosilación y que a su vez, la glicosilación de la enzima favorece la aparición de formas de mayor tamaño molecular inmunológicamente relacionadas con la UPTG. Se piensa que la defosforilación de UPTG incrementaría su glicosilación promoviendo la asociación de la proteína a otras proteínas o a sí misma. Se propone que la proteína UPTG se asociaría funcionalmente a elementos de anclaje, desconocidos hasta el momento, presentes en la membrana del Golgi facilitando el transporte de los UDP-azúcares sustratos de la biosíntesis de pectinas y hemicelulosas. Así, no podemos descartar que la defosforilación de la UPTG favorezca su asociación a membranas lo que podria involucrar un mecanismo de localización de la enzima. Los resultados con respecto al análisis de la expresión de ARNm de UPTG, sugieren que la enzima se expresaría principalmente en tejidos cuyas células estarían en estado de activo crecimiento y/o elongación. Basados en el hecho que en tejidos en elongación hay una activa síntesis principalmente de pectinas y hemicelulosas, los datos mostrados constituyen una fuerte evidencia que apoya la hipótesis que propone que la UPTG estaría involucrada en la síntesis de los polisacáridos no celulósicos que componen la pared celular vegetal. Más aún, la existencia de isoenzímas redundantes de UPTG sugiere que la enzima formaría pane de un sistema complejo esencial para la viabilidad de la célula vegetal.

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol de la proteina espermática humana proacrosina/acrosina como molécula de adhesión a las glicoproteínas de la zona pellucída (ZP). En una primera etapa, se llevó a cabo un análisis bioinformático sobre la secuencia aminoacídica de proacrosina con el propósito de identificar sitios potenciales de unión a glicoproteínas de la ZP. El resultado de este análisis reveló que los residuos Lys74. Lys169, Arg172, Arg199, Arg249, Lys251, Arg252 y la secuencia KRLQQKLIE, localizada entre los residuos 367-374, conformarían sitios potenciales de unión a la ZP. A continuación se realizaron experimentos para evaluar la interacción entre proacrosina/acrosina con glicoproteínas de la ZP. Para ello se desarrolló una estrategia de subclonado del ADNc de proacrosina humana en vectores de expresión procariotas (pET-22b, pGEX-3X) para la expresión de proacrosina recombinante. Utilizando el sistema de expresión en forma directa (pET-22b) se obtuvo un producto de expresión recombinante correspondiente a la proenzima (Rec-40), y productos truncados del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, Rec-20, Rec-10). Estas proteinas fueron caracterizadas mediante la utilización de anticuerpos especificos y análisis de secuenciación de aminoácidos, determinándose que Rec-30 correspondería a los residuos 1-300, Rec-20 a 1-190 y Rec-10 a 1-160 de proacrosina humana. Utilizando el mismo sistema de expresión se sintetizó un producto de expresión correspondiente a los residuos 1-59 de proacrosina (Rec-6). Los productos de expresión, obtenidos como cuerpos de inclusión, fueron solubilizados y aislados mediante electroforesis preparativa. El estudio de la interacción entre proacrosina/acrosina recombinante y las glicoproteínas de la ZP se llevó a cabo utilizando ensayos de unión en fase sólida ("Ligand blot", "Dot blot", ensayo en placa de poliestireno). Se utilizaron glicoproteínas obtenidas de ovocitos humanos de descarte de programas de fecundación in vitro, así como glicoproteínas obtenidas por expresión en células CHO a partir del ADNc (rec-hZPA, rec-hZPB, rec-hZPC). El resultado de estos estudios indicó que proacrosina recombinante (Rec-40) y fragmentos del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, 20 y 10) tienen capacidad de unión a glicoproteínas de la ZP y a azúcares. Las glicoproteínas de la ZP mostraron diferente capacidad de unión a proacrosina/acrosina, siendo hZPA el ligando principal. El mecanismo de unión involucraría interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados positivamente en proacrosina/acrosina, y oligosacáridos sulfatados en la ZP, así como el reconocimiento de residuos de fucosa y manosa presentes en los oligosacáridos de la ZP. El resultado del mapeo de los sitios de unión en la molécula de proacrosina permite proponer que éstos estarían localizados en dos regiones de la proteína. Una región estaría comprendida entre los residuos 59-160 (Dominio II), y otra entre los residuos 300-402 (Dominio III). Los sitios de unión localizados en el Dominio II de la proteina estarían estabilizados por uniones no covalentes y puentes disulfuro, mientras que los sitios localizados en el Domino II estarían estabilizados por interacciones no covalentes, y tendrían una contribución principal a la afinidad de la interacción. En dichas regiones, los residuos Lys74, Lys108, Lys114 y el motivo KRLQQKLIE (residuos 367-374), identificados mediante el análisis de secuencias, participarían en la interacción con glicoproteinas de la ZP y azúcares. En resumen, este trabajo muestra que proacrosina/acrosina humana presenta La capacidad de reconocer glicoproteinas de la ZP. de manera independiente de la actividad de proteasa. Esto permite proponer que proacrosina/acrosina participaría como molécula de adhesión en la unión secundaria del espermatozoide a la ZP en el humano.

La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro.

La Fusariosis de la espiga de trigo (FET) es una compleja enfermedad fúngica que afecta tanto al rendimiento y calidad de la producción granaria como a la salud por acción de la micotoxina asociada. Diversas especies de Fusarium pueden relacionarse con la FET. La distribución y predominancia de estos patógenos están determinadas en gran parte por factores climáticos como la temperatura y la humedad. En Argentina, el agente fúngico dominante asociado a la FET es Fusarium graminearum (Schwabe) anamorfo de Gibberella zeae (Schw.) Petch. La enfermedad es el resultado de la acción individual o combinada de diferentes mecanismos de patogénesis, como la producción y liberación de enzimas extracelulares que degradan los principales constituyentes de la pared celular y permiten la colonización de los tejidos. Una vez establecida la infección se produce la liberación de micotoxinas que interfieren con el metabolismo o que afectan la integridad estructural de la célula hospedera o bien sus procesos fisiológicos, lo cual da como resultado pérdida en el rendimiento y calidad de las cosechas. La investigación se basó en el aislamiento e identificación de aislados de Fusarium spp. asociados con FET a partir de muestras de trigo provenientes de 15 localidades distribuidas en las provincias de Buenos Aires, Entre Ríos, Santa Fe y Córdoba durante las campañas trigueras 2006 y 2007. Se analizó la diversidad genética entre aislamientos de F. graminearum con marcadores moleculares ISSR y RFLP, así como la diversidad química y estructural mediante espectroscopía vibracional FT-IR. Determinada la distancia genética entre aislamientos, se analizó la agresividad de los mismos sobre trigo en invernáculo a partir del análisis de diversas variables patométricas. Además, se detectaron y caracterizaron actividades enzimáticas relacionadas con el proceso de colonización y daño sobre los granos, las cuales serían responsables de cambios estructurales y de composición de los mismos. Se seleccionó un aislamiento de F. graminearum con elevada actividad enzimática poligalacturonasa, como estimativo de agresividad, para evaluar resistencia a la penetración del patógeno en la espiga. La patogenicidad se evaluó sobre diversos genotipos de trigo a campo bajo condiciones de temperatura y humedad parcialmente controladas. Este tipo de evaluación permite identificar nuevas fuentes de resistencia.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

La tesis se enmarca en la Etnobotánica urbana y fue desarrollada en un contexto pluricultural urbano, focalizando sobre un grupo de plantas y productos denominados adaptógenos El término adaptógeno, se comienza a utilizar a mediados del siglo XX cuando un grupo de científicos encontraron que ciertas especies vegetales ayudaban al hombre a sentirse bien, a combatir el estrés sin tener un efecto posterior de decaimiento y permitirle adaptarse a las condiciones ambientales adversas. Los mismos se usan para tratar desórdenes psiquiátricos, neurosis y depresión. Los objetivos que nos hemos propuesto realizar son: 1. Relevar los productos de origen vegetal comercializados como adaptógenos, presentes en la zona de estudio. 2. Relevar el conocimiento vigente entre los consumidores acerca de los productos y las plantas que intervienen en su composición. 3. Identificar las plantas que entran en la composición de dichos productos a través de las técnicas botánicas clásicas de identificación, o a través de la búsqueda de caracteres anátomo-sistemáticos diagnósticos. 4. Caracterizar las especies encontradas mediante la búsqueda e identificación de caracteres morfológicos de diagnóstico. 5. Recopilar información sobre plantas tradicionalmente usadas por determinadas comunidades en distintas zonas de Argentina como recursos terapéuticos con fines similares a los de los productos comercializados y relevados según los puntos anteriores. 6. Analizar la posible correlación existente entre la acción terapéutica popularmente atribuida a las plantas objeto de estudio y las propiedades biológicas reconocidas según la información científica provista por la bibliografía. 7. Aportar, como derivación de este estudio, conocimiento que pueda ser aplicado al control de calidad y al uso racional de las plantas medicinales en nuestro. Para cumplir con ellos, se aplicó la metodología etnobotánica, a través de la aplicación de entrevistas abiertas, semiestructuradas y encuestas efectuadas a una población (N= 226) conformada por personas de ambos sexos y amplio rango de edad, y a informantes clave (N= 40), orientadas a relevar el conocimiento botánico de las especies que dicha población consume para “sentirse bien”. El área de muestreo abarcó el Área Metropolitana de Buenos Aires (AMBA), que incluye dos conglomerados urbanos contiguos, el Gran Buenos Aires y el Gran La Plata; y es la más grande en población de la Argentina. Entre los resultados encontrados se identificaron 11 especies consideradas adaptógenas; se analizaron 35 productos y 16 materiales de referencia; se relevaron 56 categorías entre plantas y productos que usan y también fue posible caracterizar el conocimiento botánico que tiene la población en estudio acerca de las plantas para “sentirse bien”. Las especies adaptogénicas estudiadas pertenecen a las familias Amaranthaceae, Araliaceae, Asteraceae (Compositae), Brassicaceae, Leguminosae (Fabaceae), Passifloraceae, Phytolaccaceae, Rubiaceae, Sapindaceae y Schisandraceae. Asimismo, se halló que entre los 35 productos analizados, los rótulos declaran especies vegetales que luego no se hallan presentes en el material analizado. También se identificaron nuevos caracteres diagnósticos que no habían sido descriptos anteriormente en la bibliografía consultada. Finalmente, se propone una nueva definición del concepto adaptógeno. Las conclusiones muestran que la gente elige variados productos naturales o hierbas medicinales. Entre esa extensa gama de productos, opta por aquellos para “sentirse bien”, ya sea por una costumbre familiar o por recibir la información proveniente de los medios de difusión, sin embargo desconoce el término adaptógeno.