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En conejos para carne, la mayoría de los planes de selección están enfocados a incrementar el tamaño de camada y de una manera indirecta, con baja presión, a la fertilidad, a través del descarte de hembras improductivas. El objetivo del presente trabajo fue: evaluar la respuesta a la selección por prolificidad en conejos para carne; conocer los cambios producidos en otras variables no seleccionadas; identificar las variables de mayor importancia en la productividad final, evaluada como kg producidos por unidad de tiempo y estimar las heredabilidades y correlaciones genéticas de los caracteres de aptitud y producción Se analizaron siete generaciones de selección que incluyeron 390 hembras con dos o más partos apareadas con 63 machos, para los siguientes caracteres: prolificidad, fertilidad, sobrevida. Se registraron los pesos al destete y a los 60 días de 3374 crías. Se estimaron los diferenciales de selección y respuestas, curvas de crecimiento, correlaciones genéticas, heredabilidades e indicadores de productividad. Los caracteres relacionados con prolificidad y sobrevida tuvieron un efecto mayor sobre la productividad que los relacionados con fertilidad y peso. Los diferenciales de selección fueron positivos, sin embargo, no se observaron respuestas a la selección ni aumentos en los promedios de caracteres correlacionados con fertilidad. Esta falta de respuesta a la selección no puede ser atribuida a un efecto contrario de la selección. Los bajos valores de heredabilidad indicarían que la variabilidad fenotípica podría deberse al efecto de componentes genéticas no aditivas, efectos ambientales o interacciones entre ambos que permitieran expresar fenotipos extremos y podría explicar en parte estos resultados. De lo expuesto surge que una estrategia de selección que se lleve a cabo sin el conocimiento previo de la relación entre los caracteres de producción y aptitud puede llevar a resultados neutros o no deseados aún después de varias generaciones sometidas a procesos selectivos.

Se evaluó la participación de Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli y Salmonella spp. en el desarrollo de infecciones clínicas y subclínicas en cerdos de la etapa de engorde. Se realizó un estudio retrospectivo histopatológico de casos de archivo en el que se relacionaron las lesiones histopatológicas con los agentes etiológicos identificados por IHQ, WS y PCR a partir de tejidos embebidos en parafina. Se detectó asociación estadística entre las lesiones histopatológicas, en particular la hiperplasia de los enterocitos inmaduros de la cripta, la necrosis profunda de la mucosa y la hiperplasia de las células caliciformes, y la detección de L. intracellularis, Salmonella spp. y Brachyspira spp., respectivamente. Lawsonia intracellularis resultó el agente más frecuentemente identificado en animales con y sin diarrea y su presentación subclínica fue muy frecuente a nivel individual, de lotes y de granjas. Se detectó B. hyodysenteriae en 2/8 granjas en cerdos con diarrea y su presencia se asoció con mal desempeño productivo, bajos niveles de bioseguridad y elevada mortalidad. Salmonella spp. se detectó en 5/8 granjas en animales con y sin diarrea. La detección de L. intracellularis y Salmonella aumentó con la edad de los cerdos, lo que implica una mayor chance de enteropatía proliferativa hemorrágica y mayor riesgo potencial de contaminación de la carne durante la faena, respectivamente. Se determinó que la presencia de L. intracellularis y B. hyodysenteriae impactan negativamente en la economía de las granjas, asociado a la pérdida de peso y al gasto en antibióticos. Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae, y Salmonella spp. son agentes frecuentes en la etapa de crecimiento y terminación, tanto en casos de archivos como en las granjas evaluadas, y tienen una participación relevante en el desarrollo de cuadros clínicos y subclínicos.

Desde que la Enfermedad de Aujeszky (EA) fue diagnosticada por primera vez en Argentina en 1978, fueron sucediéndose numerosos brotes en diferentes lugares del país. El objetivo de este trabajo fue comparar diferentes cepas del virus de la Pseudorrabia porcina. Para ello utilizamos 5 cepas argentinas (3 aisladas en nuestro laboratorio) y 4 de referencia internacional. Las mismas fueron caracterizadas mediante pruebas físico-químicas; sus proteínas comparadas por electroforesis en SDS-PAGE; los ADN caracterizados mediante el uso de 6 enzimas de restricción y su antigenicidad fue comparada al evaluar los 9 antisueros producidos en ratas mediante un sistema de virus neutralización cruzada. Las pruebas físico-químicas permitieron observar pequeñas diferencias de comportamiento de las cepas virales frente a diferentes variables tales como pH, calor, acción de la tripsina, éter y cloroformo, las que en ningún caso aportan datos concluyentes que permitan observar diferencias significativas. El estudio de la movilidad de las proteínas estructurales de los virus en geles de poliacñlamida tampoco arrojó datos de importancia y resultó insuficiente para distinguirlos. El uso de la virus neutralización cruzada para estudiar su antigenicidad, en cambio, mostró resultados que permitieron comprobar que las cepas argentinas produjeron títulos neutralizantes más elevados que las extranjeras. Los patrones de restricción del ADN de las 9 cepas permitieron diferenciar grupos genómicos y establecer relación entre ellos al utilizar la enzima fíamHI. Así, pudieron establecerse, de acuerdo a la clasificación de Herrmann, que 4 cepas argentinas pertenecen al tipo genómico I y solo una pertenece al tipo genómico II. Esta cepa (Mer) fue aislada de animales provenientes de los Países Bajos, donde predomina ese tipo genómico, no habiéndose encontrado nuevamente en el país. Los patrones de restricción del ADN, por lo tanto, brindaron el mejor método para caracterizar cepas de EA.

Adelantar los servicios de las vaquillonas, implementando sistemas de entore a 15 meses de edad es una forma de mejorar la productividad de los rodeos de cría. Para lograr un planteo exitoso es necesario que las vaquillonas hayan alcanzado la pubertad antes de iniciar la temporada de servicios donde la genética y la alimentación juegan un papel central. En este trabajo se evaluó el impacto de una recría pastoril en el crecimiento de las vaquillonas y en la proporción de vaquillonas ciclando al momento del servicio. Se encontraron diferencias en la forma de las curvas de crecimiento, con diferencias en las pendientes de las curvas hasta los 289 días de edad y una menor proporción de vaquillonas ciclando, en hembras alimentadas en un sistema de pastoreo controlado con un aumento diario de peso de 0,58 kg/d comparada con una recría ad-libitum. La diferencia en el número de vaquillonas ciclando podría originarse en restricciones puntuales de la alimentación durante la recría. En otro ensayo se encontró, mediante el uso de modelos de supervivencia, un mayor riesgo de pubertad asociado al genotipo TT del marcador IGF-SnaBI, si bien el efecto más importante como factor de riesgo asociado a la pubertad resultó el peso. Por último, se determinó la correlación genética entre la precocidad sexual en hembras, medida a través de la edad al primer parto (EPP) y fecha de primer parto (FPP), con la circunferencia escrotal (CE) medida a diferentes edades en un rodeo comercial. La correlación genética entre EPP y CE resultó mayor a edades de medición más temprana, constituyendo un carácter para seleccionar a los machos y mejorar la precocidad sexual en las hembras. Por otra parte, EPP permitiría a través de una mayor heredabilidad un progreso genético más rápido respecto a FPP.

Los toritos de 12-15 meses en sistemas de cría bajo condiciones extensivas, son tan eficientes como los toros de 2 años, su desempeño exitoso en la primera temporada de apareamientos depende de la calidad y cantidad del semen. Existe variabilidad para la edad de inicio de la pubertad, entre y dentro de razas. Sería importante incluir en programas de selección genética a la precocidad sexual, mediante mediciones fenotípicas, evaluaciones genéticas y marcadores genéticos. Estos últimos permitirían detectar tempranamente aquellos animales sexualmente precoces y además mejorar las evaluaciones genéticas cuantitativas tradicionales. Se establecieron los siguientes objetivos de trabajo: 1) Describir la variable fenotípica pubertad en machos bovinos en las condiciones de los sistemas pastoriles en la Argentina. 2) Estudiar la asociación entre marcadores genéticos y caracteres fenotípicos relacionados con la precocidad sexual en el macho bovino. Las definiciones de pubertad consideradas en este estudio fueron: a) Cuando el eyaculado de los toritos presenta una concentración de 50 x 106 de espermatozoides por mililitro y 10% de motilidad lineal (Wolf y col., 1965); b) Momento en el cual el perímetro escrotal ha alcanzado los 27,9 ± 0,2 cm, independientemente de la raza y el peso vivo (Lunstra y col., 1978). Se emplearon para un análisis retrospectivo los registros históricos de las evaluaciones anuales de precocidad sexual de 1269 toritos Angus de una cabaña. Con un segundo grupo de 286 toritos Angus, se realizaron las determinaciones experimentales para describir el aspecto fenotípico de la pubertad en sistemas de producción característicos de la Argentina y realizar los estudios de asociación con los marcadores genéticos Se analizaron: a) Las diferencias para edad, peso vivo y perímetro escrotal estimadas al momento de la pubertad; b) las correlaciones entre edad a la pubertad, edad de la madre, peso a los 300 días y perímetro escrotal a la pubertad; c) las correlaciones entre edad a la pubertad, peso al destete y perímetro escrotal al destete y d) las diferencias en el cálculo de las edades a la pubertad establecidas acorde a las definiciones consideradas. Para los estudios de asociación entre marcadores genéticos y caracteres de pubertad sexual, se seleccionaron 4 polimorfismos de nucleótido simple o SNPs, localizados en 3 genes candidatos: dos SNPs en GNRHR, uno en LHR y uno en IGF1. Para su genotipificación se utilizó la tecnología de pirosecuenciación. La asociación entre variables fenotípicas y genotipos fue determinada mediante un modelo lineal mixto. Como resultado del presente trabajo de tesis se arribó a las siguientes conclusiones: La concentración espermática no sería la principal variable limitante segun la definición propuesta por Wolf y col. (1965), mientras que la motilidad espermática parecería ser la variable critica. Existe variabilidad entre la progenie de las distintas líneas genéticas respecto a edad y perímetro escrotal al inicio de la pubertad, lo que permite seleccionar genéticamente por precocidad sexual. El perímetro escrotal al destete podría usarse para seleccionar por precocidad sexual debido a la existencia de una correlación fenotípica negativa edad de pubertad. El perimetro escrotal podría usarse como un buen predictor de la pubertad en toritos recriados en sistemas pastoriles. El SNP IGF1SnaBI estuvo significativamente asociado con edad a la pubertad determinada a partir de los 28 cm de perímetro escrotal.

La Queratitis Superficial Crónica (QSC) es una enfermedad inflamatoria corneal que puede conducir a la ceguera del animal si no es tratada. La QSC se presenta con mayor frecuencia en el perro Ovejero Alemán (OA). Mientras que la córnea normal tiene una baja expresión de MHC de clase II, en la QSC se produce la sobreexpresión de estas moléculas, asociado con la secreción de interferón gamma por los linfocitos T CD4+ del infiltrado inflamatorio. Numerosas evidencias apoyan la hipótesis de que QSC es una enfermedad inmuno-mediada. Debido a esto, para investigar los factores genéticos moleculares que pueden estar asociados con el desarrollo de QSC se tipificaron 73 perros (43 animales enfermos y 30 animales control) para los siguiente marcadores genéticos: 3 microsatélites (FH2202, FH2054 y FH2975) ligados a la región de clase II del DLA (Dog Leukocyte Antigen o Antígeno Leucocitario Canino), las regiones reguladores proximales (URR) y las regiones presentadoras de antígenos (exón 2) de los genes DLA de clase II DLA-DRB1, DLA-DQA1 y DLA-DQB1. Se observó asociación significativa en los tres tipos de marcadores. En cuanto a los microsatélites, los alelos FH2054*172 (valor de p = 0,02) y FH2975*320 (valor de p = 0,005) se asociaron a un mayor riesgo al desarrollo de QSC. En cuanto a las regiones reguladoras, el haplotipo URR-DQB*TATC se asoció significativamente con la QSC (p = 0,006), evidenciando una aumento de 3 veces el riesgo de desarrollar esta enfermedad (OR = 2,87, 95 %, IC = 1,43- 81). El haplotipo de exones 2 DRB1*00101/DQA1*00101/ DQB1*00201 se asoció con un menor riesgo a desarrollar QSC (p = 0,02) (OR = 0,2, 95%, IC = 0.07- 0,81). Aunque, el haplotipo conformado por el promotor y el exón 2 de DLA-DQB1/URR-DQB*TATC/*01302 se asoció significativamente con la QSC (p = 0,003), aumentando casi 5 veces el riesgo a desarrollar la enfermedad (OR = 4,56, 95% IC = 1,74- 16,53). Este trabajo confirma el rol de MHC de clase II en el desarrollo de la QSC y proporciona nuevos datos sobre la población local de OA. Esta asociación genética también es compatible con los estudios clínicos, histológicos y farmacológicos reportados, que indican que la QSC es una enfermedad inmunomediada. Potencialmente estos marcadores podrían ser utilizados para identificar animales susceptibles y para dirigir los cruzamientos en los criaderos.

El objetivo propuesto en la presente tesis se realizará en un primer momento el estudio de la cadena productiva porcina que permitirá generar información sobre la dinámica del comportamiento e interacción de los distintos actores constitutivos del sector, así como sus estrategias y formas de coordinación e funcionamiento. En un segundo momento se procederá a la realización del análisis FODA se propenderá a la determinación de las Fortalezas (atributos del sector que son útiles para promover su desarrollo), Debilidades (Atributos que son impedimentos a la evolución del sector), Oportunidades (Condiciones externas que son útiles para lograr el desarrollo) y Amenazas (Condiciones externas que son perjudiciales para el desarrollo del área) que cuenta el sector productivo porcino bonaerense. A tal fin se recopilará información, con los instrumentos indicados previamente, a fin de establecer las fortalezas, debilidades, oportunidades y amenazas existentes en el sector productivo porcino en la actualidad. Para ello se indagara a actores productivos, comerciales, industriales, institucionales y académicos, tomando como centro de investigación los aspectos de manejo productivo (sanidad, genética, alimentación, tecnología), comerciales (sistemas de venta, fijación de precios, canales de comercialización, condiciones de venta, aspectos formales y legales), industriales (infraestructura frigorífica existente y condiciones de acceso a la misma, características de la industria procesadora de productos que empleen la carne de cerdo como materia prima) e institucionales (tipo de instituciones involucradas con el sector, formas de concebir el sistema productivo-comercial, propuestas de intervención y sus lógicas subyacentes). En última instancia al desarrollo de la presente tesina se analizará las políticas públicas existentes, analizando objetivos perseguidos y resultados obtenidos de su aplicación, aspectos negativos y positivos de las mismos, las lógicas que dieron origen a las mismas

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un microorganismo que coloniza el tracto intestinal de los animales y causa en el hombre diarreas y graves enfermedades, entre ellas, el síndrome urémico hemolítico (SUH). El SUH es una afección severa que afecta con mayor frecuencia a niños menores de 5 años. En niños y adolescentes representa una de las principales causas de insuficiencia renal aguda y crónica, y es el responsable de una importante proporción de los trasplantes de riñón. Es una enfermedad para la cual no existe tratamiento específico y, en los casos más graves, puede derivar en la muerte del paciente. Argentina presenta la mayor incidencia de SUH a nivel mundial. El ganado bovino es reconocido como el principal reservorio de STEC, y el consumo de alimentos derivados contaminados, como la principal vía de transmisión a humanos. El contacto directo con animales portadores, y su entorno, y el contacto persona a persona son otras fuentes importantes de contagio. Varios factores de virulencia han sido descriptos para estas bacterias, pero no se conocen cuáles son las características que definen con certeza a una cepa STEC con capacidad de producir enfermedad grave. El mecanismo de patogenicidad común a todas y que juega un papel esencial en el desarrollo de SUH, es la producción de toxina Shiga (Stx). Diversos subtipos de Stx han sido descriptos y asociados a distintos riesgos de desarrollar enfermedades. El subtipo Stx2a es el mayormente asociado a SUH. Dentro del genoma bacteriano, los genes stx se encuentran codificados en bacteriófagos temperados, denominados fagos Stx. Estos fagos, que muestran una gran diversidad, desempeñan un rol fundamental en la patogénesis de STEC: influyen en la expresión de stx, y durante la lisis bacteriana, producto de la inducción de los profagos, se produce la liberación de estas toxinas. Estos fagos también desarrollan un importante papel en la propagación y transferencia de genes de virulencia y, como consecuencia, en la formación de cepas patógenas emergentes. Se han identificado más de 400 serotipos de STEC y alrededor de 100 han sido asociados a enfermedad en humanos. En la mayoría de las infecciones el serotipo involucrado es O157:H7. Sin embargo, en la actualidad existen a nivel mundial muchos casos de enfermedad causados por cepas de otros serotipos. El objetivo general de esta tesis fue caracterizar los fagos codificantes de stx2a presentes en cepas STEC de distintos serotipos aisladas en Argentina. Para ello se propuso resubtipificar las cepas, caracterizar regiones involucradas en la regulación del ciclo lítico de los fagos, cuantificar los niveles de expresión y de inducción de profagos Stx2a y comparar los resultados obtenidos de acuerdo a distintas particularidades de los fagos y de las cepas portadoras. También se evaluó el comportamiento de un mismo fago en diferentes entornos bacterianos. En cuanto a la resubtipificación, todas las cepas previamente caracterizadas como portadoras del subtipo vt2EDL933 fueron positivas para stx2a. Las cepas que además portaban el/los subtipo/s vt2vha y/o vt2vhb se resubtipificaron como positivas para stx2c y las cepas que presentaban el subtipo vt1EDL933, fueron positivas para stx1a. En la mayoría de las cepas se confirmó la proximidad del gen ninG a stx2 y la presencia del alelo q933, solo o en combinación con el alelo q21. De las cepas negativas para ninG, una fue positiva para el alelo qO111 y el resto negativas para los 3 alelos de q estudiados. En general, las cepas que presentaron el alelo q933 portaban el subtipo stx2a y las positivas para los alelos q933 y q21, portaban stx2a y stx2c. Si bien esta asociación entre subtipos de stx y alelos de q ya ha sido observada en otros trabajos, no es una asociación exclusiva. En cuanto al alelo qO111, se encontró en una cepa genotipo stx1a/stx2a. Los niveles de expresión de stx2a detectados entre las cepas fueron heterogéneos, tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros grupos de trabajo. Sólo en una de las cepas O145:H- de origen humano no se detectó expresión en ninguna de las condiciones. En la mayoría de las cepas tratadas con mitomicina C la expresión de stx2a fue mayor respecto a la expresión basal, con la excepción de una cepa O91:H21 y la O113:H21, ambas aisladas de alimentos, que mostraron una expresión similar en ambas condiciones. Mediante el método de la capa doble de agar se detectó producción de partículas infectivas de fagos en la mayoría de las cepas analizadas. Los títulos de fagos con mitomicina C aumentaron en un rango de entre 1 y 3 órdenes de magnitud con respecto a los títulos fagos inducidos de manera espontánea Algunos fagos produjeron placas de lisis turbias, difíciles de ver y poco definidas. En una cepa O26:H11 y en dos O157:H7, se evidenciaron por hibridación placas de lisis no detectadas visualmente. Por qPCR, los niveles de inducción de fagos Stx2a fueron variables y se encontraban dentro de los órdenes de magnitud reportados por otros investigadores. El aumento en la producción de fagos Stx2a con mitomicina C también se evidenció en la mayoría de las cepas, en un rango de 1 a 2,5 logs. Las excepciones fueron una cepa O91:H21 de bovino, que produjo similares cantidades fagos en ambos estados, y dos cepas que no produjeron partículas detectables de fagos Stx2a: otra cepa O91:H21 y la O145:H- que tampoco presentó expresión de stx2a. En cuanto a la comparación de los resultados teniendo en cuenta diferentes variables, se observaron: a) mayor expresión basal de stx2a en las cepas O157:H7 que en las O26:H11, pero en respuesta a mitomicina C, mayor incremento en las cepas O26:H11 que en las O145:H- y O157:H7; b) mayor incremento de la expresión de stx2a con mitomicina C en las cepas aisladas de bovino que en las aisladas de humanos; c) niveles basales de expresión de stx2a inferiores en las cepas positivas para q933 que en las positivas para q933 y q21, y en las cepas ninG negativas con respecto a las ninG positivas; d) un mayor aumento en la producción de fagos con mitomicina C en las cepas que portaban sólo el subtipo stx2a con respecto a las que portaban tanto stx2a como stx2c. Por otra parte, se observó una correlación positiva moderada entre los niveles de expresión basales e inducidos. Dado que en la bibliografía no se ha observado una única tendencia en la asociación entre los niveles de expresión de stx2a y de producción de fagos con las distintas características de las cepas, los resultados obtenidos son, en algunos casos, similares a los reportados por otros investigadores. Tanto en condiciones basales como inducidas con mitomicina C, en los lisógenos generados se detectó expresión de stx2a, placas de lisis y producción de Stx. Comparado con los resultados obtenidos en cada ensayo con la cepa wild type correspondiente, los niveles de expresión estuvieron dentro del mismo orden, la producción de fagos de los lisógenos fue mayor y la cantidad de Stx presente en sus sobrenadantes fue igual o ligeramente menor. En resumen, se encontró que la mayoría de las cepas, independientemente del serotipo y el origen, portaron fagos Stx2a inducibles, mostraron expresión basal de stx2a y aumento en la expresión e inducción de profagos por efecto del agregado de mitomicina C. Además, los lisógenos obtenidos se comportaron de manera similar a las cepas wild type. Estos resultados sugieren que los fagos estudiados aportan características asociadas a una alta virulencia a las cepas que los portan, las cuales, en consecuencia y sin importar su serotipo, representan un potencial riesgo para la salud humana. Las características observadas de los fagos Stx2a presentes en las cepas circulantes en nuestra región, aisladas tanto de bovinos como de humanos, podrían contribuir a la alta incidencia de enfermedad observada.

El Gammaherpesvirus bovino 4 (BoHV-4) es un miembro del género Rhadinovirus, de la subfamilia Gammaherpesvirinae, dentro de la familia Herpesviridae. Al igual que los demás agentes virales de esta subfamilia, se caracteriza por su capacidad linfotrópica, pudiendo establecer latencia en linfocitos y monocitos, además de infecciones citolíticas en células epiteliales y o fibroblásticas. El BoHV-4 posee genes homólogos a los celulares, como el gen de la 2β-1,6-N-acetilglucosaminiltransferasa, con un 81.1% de similitud con la enzima producida por células de humano. Esta enzima tiene un rol crucial en la síntesis de glucanos. Asimismo, codifica una proteína esencial para el establecimiento de latencia, las proteínas v-Bcl2 y v-Flip (productos asociados a procesos de muerte celular), y la glucoproteína gp180 que tiene un rol importante en la provisión de un escudo de O-glucanos que enmascararía los epitopes en las glucoproteínas virales, contribuyendo a la evasión de los anticuerpos neutralizantes. En contraste con la mayoría de los gammaherpesvirus, el BoHV-4 presenta la capacidad de replicar en un amplio rango de especies domésticas y silvestres, así como en una gran variedad de cultivos celulares, incluyendo líneas celulares de humanos. Además, puede producir distintos tipos de síndromes, y si bien se lo asocia con enfermedad uterina posparto en bovinos, aún no se ha podido esclarecer el rol que desempeña en esta patología. El primer aislamiento del BoHV-4 fue realizado por Bartha en Hungría, en 1963; posteriormente fue aislado en Estados Unidos. Desde entonces, más de 40 cepas diferentes han sido aisladas en todo el mundo. A partir de estas cepas se establecieron tres grandes grupos basados en su análisis genómico: el tipo Movar 33/63, que comprende las cepas europeas; el tipo DN599, conformado por las cepas americanas, y un tercer grupo que incluye cepas de búfalo africano. La capacidad del BoHV-4 de presentar variaciones genómicas ha sido demostrada en estudios genéticos de cepas de referencia. Esta variabilidad sería el resultado de eventos de recombinación entre cepas y dentro de una misma cepa. En Argentina, el BoHV-4 fue aislado y caracterizado molecularmente por Verna et al. en el año 2007 a partir de muestras de vacas abortadas. El estudio de filogenia de las cepas locales aisladas demostró un importante grado de variabilidad genómica entre las cepas circulantes, revelando la existencia de tres grupos diferentes, designados como genotipos 1, 2 y 3. Las cepas de los genotipos 1 y 2 presentaron mayor similitud con los tipos europeo y americano, respectivamente; las del genotipo 3 constituyen un nuevo grupo filogenético. Actualmente hay más de 50 aislamientos de BoHV-4 en nuestro país; el 85 % de estos se obtuvieron de muestras de mucus cérvico-vaginal de vacas que presentaron abortos. Sobre la base de la información que aporta la bibliografía internacional y los antecedentes locales se puede inferir que existen amplias diferencias en las propiedades biológicas y en el potencial patogénico del BoHV-4. Las variadas manifestaciones clínicas asociadas a las infecciones por el BoHV-4 y la heterogeneidad en los patrones de restricción del genoma viral, sugieren que las variantes genómicas podrían asociarse a variaciones en la actividad biológica de este virus. Por lo mencionado precedentemente, considerando la importancia de la presencia del BoHV-4 en Argentina en función a su relación con pérdidas reproductivas y potencialidad de este virus para infectar células humanas, el objetivo de este trabajo de tesis fue realizar un estudio de cepas virales filogenéticamente diferentes, aisladas en nuestro país, a los efectos de conocer si la diferencias genéticas están asociadas a características biológicas particulares. Para cumplir con los objetivos propuestos se desarrollaron experimentos in vitro para estudiar la actividad biológica de seis cepas argentinas pertenecientes a los tres grupos genéticos mencionados, sobre líneas celulares de diferente origen. Se analizaron la cinética de replicación viral, la manifestación de efecto citopático, la capacidad lítica, la producción de placas de infección y la capacidad de infección de células de origen humano. Luego se estudiaron los efectos de las diferentes cepas sobre su capacidad de inducir apoptosis, para lo cual se procedió a identificar cambios nucleares compatibles con esta, detectar la fragmentación del ADN y detección y análisis de los genes v-Flip y v-Bcl2. Para complementar estos estudios se realizó un experimento in vivo, mediante la infección experimental de bovinos, con el objetivo de realizar un estudio descriptivo de la distribución tisular de las cepas locales del BoHV-4 genéticamente diferentes. El estudio de cinética de replicación se realizó con las seis cepas de BoHV-4 pertenecientes a los tres grupos genéticos en las líneas celulares de origen humano (HeLa y Hep2), la línea de origen bovino MDBK y la línea Vero de riñón de mono. La cepa (08/330), correspondiente al genotipo 2, alcanzó títulos de 5 a 9 logaritmos, significativamente más altos (p < 0.05) que el resto de las cepas. La cinética de replicación de las cinco cepas restante presentó mayor variabilidad en los cultivos de HeLa y Hep2 en comparación con las líneas celulares MDBK y Vero, con títulos que variaron de 2 a 4.5 logaritmos. La cepa 12/365 (genotipo 2), no manifestó actividad viral en la fracción extracelular a las 24 horas posinfección (hpi) en ninguno de los cultivos celulares, además esta cepa mostró mayor variabilidad en la cinética en las cuatro líneas celulares. Este ensayo permitió, además, comprobar que las líneas de origen humano y de mono son susceptibles y permisivas a la infección por estas cepas locales de BoHV-4. En los distintos ensayos, para confirmar la presencia del genoma viral se modificó y optimizó una nested PCR, descripta por Fábián y Egyed (2004), para amplificar un fragmento de 271 pares de bases (pb) del ORF25, el cual codifica la proteína mayor de la cápside. La mayoría de las cepas produjo efecto citopático entre las 24 y 48 hpi en células MDBK y Hep2. En las líneas celulares HeLa y Vero, la producción de efecto se evidenció más tardíamente (72 hpi). La presentación del efecto citopático fue variable entre las cepas y entre los cultivos celulares. En el ensayo de placa de lisis, se observó una amplia variabilidad en los tamaños de las placas, principalmente entre las líneas celulares. Las cepas 09/227, 08/263 y 07/435 produjeron placas de tamaño medio (1 a 3 mm) en células MDBK, el tamaño de estas placas fue significativamente mayor (p < 0.05) con respecto a las placas producidas por las cepas 08/330 y 12/365. Por el contrario, en las células HeLa, estas cepas produjeron placas significativamente mayores (p < 0.05) que las cuatro cepas restantes. En las células Hep2 y Vero, todas las cepas produjeron placas mínimas (< 1mm). No se produjeron placas grandes (> 3mm) en ninguno de los tipos de células. Como resultado de la inmunofluorescencia directa utilizada en el ensayo de placas de infección, se observó una marcada disparidad entre las distintas cepas para ser reconocidas por los anticuerpos disponibles. Posiblemente, el uso de reactivos elaborados con anticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos de cepas foráneas no resultan de utilidad para la identificación efectiva de aislamientos locales. En el estudio de los efectos de las cepas de BoHV-4 sobre la inducción de apoptosis se identificaron cambios nucleares indicativos de apoptosis mediante tinción con DAPI. El mayor número de células con cambios nucleares, representado como índice relativo de apoptosis (IRA) y la mayor variabilidad entre cepas se registraron en la línea celular MDBK. En los cultivos de células Hep2 y HeLa no se evidenciaron variaciones significativas (p > 0.05) entre las cepas, al igual que en la línea Vero, en la cual se registró el IRA más bajo. Para evaluar si las cepas de BoHV-4 analizadas inducen la fragmentación del ADN se utilizaron las técnicas de electroforesis en gel de agarosa y TUNEL sobre las líneas celulares MDBK y HeLa. Solamente en las células HeLa se observó fragmentación del ADN, a las 24 hpi, en las células inoculadas con las cepas 09/508 y 08/330. Utilizando la técnica de TUNEL, los IRAs más elevados se registraron, en las células MDBK a las 24 hpi, aunque sin detectarse diferencias entre el control positivo y las seis cepas de BoHV-4 (p > 0.05). A las 48 hpi solamente las cepas 08/263 y 09/227 mostraron IRAs significativamente más elevados (p < 0.05) que ambos controles. En las células HeLa, sólo la cepa 12/365 evidenció un IRA significativamente mayor (p < 0.05) que los controles a las 48 hpi. También se analizaron los genes v-Flip y v-Bcl2 en los seis aislamientos. En las cepas 08/263 y 08/330, correspondientes al genotipo 2, no fue posible amplificar la secuencia de ninguno de estos genes. Las variaciones halladas en las cuatro cepas restantes, ocasionadas por sustituciones nucleotídicas en ambos genes, se tradujeron en cambios en las respectivas proteínas y en mayor grado en la proteína v-Flip, por lo que se podría inferir que la actividad de esta proteína presentaría variaciones dependiendo de la cepa. Si bien sólo se utilizaron cuatro cultivos celulares de distinto origen, la evaluación general de los resultados revela que las cepas de BoHV-4 analizadas no inducen elevados niveles de apoptosis. Por último, se realizó un estudio in vivo en un modelo bovino para analizar la distribución tisular, presencia, tipo y severidad de lesiones y respuesta inmune humoral. Se seleccionaron tres cepas de BoHV-4 de diferente genotipo. Se utilizaron 4 terneros de 6 meses de edad, inoculados por vía intranasal mediante aerosolización, de la siguiente manera: ternero 1 (T1) cepa 09/508 (genotipo 1), ternero 2 (T2) cepa 08/330 (genotipo 2), ternero 3 (T3) cepa 07/435 (genotipo 3) y ternero 4 (T4) control inoculado con medio de cultivo como placebo. Se extrajeron muestras de secreciones nasales, oculares y sangre con y sin anticoagulante a los 0, 7, 14 y 21 días posinfección (dpi) para la detección de genoma viral, aislamiento viral y para la búsqueda y determinación de los títulos de anticuerpos neutralizantes. La eutanasia de los animales se realizó a los 21 dpi y se extrajeron muestras de diferentes tejidos para aislamiento viral, detección de genoma viral e histopatología. No se observaron signos clínicos en ninguno de los animales. El ADN viral se detectó en leucocitos de sangre periférica (LSP) del T1 a los 21 dpi y del T2 a los 14 y 21 dpi. En las muestras de tejidos, se detectó el genoma viral en bazo, médula, ganglio trigeminal, tráquea y lóbulo piriforme del T1 (cepa 09/508); bazo, tráquea, riñón, linfonódulo retrofaríngeo y lóbulo frontal del T2 (cepa 08/330), y linfonódulo pulmonar, lóbulos frontal y piriforme del T3 (cepa 07/435). Las muestras de secreciones, tejidos y LSP del ternero control (T4) resultaron negativas. La cepa 08/330 se aisló en las secreciones oculares y nasales del T2 a los 7 dpi y la cepa 07/435 de secreciones nasales del T3. A los 14 dpi se aislaron las cepas 09/508 (genotipo 1), 08/330 (genotipo 2) y 07/435 (genotipo 3) en las secreciones nasales de T1, T2 y T3, respectivamente. Todos los aislamientos se identificaron por nested PCR. Ninguna de las cepas se aisló de los tejidos y LSP de los tres animales inoculados, y las muestras del ternero control también resultaron negativas. Durante la necropsia no se observaron lesiones macroscópicas en ninguno de los animales. Microscópicamente se observó una leve respuesta inflamatoria con infiltrado mononuclear en tejidos respiratorios y linfáticos del T1 (cepa 09/508) y T3 (cepa 07/435). En el tejido nervioso de estos animales se observó gliosis leve, neuronas colapsadas con núcleos picnóticos, citoplasma eosinofílico y cromatolisis, hipercromatosis neuronal y satelitosis leve. No se hallaron lesiones histológicas en las muestras de T2 (cepa 08/330) y T4 (control). En los sueros de los cuatro animales se observó actividad neutralizante para la cepa 08/330, al igual que para la cepa 07/435 en los T1, T2 y T3. Solamente se detectó seroconversión en T1, a los 21 dpi, cuando los sueros se enfrentaron con la cepa homóloga (09/508). Cuando se analizaron los sueros con las tres cepas no utilizadas en el ensayo in vivo (08/263, 12/365 [genotipo 2] y 09/227 [genotipo 3]) sólo se evidenció efecto neutralizante para la cepa 08/263 en T1, T3 y T4, en bajos títulos. Los hallazgos de este estudio sugieren que, aunque leves, hay diferencias en la actividad biológica de las cepas utilizadas en este trabajo, además de comprobarse que estos aislamientos locales de BoHV-4 pueden infectar células de origen humano. No obstante, a pesar de las diferencias observadas en la actividad de estas cepas de BoHV-4 in vitro, no fue posible establecer una asociación entre los grupos filogenéticos y los patrones de comportamiento biológico de cada cepa en los experimentos in vitro y en el modelo experimental in vivo.

La arteritis viral equina es una enfermedad viral muy importante económicamente en la industria equina cuya prevalencia continúa en aumento, posiblemente debido a la intensificación del transporte de caballos y semen congelado. Es una de las principales causas de aborto, neumoenteritis fulminante en recién nacidos y enfermedad respiratoria alrededor del mundo, donde el macho infectado puede convertirse en portador y transmisor del virus durante el servicio. El virus pertenece a la familia Arteriviridae, es envuelto, posee ARN de simple cadena y contiene numerosas proteínas. Las principales proteínas virales, en cuanto a su abundancia y antigenicidad, son la N (de la nucleocápside) y las proteínas gP5 y M (de membrana). El proceso de apoptosis se encuentra estrictamente controlado a nivel genético y diversos factores pueden alterar el proceso de manera de inducir o inhibir esta respuesta celular. Si bien hay estudios que muestran que este virus induce apoptosis en cultivos celulares identificando distintas enzimas participantes, no se conoce cuál o cuáles proteínas virales estarían involucradas en este proceso. El objetivo general de este trabajo es estudiar la inducción de la apoptosis en cultivos celulares tras la infección con el virus. Se estudiaron diferentes mecanismos moleculares implicados en este proceso mediante el empleo de distintas cepas virales de variada patogenicidad a través de la expresión diferencial de proteínas virales en cultivos. Como primer paso se utilizó el virión completo de las tres cepas virales seleccionadas (Bucyrus, LP-01 y GLD-LP-ARG) y se infectaron 3 líneas celulares (RK-13, Vero y BHK-21), incluyendo controles positivos y negativos. Luego se realizaron construcciones en pCDNA3.1(+) para cada uno de los genes correspondientes a las proteínas M, N y gP5 del VAE y se transfectaron cultivos celulares. Además se evaluó la vía del retículo, representada por la caspasa -12, utilizando distintos inhibidores en células RK-13. Se utilizaron tanto métodos cualitativos como cuantitativos. Nuestros resultados indican que la magnitud de apoptosis observada en los cultivos celulares infectados está directamente relacionada con la patogenicidad y la MOI de la cepa viral del VAE y el tiempo posinoculación. Se observó además que todas las construcciones recombinantes inducen un grado variable de apoptosis, siempre menor a la observada con el virión completo pero mayor respecto a los cultivos que expresan el vector vacío. Además, mediante la utilización de staurosporina, reconocido inductor de apoptosis, observamos un efecto antiapoptótico en las construcciones portadoras de la proteína M, mientras que, por el contrario, se observó un efecto sinérgico en aquellas que contenían los genes de las proteínas gP5 y N del VAE. Por último evidenciamos que la vía del retículo, representada por la caspasa 12, es una de las principales rutas apoptóticas activadas por el VAE. La participación en la muerte celular de los distintos genes virales evaluados, abre nuevos interrogantes que estarían destinados a comprender en mayor profundidad la patogenia de enfermedad, con la esperanza de potenciar y perfeccionar las herramientas de prevención, diagnósticas y terapéuticas disponibles actualmente, mediante la puesta a punto de otras herramientas de detección de la actividad viral en la célula huésped.