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El cáncer de próstata (PCa) es la segunda causa de muerte por esta enfermedad entre los hombres occidentales. Los andrógenos y el receptor de andrógenos (AR) son críticos para el desarrollo del PCa. El AR recluta varios co-activadores/co-represores y factores de transcripción modificando la expresión de genes blanco. Se han identificado varios mecanismos que activan al AR entre ellos la vía de señalización de STAT3. Trabajos previos de nuestro laboratorio demostraron la expresión nuclear de HO-1 en carcinomas primarios de próstata. In vitro la inducción de HO-1 disminuyó la proliferación, la invasión y la migración celular y retardó el crecimiento tumoral y la angiogénesis in vivo. Nuestra hipótesis es que HO-1 podría actuar como un co-regulador de receptores nucleares o bien modificar el microambiente tumoral modulando la expresión de factores que actuarían como coreguladores. En este trabajo de tesis nos propusimos investigar si HO-1 afecta la actividad transcripcional del AR a través del eje STAT3. Demostramos que la inducción de HO-1 en las células de PCa reprime la activación del AR, disminuyendo la actividad del promotor y los niveles del ARNm del antígeno prostático específico (PSA). Comprobamos que la sobreexpresión de HO-1 induce arresto del ciclo celular en G2/M. Mediante inmunoprecipitación de la cromatina determinamos que HO-1 se asocia a promotores génicos, revelando una nueva función nuclear para esta proteína. Mediante ensayos de co-inmunoprecipitación mostramos que HO-1 y STAT3 interaccionan directamente. Por medio de microscopía confocal demostramos que HO-1 provoca la retención citoplasmática de STAT3. El tratamiento con hemina (inductor específico de HO-1) impidió la inducción de la expresión de los genes targets de STAT3, coincidente con la disminución de los niveles de pSTAT3 en el núcleo. Estudios in vivo confirmaron la reducción de la localización nuclear de STAT3 en los xenotransplantes de células PC3 que sobre-expresan HO-1. Adicionalmente, NFκB, un factor relevante en la inflamación y que forma complejos con STAT3, también queda inactivo retenido en el citoplasma cuando se induce HO-1. Estos resultados proveen una función nueva para HO-1 reprimiendo la actividad transcripcional del AR en PCa e interfiriendo con la señalización de STAT3. Estos hallazgos sustentan nuestra proposición acerca del nuevo rol que posee HO-1, más allá de su actividad catalítica.

La aquaporina-8 (AQP8) es un canal transmembrana multifuncional que facilita el pasaje del peróxido de hidrógeno y amoníaco, además de agua. AQP8, como una proteína de 28 kDa no glicosilada, se expresa en la membrana interna mitocondrial de los hepatocitos y algunas otras células. La AQP8 mitocondrial (mtAQP8) del hepatocito puede funcionar como una peroxiporina facilitando la liberación mitocondrial de peróxido de hidrógeno (H2O2). En hepatocitos, el colesterol puede activar o reprimir genes implicados en su vía biosintética a través de la unión a elementos regulados por esteroles (SRE) de factores nucleares SREBPs. Los SREBPs interactúan con las regiones promotoras SRE de genes que codifican las enzimas colesterogénicas, por ejemplo, la enzima clave 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMGCR). AQP8 ha sido identificado, por análisis de microarrays, como un gen putativo de respuesta a colesterol siendo posiblemente blanco de los factores nucleares SREBP en hígado de ratón. Además, el análisis del promotor del gen de AQP8 indica que también posee elementos de respuesta a los factores nucleares SREBP. Por otra parte, se ha reportado que el H2O2 estimula la síntesis de colesterol mediada por SREBPs en las células hepáticas, así nuestra hipótesis es que mtAQP8, a través de su rol facilitador de la liberación del H2O2 mitocondrial (mtH2O2), juega un papel en la regulación de la biosíntesis de colesterol del hepatocito mediada por SREBP. Inicialmente estudiamos el efecto de alteraciones en el contenido de colesterol sobre la expresión de mtAQP8 en células humanas derivadas de hepatocitos. Células Huh7 fueron cargadas con colesterol utilizando el complejo metil-β-ciclodextrina (mβCD):colesterol, y depletadas de colesterol con mβCD en ausencia de lipoproteínas. El incremento del colesterol celular inhibió la activación proteolítica del SREBP-2, y como consecuencia de ello, se redujo significativamente la expresión, a nivel ARNm y proteína, de la enzima HMGCR. En estas condiciones, la expresión de mtAQP8, tanto del ARNm como de la proteína, disminuyó significativamente. La disminución a nivel proteico en la expresión de mtAQP8 fue también observada mediante microscopía confocal. Por el contrario, una reducción en el colesterol celular activó la proteólisis del SREBP-2, y aumentó la expresión (ARNm y proteína) de la HMGCR. La expresión de mtAQP8 incrementó significativamente a nivel ARNm y proteína lo cual también fue observado mediante microscopía confocal. En conclusión, nuestros datos sugieren que el colesterol regula transcripcionalmente la expresión hepática de la mtAQP8 a través de SREBPs. En otra etapa de este trabajo estudiamos si un aumento o disminución en la expresión de mtAQP8 podría modular la colesterogénesis en el hepatocito. Primeramente establecimos un knockdown de AQP8 en hepatocitos de rata en cultivo y en células Huh-7. Las células hepáticas con knockdown de mtAQP8 mostraron una disminución significativa de la biosíntesis de novo del colesterol. En concordancia, la expresión tanto de SREBP-2 como de su gen diana HMGCR, se vieron disminuidos de manera significativa. Cuando la expresión de mtAQP8 fue aumentada luego de exponer los cultivos de hepatocitos de rata a un adenovector codificante para la AQP8 humana (hAQP8), la biosíntesis de colesterol aumentó de manera significativa. En estas condiciones, SREBP-2 y HMGCR también aumentaron su expresión. Además, realizamos ensayos in vitro para cuantificar la liberación de mtH2O2 la cual se observó significativamente aumentada en mitocondrias provenientes de hepatocitos con sobre-expresión de mtAQP8 y disminuida en mitocondrias provenientes de hepatocitos con knockdown de mtAQP8. En base a esto, decidimos tratar los hepatocitos con Mitotempo, un antioxidante específico de mitocondria. Bajo estas condiciones se previno el aumento en la liberación de mtH2O2 así como el aumento en la síntesis de colesterol observado en la sobre-expresión de mtAQP8. En conclusión, nuestros resultados sugieren que mtAQP8 vía el H2O2 derivado de las mitocondrias, participa en la colesterogénesis controlada por SREBP en los hepatocitos.

La palabra isquemia hace referencia a un riego sanguíneo insuficiente de los tejidos provocado por obstrucción del flujo arterial. La aterosclerosis coronaria es el substrato patológico subyacente en la mayoría de los casos de isquemia miocárdica [Gimbrone MA, 2013]. La reducción o el cese del suministro de sangre al corazón, conduce a la depleción de oxígeno y sustratos metabólicos alterando la homeostasis celular. Si el tiempo de isquemia se prolonga y en ausencia de circulación colateral significativa, la totalidad del área afectada se convierte en tejido necrótico dando lugar a un infarto agudo de miocardio establecido (IAM) La restauración del flujo o reperfusión terapéutica del lecho afectado, si bien necesaria, da origen a una serie de procesos capaces de sumar nuevas alteraciones celulares. La entidad fisiopatológica resultante de ambos eventos (isquemia y reperfusión) se denomina injuria irreversible por isquemia y reperfusión (I/R). Para el conjunto de la población mundial la enfermedad cardiovascular representa la principal causa de muerte y esta situación persistirá mientras no haya un cambio en la incidencia de los factores de riesgo (obesidad, hipertensión, sedentarismo, diabetes, etc.) [Mathers CD, 2006]. A pesar de los adelantos en el tratamiento de la cardiopatía isquémica al haberse mejorado los procedimientos de reperfusión, avanzado la tecnología de los stent [Palmaz JC, 1997] y generado nuevos y más eficientes fármacos, un tercio de las muertes en el mundo aún es producida por esta patología [Mendis S, 2011]. Al igual que sucede con otras enfermedades, el IAM tiene un alto impacto social no solo por la elevada mortalidad, sino también por la pérdida de calidad de vida, la discapacidad, y la disminución de la actividad productiva de los pacientes, lo cual implica elevados costos económicos [Blanco P, 2008]. En EE.UU. se estima que aproximadamente cada 42 segundos se produce un IAM y el 34% de las personas que presentan un evento coronario terminarán falleciendo a causa del mismo [Mozaffarian D, 2016]. En Argentina, unas 40.000 internaciones anuales son debidas a IAM [Piombo AC, 2011] y una de cada tres muertes es producto de esta patología [Allín JG, 2010]. La relevancia del problema ha conducido a que las autoridades sanitarias nacionales promulguen la Ley 25.501 de Control y Prevención de las Enfermedades Cardiovasculares (2009). Actualmente, el objetivo terapéutico en el abordaje del IAM, es lograr una optimización de las estrategias de restablecimiento del flujo sanguíneo permitiendo minimizar los efectos adversos que esta maniobra desencadena. Para actuar sobre el daño que produce la reperfusión, es fundamental conocer los procesos fisiopatológicos que tienen lugar durante la misma. El presente trabajo de tesis tuvo como finalidad profundizar en los mecanismos y las consecuencias funcionales de la injuria por I/R miocárdica centrándonos en el rol que cumple la isoforma II de la proteína quinasa dependiente de Ca²⁺ y calmodulina (CaMKII).

Los ganglios de la base (BG) son núcleos subcorticales interconectados con la corteza cerebral que están involucrados en el control motor voluntario y distintos aspectos de la conducta y el aprendizaje. La dopamina es un regulador clave del flujo de información desde la corteza al estriado, el principal núcleo de entrada de los BG. Algunas de las alteraciones conductuales observadas en desórdenes neuropsiquiátricos tales como el síndrome de Tourette, el trastorno de déficit de atención con hiperactividad y el desorden obsesivo compulsivo, son atribuidas a alteraciones madurativas de los circuitos córticoestriatales y su modulación dopaminérgica. Sin embargo, poco se sabe acerca del desarrollo funcional de estos circuitos y del rol de la dopamina en este proceso. El objetivo general de esta tesis es estudiar los mecanismos postnatales de la maduración del sistema córticoestriatal y su conexión con la adquisición de conductas normales y patológicas. Nuestra hipótesis es que las neuronas dopaminérgicas son importantes durante el desarrollo postnatal para el desarrollo funcional y anatómico de la conectividad córticoestriatal, y que alteraciones en este proceso dan lugar a condiciones neuropsiquiátricas. En este trabajo encontramos que la lesión neonatal de neuronas dopaminérgicas ocasiona déficits duraderos en el balance entre la búsqueda de recursos, tanto nutricionales como sociales, y el aprovechamiento de los mismos. Estos déficits emergen temprano en el desarrollo y empeoran en la vida adulta, en particular aquellos relacionados a la exploración global de ambientes complejos. Por otro lado, estudios electrofisiológicos in vivo y reconstrucciones morfológicas de las neuronas de proyección estriatales revelaron alteraciones córticoestriatales asociadas al fenotipo comportamental. Más específicamente, en los animales con lesión neonatal de neuronas dopaminérgicas se observó una reducción de la conectividad funcional córticoestriatal que afecta las entradas provenientes de la corteza prelímbica más marcadamente que las provenientes de las corteza cingular y motora. La atenuación en la conectividad observada para los inputs prelímbicos es más marcada en el adulto lesionado respecto del juvenil, se relaciona con una mayor susceptibilidad por sufrir procesos de depresión sináptica córticoestriatal, y se asocia a una contracción del árbol dendrítico de las neuronas de proyección estriatales, sin cambios en la densidad de espinas dendríticas. En conjunto, estos resultados son consistentes con la idea de que las neuronas dopaminérgicas son esenciales durante el desarrollo postnatal para la maduración funcional y estructural del sistema córticoestriatal. Desde una perspectiva bottom-up, nuestros hallazgos sugieren que condiciones neuropsiquiátricas presumiblemente relacionadas a alteraciones dopaminérgicas tempranas podrían presentar alteraciones en el reclutamiento de los circuitos córticoestriatales durante tareas de exploración y sociales.

La asociación entre cáncer e inflamación en un órgano o tejido se encuentra sólidamente establecida. En efecto, se sabe que ciertos tumores, tienen una mayor probabilidad de originarse en sitios de inflamación crónica y que procesos inflamatorios locales pueden acelerar el crecimiento de tumores preexistentes en animales y seres humanos. Por otro lado, la relación entre cáncer e inflamación sistémica no ha sido particularmente estudiada. En esta tesis, demostramos que durante el crecimiento de 4 tumores murinos, de diferente origen, estirpe histológico e inmunogenicidad y de un tumor humano creciendo en ratones nude, se generaron 2 picos temporalmente separados de inflamación sistémica. El primer pico fue relativamente pequeño y transitorio ya que fue detectado durante la primera semana luego de la inoculación del tumor. Tal vez represente, en parte, una respuesta del organismo al trauma mecánico de la inoculación de elementos extraños, ya que la inoculación de fibroblastos murinos normales también produjo una manifestación de inflamación sistémica, aunque menor, que la observada después de la inoculación de células tumorales. Por otro lado, el inicio del segundo pico de inflamación sistémica fue observado cuando el volumen tumoral fue mayor que 500 mm3 y coincidente con el inicio del crecimiento exponencial de cada tumor. Este segundo pico de inflamación sistémica fue significativamente más prominente que el primero y su intensidad aumentó en relación directa con el incremento de la masa tumoral. Estos resultados sugieren que la inflamación sistémica podría ser un fenómeno general de la patología neoplásica y su importancia se puso de manifiesto en el hecho de que, en nuestra colección de tumores, se observó, sorpresivamente, una correlación directa entre la magnitud de la inflamación sistémica generada por cada tumor y su agresividad, correlación que no se observó con la capacidad de generar metástasis. Esto indica, al menos en los tumores analizados por nosotros, que la capacidad de generar una potente respuesta inflamatoria sistémica, produce más efectos deletéreos sobre el organismo que la propia capacidad metastásica, disminuyendo de este modo la sobrevida. En este sentido, se encontró gran infiltración de neutrófilos y alteraciones estructurales en diferentes órganos, que son compatibles con disminución y aún pérdida de función, independiente de la capacidad metastásica de cada tumor. La inflamación sistémica generada por el tumor exacerba el propio crecimiento tumoral estableciendo un circuito de retroalimentación positivo entre ambos, al menos en parte por la activación del receptor TLR-4. Además, la disminución de las manifestaciones de inflamación sistémica mejoró los efectos anti-tumorales obtenidos con quimioterapia y radioterapia, aunque estos resultados fueron relativamente modestos. Esto se debe a que el tumor cuando supera los 1500 mm3, comienza un crecimiento exponencial, generando un fenómeno de inflamación sistémica progresivo, a pesar de que se continúan administrando las drogas antiinflamatorias, que hasta ese momento habían sido bastante efectivas para limitar la naciente inflamación sistémica y para retardar el crecimiento tumoral. En cambio, un excelente resultado terapéutico fue alcanzado cuando se realizó el tratamiento antiinflamatorio junto con la escisión quirúrgica de tumores > 2000 mm3. En este caso, la eliminación quirúrgica de la fuente principal de inflamación sistémica y de posible refractariedad, permitió al tratamiento antiinflamatorio tener muchas más chances de actuar, contra la inflamación sistémica residual, pero aún deletérea, que perdura al menos 2 semanas después de la extirpación del tumor. Si esta condición inflamatoria sistémica fuera una característica distintiva de muchos canceres avanzados, un conocimiento más preciso de los mecanismos por los cuales esta inflamación sistémica promueve el crecimiento tumoral y produce múltiples daños en el organismo y la búsqueda de sustancias antiinflamatorias más efectivas y con menores efectos adversos, serían muy importantes para complementar y mejorar las terapias actuales contra el cáncer.

Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista el cual posee múltiples mecanismos que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y una variedad de factores de virulencia que contribuyen al desarrollo de infección en diversos sitios. Las infecciones por S. aureus se caracterizan por una fuerte respuesta inflamatoria mediada por la presencia de neutrófilos que son reclutados al sitio de la infección. Se ha demostrado el rol crítico de la proteína A (SpA) en el desarrollo de neumonía mediante la inducción de las cascadas de señalización de TNF-α e IFN-β, las cuales conducen a la producción de mediadores inflamatorios y al reclutamiento de neutrófilos. Asimismo SpA induce cascadas de señalización pro-inflamatorias en células mieloides y en células no inmunes. El objetivo general del presente trabajo fue determinar el rol de la proteína A de S. aureus en la activación y secreción de mediadores pro-inflamatorios en neutrófilos humanos así como su capacidad de regular la sobrevida de los mismos. Se demostró que S. aureus y la proteína A contribuyen a modular el perfil inflamatorio de los neutrófilos en forma temprana mediante la inducción de citoquinas inflamatorias y quimioquinas. S. aureus indujo la activación de MAPKs contribuyendo a la producción de IL-8 y TNF-α por los neutrófilos. El estímulo con S. aureus provocó además la expresión sostenida de señales pro-inflamatorias hasta las 22 horas luego de la estimulación. La exposición prolongada de los neutrófilos a S. aureus indujo un aumento en los niveles de mortalidad y cambios en la proporción de neutrófilos apoptóticos/necróticos con un incremento de la proporción de necrosis. No obstante, la expresión de SpA resultó crítica para prevenir parcialmente la necrosis masiva de los neutrófilos favoreciendo la muerte por apoptosis. Nuestros resultados sugieren que la proteína A de S. aureus desempeñaría un rol pro-inflamatorio durante el encuentro inicial con los neutrófilos lo cual contribuiría a la inducción de un microambiente pro-inflamatorio incrementando la sobrevida de los neutrófilos. En estadios posteriores, la expresión de proteína A desempeñaría un rol anti-inflamatorio ya que contribuiría a prevenir la necrosis masiva y disminuir los efectos deletéreos que la inflamación exacerbada podría tener sobre la bacteria.

El 75% de los carcinomas mamarios expresan receptores de estrógenos (RE) y progesterona (RP) y son susceptibles a una terapia endocrina. Sin embargo, con el tiempo, algunos pacientes desarrollan resistencia (resistencia hormonal adquirida) y otros no responden al tratamiento desde el comienzo (resistencia constitutiva). En nuestro laboratorio, utilizando modelos de carcinomas mamarios murinos y humanos, hemos demostrado que los tumores respondedores a la terapia con el antiprogestágeno mifepristona (MFP) tienen mayor expresión de la isoforma A del RP (RPA) que de la isoforma B (RPB). A su vez, los tumores con resistencia constitutiva o adquirida, se caracterizan por manifestar la relación inversa (RPB>RPA). Se han propuesto diversas hipótesis para explicar los mecanismos que conducen a la resistencia endócrina, entre ellas, la activación constitutiva de vías de transducción de señales. La vía que involucra al FGF2 y sus receptores está constituida por cuatro receptores (FGFR1-4) y cinco isoformas de FGF2 con distinto peso molecular: la isoforma de 18 kDa o LMW-FGF2 y las de alto peso o HMW-FGF2 de 22; 22,5; 24 y 34 kDa. En trabajos previos demostramos que, en muestras de carcinomas mamarios humanos, existe una asociación significativa entre la expresión de FGFR2 y REα; también observamos una correlación positiva entre la expresión de FGFR1 y un alto grado histológico. Demostramos también que, en tumores sensibles a la terapia endocrina, el FGFR2 activado por el FGF2 estromal participa en el crecimiento tumoral a través de la activación de los RP. Si bien se ha demostrado que la vía del FGF2/FGFR se encuentra desregulada en numerosas neoplasias y patologías del desarrollo, en muestras de pacientes con cáncer de mama aún es controvertida la asociación entre la expresión de FGF2 y el pronóstico de la enfermedad. En base a estos antecedentes, nuestra hipótesis de trabajo es que durante la adquisición de la resistencia endocrina se produce un cambio en la expresión y señalización de FGF2 que favorece el crecimiento y la progresión tumoral. Nuestro objetivo general fue evaluar el rol de la vía FGF2/FGFR en el crecimiento y la progresión del cáncer de mama. En primer lugar, utilizamos el modelo murino de carcinomas mamarios generados en nuestro laboratorio. Observamos, tanto por inmunohistoquímica como por Western blot, que las variantes resistentes de tres familias tumorales diferentes (C4, 59 y C7) expresan mayores niveles de FGFR1 y FGF2 que los tumores sensibles. Por inmunohistoquímica, observamos que el FGF2 se localiza predominantemente en el epitelio o en el estroma tumoral de las variantes resistentes y sensibles, respectivamente. Es interesante observar que, el análisis de la expresión de las distintas isoformas de FGF2 reveló que las variantes resistentes expresan mayores niveles de las isoformas HMW-FGF2 que las variantes sensibles. Asimismo, mediante ensayos de ELISA mostramos que, en los tumores resistentes adquiridos y constitutivos, la localización es mayormente intracelular y extracelular, respectivamente. Luego, evaluamos la funcionalidad de la vía de FGF2/FGFR en cultivos primarios de células epiteliales de las tres familias tumorales. Observamos que el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular de tumores sensibles y resistentes constitutivos, pero no afecta la proliferación celular de los tumores resistentes adquiridos de la familia C4. Por otra parte, el tratamiento con dos inhibidores distintos de FGFR, PD 173074 y BGJ398, inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres familias tumorales, lo que indica un rol proliferativo de esta vía. Sin embargo, al realizar ensayos in vivo con el inhibidor BGJ398, éste sólo reduce parcialmente el crecimiento tumoral de las variantes C4-HI (sensible) y C7-HI (resistente constitutiva). El inhibidor no tuvo efectos significativos sobre el crecimiento tumoral de las variantes resistentes de la familia C4, aunque indujo signos de regresión tumoral temprana en todas las variantes tumorales ensayadas (C4-HI, C4-2-HI, C4-HIR, 59-HI, C7-HI). Las diferencias en el alcance de los efectos observados en cultivo e in vivo sugieren que deben desarrollarse inhibidores con mayor eficacia in vivo. En conjunto, los resultados obtenidos con el modelo murino muestran una correlación positiva entre la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 con la resistencia hormonal y sugieren que, en la progresión tumoral, habría un aumento en la expresión de HMW-FGF2 y FGFR1 en el epitelio tumoral. Este aumento conduce a un cambio de una señalización paracrina en las variantes sensibles, a una autocrina o intracrina en los tumores resistentes constitutivos o adquiridos, respectivamente. A continuación, validamos los resultados en un modelo de cáncer de mama humano, para lo cual utilizamos la línea celular T47D-WT y sus variantes: la línea T47D-YA, con alta expresión de RPA y sensible a MFP, y la línea T47D-YB, con alta expresión de RPB y resistente a MFP. Por inmunofluorescencia, inmunohistoquímica y Western blot, observamos que la línea T47D-YB expresa mayores niveles de FGFR1, FGFR2 y HMW-FGF2 respecto de la línea T47DYA. Por otro lado, el agregado de LMW-FGF2 estimula la proliferación celular en las líneas T47D-WT e -YA pero no altera su proliferación en las células T47D-YB. La línea resistente presenta mayor actividad basal de la vía de FGF2/FGFR, ejemplificada en la fosforilación de FRS2 y activación predominantemente de la vía de AKT, en comparación con la línea sensible. El LMW-FGF2 modularía principalmente la activación de las vías mencionadas en las líneas T47D-WT e -YA, lo que sugiere una activación constitutiva en la línea resistente. El BGJ398 inhibe significativamente la proliferación celular basal e inducida por LMW-FGF2 en las tres líneas celulares, indicando que la vía de FGF2/FGFR cumple un rol proliferativo. Finalmente, generamos variantes de la línea T47D-YA que sobreexpresan las isoformas de 18 y 22,5 kDa de FGF2 y evaluamos su efecto sobre la sensibilidad a MFP, TLP y TAM. En ensayos de recuento celular observamos que la sobreexpresión de las isoformas de 18 y 22,5 kDa promovió un aumento en la tasa de proliferación celular y resistencia al tratamiento endocrino en comparación con la línea T47D-YA infectada con el plásmido vacío (T47D-YA-Vac). La resistencia a MFP se mantuvo aún en ensayos in vivo y se observaron signos de malignidad en los tumores primarios, particularmente en la línea T47D-YA-22,5. Esto se evidenció en la capacidad para invadir tejidos adyacentes al tumor, como piel, músculo y tejido adiposo. Si bien algunos de los animales portadores de tumores T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa focos metastásicos en los pulmones, 100% de los ratones con T47D-YA-22,5 presentaron metástasis pulmonares y un mayor número de focos con respecto a T47D-YA-Vac e -YA-18 kDa. Nuestras observaciones indican que el FGF2 promueve el crecimiento tumoral en ambas variantes, sensibles y resistentes. Sin embargo, los resultados sugieren que, en los tumores sensibles, el estroma proveería el FGF2 que induciría el crecimiento tumoral a través de sus receptores de membrana y el RP de forma paracrina. Por otro lado, en los tumores resistentes, el propio parénquima tumoral expresaría elevados niveles de FGF2 (particularmente LMW-FGF2) y que, a través de un loop autocrino que involucra al FGFR1, gatillaría señales de proliferación, independientemente de la presencia de progestágenos o antiprogestágenos. No descartamos que exista también un loop intracrino, donde el FGF2 intracelular, particularmente las HMW-FGF2, serían responsables de la proliferación celular, resistencia a endocrina y diseminación metastásica. Nuestros estudios contribuyen a esclarecer el rol de las isoformas de FGF2 en la progresión tumoral mamaria y representan la primera evidencia de resistencia hormonal vinculada a HMW-FGF2.

La inflamación es un rasgo característico de la brucelosis humana, presente virtualmente en todos los órganos afectados por la misma. Esta particularidad, junto con la detección de bacterias en los tejidos inflamados, sugiere que Brucella estimula una robusta respuesta inflamatoria en los sitios en que se localiza. Sin embargo, los mecanismos por los cuales estas bacterias desencadenan esta respuesta son hasta el momento desconocidos. A pesar del poderoso potencial inmunomodulador de las lipoproteínas bacterianas, se les ha prestado hasta el momento poca atención en la brucelosis. En esta tesis investigamos la función de las lipoproteínas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria asociada a esta enfermedad, poniendo énfasis en la interacción de Brucella con distintos tipos celulares fundamentales en el desarrollo de la respuesta innata. Nuestros resultados demuestran que B. abortus es capaz de inducir la respuesta inflamatoria por medio de la activación y producción de citoquinas en monocitos/macrófagos, células dendríticas y neutrófilos. En relación al componente de Brucella responsable de inducir esta respuesta, nuestras observaciones experimentales indican que las lipoproteínas de Brucella estarían implicadas en el desarrollo de la respuesta inflamatoria en brucelosis.

Muchas especies de animales, entre ellos las serpientes, han desarrollado la capacidad de inyectar o liberar secreciones venenosas con el propósito de controlar, inmovilizar y digerir sus presas. Sin embargo su inoculación por motivos de defensa, es la que ocasiona el accidente ofídico, tanto en humanos como en animales, el cual se presenta como un cuadro fisiopatológico que puede ser fatal. Las especies de serpientes de mayor importancia médica responsables de los accidentes en humanos en el Nordeste Argentino, pertenecen a la familia Viperidae, siendo las intoxicaciones por las especies de Bothrops alternatus y Bothrops diporus las más frecuentes (98%). El envenenamiento por estas serpientes se caracteriza por manifestaciones locales, que se presentan minutos después de la inyección del veneno, tales como dolor intenso, edema y hemorragia local. Estos signos son seguidos por dermo- y mionecrosis, como así también formación de ampollas que rodean al sitio de mordedura. En casos graves provocan alteraciones sistémicas, caracterizadas por hemorragia en órganos y vísceras, coagulación intravascular diseminada (CID) seguida de desfibrinogenación y alteraciones hemodinámicas que pueden llevar a shock cardiovascular, insuficiencia renal aguda (IRA) e incluso la muerte. Entre las manifestaciones, la hemorragia es reconocida como un episodio temprano, frecuente y clave en la clínica del envenenamiento, que conjuntamente a las alteraciones hemostáticas definen la gravedad de la intoxicación. La hemorragia es el resultado de la alteración en la interacción entre plaquetas, factores de la coagulación y la pared vascular, donde el endotelio cumple un papel fundamental. El fenómeno fisiológico que detiene el sangrado se conoce como hemostasia. La respuesta hemostática ha sido clasificada en tres procesos: la hemostasia primaria donde participan fundamentalmente el endotelio y las plaquetas, la hemostasia secundaria que comprende la activación del sistema de coagulación y la fibrinólisis que involucra la degradación de la malla de fibrina. Dado el grado de afectación que inducen los venenos botrópicos en la hemostasia ha cobrado importancia el conocimiento acerca de la manera en que las toxinas afectan el adecuado funcionamiento de la circulación sanguínea y el sistema vascular. De todos los componentes, las metaloproteinasas y las serinoproteinasas de veneno de serpientes (SVMPs y SVSPs, respectivamente) dada su capacidad de clivar el enlace peptídico son las principales involucradas en las alteraciones hemostáticas. Resumen Resumen 2 Van de Velde, Andrea C. Bothrops alternatus conocida como yarará grande o víbora de la cruz es la especie de mayor distribución y abundancia en el NEA y su veneno está constituido en un 43% por enzimas de la familia de las SVMPs, que tienen un rol clave en el envenenamiento. Dado el cuadro de intoxicación inducido por el veneno de B. alternatus y la abundancia de las SVMPs en ésta secreción, fue de interés dilucidar su rol en las alteraciones hemostáticas que desencadena este veneno, como así también la acción sinérgica con otras toxinas involucradas en estas alteraciones. Para discernir la participación de las SVMPs se usaron como herramientas: inhibidores de metalo- (EDTA-Na2) y de serinoproteinasas (PMSF), baltergina (una SVMP P-III hemorrágica), anticuerpos anti-balt y baltergina-DC (fragmento estable de autoproteólisis de baltergina). En primera instancia, se debió aislar y purificar del veneno de B. alternatus la enzima baltergina. La hemorragina purificada se sometió a autoproteólisis previo ajuste de las condiciones óptimas de pH, temperatura y tiempo, para posteriormente llevar a cabo el aislamiento de baltergina-DC. Por otro lado, baltergina fue utilizada como inmunógeno para la producción de inmunoglobulinas G (IgGs) toxino-específico, que junto con EDTA-Na2, fueron empleados para estudios de neutralización del veneno entero. La fracción IgG fue purificada del suero anti-balt por cromatografía de afinidad y estos anticuerpos fueron capaces de neutralizar completamente la actividad hemorrágica y proteolítica (azocaseína) del veneno en una relación 1/20 (veneno/IgGs anti-balt). Como estudios complementarios a los objetivos inicialmente propuestos en esta tesis, fue posible profundizar en la estructura de las toxinas. Mediante estudios de 2D-PAGE de baltergina se observó la presencia de 9 isoformas acídicas (rango de pI= 4,8 - 5,7). Del análisis de espectrometría de masas se logró identificar un 68% de identidad con la secuencia de botropasina, una SVMP P-III aislada del veneno de B. jararaca. Se determinó la secuencia parcial de baltergina-DC, obteniéndose 36 aminoácidos del extremo amino-terminal. Para abordar el efecto de las SVMPs en la hemostasia primaria mediante un ensayo de agregación plaquetaria se demostró que baltergina-DC fue capaz de inhibir la agregación de manera dosis dependiente, observándose una inhibición del 43,65% con la dosis más alta ensayada (50 µg/ml), utilizando ADP como agente agregante. A la vez, se determinó el tiempo de sangría (TS), para ello grupos de animales fueron inoculados con PBS, veneno (20 µg) y veneno pre-incubado con IgG anti-balt (relación 1/30). A las dos horas, los resultados mostraron que el TS de animales inoculados con veneno se prolongó tres veces respecto al control, y en los animales tratados con veneno pre-incubado con anticuerpos toxino-específicos la sangre no coaguló al tiempo y dosis ensayados. Se realizó el recuento de plaquetas en el plasma de los diferentes grupos de ratones y se observó una marcada Resumen Resumen 3 Van de Velde, Andrea C. trombocitopenia en los animales tratados con veneno y veneno pre-incubado con IgG antibalt. A partir de estos estudios se comprobó que las SVMPs del veneno de B. alternatus intervienen en la alteración que induce esta secreción en la hemostasia primaria, específicamente al inhibir la agregación plaquetaria, donde la región símil desintegrina ha de tener un rol clave. Para evaluar el efecto de las metaloproteinasas sobre la hemostasia secundaria se realizaron ensayos tanto in vitro como in vivo. El tiempo de coagulación (TC) fue registrado enfrentando plasma citratado a una solución de veneno, como así también a veneno preincubado con EDTA-Na2, con PMSF y veneno pre-incubado con IgG anti-balt. Los resultados mostraron que el veneno-EDTA-Na2 y el veneno-IgG anti baltergina alargaron 3,5 y 3,1 veces, respectivamente, el TC respecto al control de veneno, mientras que para el venenoPMSF se registró un TC 7,7 veces más prolongado respecto al control. Asimismo se registró el TC sobre fibrinógeno utilizando las mismas muestras y no se observó cambios en el registro del TC en el control de veneno y el veneno inhibido por EDTA-Na2 e IgG anti-balt, sin embargo no se observó la formación de malla de fibrina cuando se expuso el fibrinógeno al veneno-PMSF. Se determinó la concentración de fibrinógeno en plasma citratado de grupos de ratones inoculados por vía i.v. con PBS, veneno (20 y 40 µg) y veneno-IgG antibalt (relación 1/30). Tanto los ratones inoculados con la dosis más alta de veneno como aquellos inoculados con veneno-IgG anti-balt, presentaron un plasma incoagulable lo cual indicó depleción de fibrinógeno circulante. Se comprobó así que las SVMPs afectan la hemostasia secundaria, bajo una acción conjunta con las serinoproteinasas. El alargamiento en el TC observado sobre plasma, y “no sobre fibrinógeno”, por parte del veneno bloqueado tanto con EDTA-Na2 como con IgG antibalt, dejó en evidencia que las SVMPs tienen un rol pro-coagulante. La incapacidad de formar la malla de fibrina por parte del veneno bloqueado con PMSF reflejó el rol exclusivo de las SVSPs con actividad thrombin like. Los ensayos in vivo refuerzan lo observado in vitro. Los anticuerpos no fueron capaces de neutralizar la actividad coagulante del veneno, siendo entonces las SVSPs los principales componentes responsables de provocar depleción de fibrinógeno por consumo. En conclusión, el presente trabajo permite reconocer a las SVMPs como toxinas claves en las alteraciones hemostáticas que pueden conducir a la muerte en el envenenamiento por B. alternatus. Así su responsabilidad directa sobre la hemorragia, sobre la inhibición de la agregación plaquetaria y su contribución en la depleción del fibrinógeno circulante, las vuelve enzimas con una remarcada participación en las alteraciones en la hemostasia Resumen Resumen 4 Van de Velde, Andrea C. inducidas por este veneno botrópico. Los resultados aquí descriptos, conjuntamente a evidencias reunidas de estudios previos, demuestran que los anticuerpos anti-balt serían efectivos neutralizando la hemorragia (tanto local como sistémica), proteólisis de componentes de la matriz extracelular, formación de trombo plaquetario y en general todos los efectos inducidos por las SVMPs. Sin embargo si se utilizaran potencialmente como terapia, la víctima del accidente ofídico tratada con un anti-suero anti-balt se encontraría en un estado anticoagulado transitorio pero sin extravasación de sangre, evitándose con ello la principal causa de muerte por parte de este veneno. Finalmente esta tesis aporta información que podría ser relevante para el diseño de inmunobiológicos más específicos, de baja carga proteica, tendientes a optimizar la actual seroterapia antiofídica.

La relación entre HIV y las células CD4 positivas en las que replica ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo el virus puede asociarse extracelularmente a células CD4 negativas incluyendo los eritrocitos. Si bien se ha reportado que el HIV se une a eritrocitos de individuos HIV negativos in vitro y es capaz de trans-infectar a otras células, no hay estudios equivalentes utilizando eritrocitos de individuos infectados. Esta tesis aporta información sobre la población viral asociada a eritrocitos en pacientes infectados por HIV y del rol que esta población podría tener en la fisiopatología de la infección. En la misma, se demostró la asociación de RNA y antígeno viral de HIV con eritrocitos de individuos infectados cursando distintos estadios virológicos de la infección. Incluso en individuos con carga viral plasmática indetectable por un año en los cuales la detección de antígeno podría ser útil para detectar rebrote de la replicación. Por primera vez se han detectado anticuerpos anti-HIV específicos asociados a eritrocitos. La presencia de los mismos estuvo asociada con replicación viral activa. Se demostró que la capacidad de los eritrocitos de pacientes infectados de capturar virus es muy superior a la de eritrocitos de individuos no infectados. A su vez, se encontró una relación positiva entre esa capacidad de captura y la presencia de anticuerpos anti-glicoproteína sobre la superficie de los eritrocitos. La presencia de HIV y la gran capacidad de captura viral por parte de los eritrocitos de individuos infectados demuestran que pueden ser transportadores de un importante pool viral. Más aun, se demostró in vitro que el virus unido a los eritrocitos conserva su infectividad sobre macrófagos derivados de monocitos, donde la unión mediada por complemento resulta en una infección productiva que genera progenie viral infectiva. Este mecanismo de infección de macrófagos resultó eficaz para una cepa macrofagotrópica pero ineficaz para una cepa linfotrópica pudiendo constituir un factor de selección en las primeras etapas de la infección. Haber determinado la infección de macrófago por el virus asociado a los eritrocitos es relevante dada la característica de aquellas como reservorio y por su capacidad de invasión de distintos tejidos. Los estudios llevados a cabo ponen de relevancia incluir el virus asociado a eritrocitos para comprender cabalmente la dinámica y la fisiopatogenia de la infección. Esto podría conducir a mejorar decisiones clínicas en situaciones tales como inicio o cambios en los tratamientos antirretrovirales así como analizar la posible importancia del virus asociado a eritrocitos como blanco para la terapia antirretroviral.