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El estudio de la respuesta inmune contra las proteínas ribosomales P de Trypanosoma cruzi en el suero de pacientes chagásioos crónicos sugirió que esta respuesta inmune podria jugar un importante rolen el desarrollo de la cardiomiopatía chagásica. En función de esos resultados se encaró una tarea de clonado de las proteinas ribosomales P213 y P0 de T. cruzi en vectores procariontes con el objeto de expresar y purificar abundantes cantidades de proteínas recombinantes. Estas proteínas se utilizaron para desarrollar modelos de inmunización en ratones. En primer término se determinó la especificidad de la respuesta inducida mediante estos modelos. Luego se estudió la respuesta contra los principales epítopes de éstas proteínas localizados en el extremo C-terminal (péptido R13 en TcP2β y P015 en TcP0). Se determinó que la respuesta contra estos epitopes fue similar a la observada en sueros humanos. Paralelamente, se realizaron estudios tendientes a determinar alteraciones en la función cardíaca de los animales inmunizados. De esta forma, mediante la realización de electrocardiogramas, se estableció el desarrollo de alteraciones en la generación del impulso nervioso (arritmias), alteraciones en la conducción intraventricular y en la repolarización. La participación de los anticuerpos anti-P en la generación de alteraciones cardíacas también fue confirmada en ensayos realizados sobre corazones aislados de conejo.

Universidad Nacional de Quilmes

El diagnóstico de periodontitis apical crónica, representa una estrategia esencial para seleccionar un protocolo terapéutico efectivo en la búsqueda de la eliminación de los microorganismos provenientes de los conductos radiculares y alcanzar el éxito a distancia. Los objetivos de este estudio clínico prospectivo fueron, por una parte, investigar la evolución radiográfica de las periodontitis apicales crónicas realizadas en una o dos sesiones, en dos grupos etarios y por otra parte, determinar si la edad influía en el tiempo necesario para lograr la reparación periapical. Materiales y métodos: El trabajo fue realizado en cuarenta (40) pacientes de ambos sexos concurrentes al Servicio de Odontología del Hospital Privado Universitario de Córdoba, cuyas edades oscilaban entre 20 y 70 años que presentaban en alguna de sus piezas dentarias periodontitis periapical crónica. Según la edad de los pacientes, las piezas tratadas fueron divididas en dos grupos: 20 pertenecientes a adultos jóvenes de entre 20 a 40 años y 20 correspondientes a adultos mayores con edades comprendidas entre 41 a 70 años o más. El estudio contó con el aval del Comité de Revisión Interna del Hospital Privado Universitario de Córdoba, lugar donde se realizó la experiencia. Todos los pacientes conocieron el plan de tratamiento y firmaron el consentimiento informado antes de iniciar la práctica odontológica y su evolución radiográfica. A todos los elementos dentarios se le realizaron los tratamientos endodónticos correspondientes: uno de dos sesiones realizado en 20 dientes (10 de cada grupo etario). En la primera sesión se instrumentaron, desinfectaron los conductos y luego fueron obturados con una medicación a base de hidróxido de calcio y agua destilada durante catorce días. Pasado ese tiempo, los pacientes se citaron nuevamente para eliminar los restos de material y obturarlos definitivamente con técnica de compactación lateral. Otro de sesión única, efectuado sobre 20 dientes (10 de cada grupo etario) se instrumentaron, desinfectaron y obturaron definitivamente con técnica de compactación lateral. La evolución radiográfica a distancia fue realizada sobre cada una de las raíces comprometidas con periodontitis apical controlándose a los seis, doce, dieciocho y veinticuatro meses. Las imágenes radiográficas digitalizadas se procesaron mediante software (Image Pro Plus v.4.52). Para el contraste estadístico se utilizó ANOVA, DHS de Tukey y Análisis de la Correlatividad de Pearson. Resultados: De acuerdo a los análisis de ANOVA, en ambos grupo etarios, la reducción del tamaño del proceso periapical a los seis meses fue mayor en los tratamientos realizados en una sesión. A los doce meses los resultados, fueron similares en ambos grupos de tratamientos. En cambio a los dieciocho y veinticuatro meses la disminución de la zona radiolúcida fue más evidente en los tratamientos realizados en dos sesiones (p<0,05). Con respecto a la edad se observó que el grupo de adultos mayores registró un porcentaje superior de reducción del proceso que los adultos jóvenes. Esta tendencia se corroboró en todos los controles, con excepción del control a los doce meses donde la diferencia entre los grupos fue escasa (p<0,05). Conclusiones: En el presente estudio el proceso de regeneración fue variable según el periodo de control analizado, y según el tratamiento fuera realizado en una o dos sesiones. Los adultos mayores presentaron una distribución más acentuada de valores de reducción que el grupo de pacientes jóvenes.

La angiognésis tumoral es el proceso que involucra la proliferación de vasos sanguíneos hacia el tumor en desarrollo. Los capilares que llegan al tumor aportan nutrientes y oxígeno y la vía de acceso de las células tumorales a circulación. Por lo tanto, este proceso es indispensable para el crecimiento tumoral y la diseminación metastásica. Además de existir factores angiogénicos liberados por la células tumorales, se ha descripto que células del huésped pueden colaborar en este proceso. En este laboratorio se demostró que los linfocitos T provenientes de ratones portadores de tumor, tienen actividad angiogénica. El objetivo de este trabajo fue identificar factores que estuvieran alterados durante el crecimiento tumoral y que fueran capaces de estimular los linfocitos para desencadenar la respuesta angiogénica (SLIA). Particularmente se estudió la importancia de la síntesis de poliaminas (PA) y de la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) en este proceso. Se encontró que si bien la síntesis activa de PA es indispensable para la actividad angiogénica de los linfocitos, estos metabolitos no son inductores de SLIA. Cuando se investigó la importancia de la producción de ROS en la SLIA, se observó: a) el bloqueo de la SLIA por la administración de secuestradores de ROS a ratones portadores de tumor; b) aumento de peroxidación lipídica en el bazo de ratones portadores de tumor; c) aumento en el cociente entre la actividad de las enzimas antioxidantes SOD y CAT en el bazo normal, que continuaba incrementándose durante el crecimiento tumoral. Luego se determinó in vitro que el peróxido de hidrógeno era el único ROS capaz de inducir esta respuesta angiogénica, coherentemente con los hallazgos realizados in vivo sobre la peroxidación lipídica y el desbalance SOD/CAT. Finalmente se observó que la administración in vivo de esta molécula estimula la respuesta SLIA en forma análoga a la inducida por las células tumorales.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014

Los microARNs son reguladores post-transcripcionales de la expresión génica que participan en la regulación de distintos procesos celulares como por ejemplo en el desarrollo embrionario. En el presente trabajo estudiamos el perfil de expresión de los microARNs durante la diferenciación a mesodermo temprano y al linaje cardíaco mediante secuenciación masiva de los ARN pequeños. A partir de estos resultados determinamos que hay aproximadamente 700 micro- ARNs que se expresan diferencialmente en las células pluripotentes humanas, un progenitor temprano de mesodermo y cardiomiocitos. A su vez, analizamos la presencia de variantes de microARNs llamados isomiRs y determinamos la abundancia de las distintas isoformas en las distintas poblaciones celulares. A partir del análisis in silico de los genes target determinamos que estas isoformas amplían el repertorio de genes regulados por el microARN canónico, lo cual sugiere un rol funcional de los isomiRs durante el proceso de diferenciación celular. Por otro lado, analizamos el miRNoma de cada una de las tres poblaciones celulares en base a las familias y clusters de microARNs e identificamos que los microARNs de dichos grupos comparten un perfil de expresión y colaboran entre sí en la regulación de procesos relacionados con el desarrollo embrionario. Además, establecimos el miRNoma de los cardiomiocitos mediante la comparación de los microARNs que se expresan en otros tipos celulares. Finalmente, estudiamos el cluster C19MC, up-regulado en las células pluripotentes, y analizamos de manera in silico y experimental los genes target de dicho cluster. De esta manera, determinamos que el C19MC participa en la regulación del ciclo celular y de distintos procesos de diferenciación en el desarrollo embrionario. Por último, estudiamos el miR-205 en la diferenciación a mesodermo e identificamos que su sobreexpresión aumenta al doble el porcentaje del progenitor temprano de mesodermo. Los microARNs ejercen su función formando complejas redes de regulación, lo cual requiere de un análisis más global para poder entender mejor el rol que estos pequeños ARN tienen en las células. Nuestros resultados expanden el conocimiento de los microARNs en relación con el desarrollo cardíaco.

El cáncer de próstata (CaP) ocupa el segundo lugar en incidencia y es la quinta causa de muerte por cáncer en hombres en el mundo. En nuestro país es el tipo de cáncer de mayor incidencia y la tercera causa de muerte por cáncer en la población masculina. Es por lo tanto un problema de salud pública de suma importancia. Entre los factores de riesgo más relevantes al CaP encontramos la edad, el origen étnico, los antecedentes familiares, las hormonas, la exposición a determinadas substancias químicas y el estilo de vida. Dentro de este último factor de riesgo podemos incluir la dieta. Los microRNAs (miRNAs) son moléculas pequeñas, 19 a 22 nucleótidos, de RNA no codificante que tienen un rol fundamental en la regulación de la expresión génica. En mamíferos su mecanismo principal de acción es la represión de la traducción del mRNA mediante el apareamiento de bases entre el miRNA y una secuencia semilla ubicada, generalmente, en el extremo 3´ UTR del mRNA. Dado que no es requerida la complementariedad de bases exacta, un mismo miRNA puede regular la expresión de una gran variedad de genes, potencialmente silenciando por completo una vía celular determinada. Así como ocurre con los genes convencionales, los miRNAs pueden ser considerados pro o antitumorales y de la misma manera se los encuentra desregulados en cáncer. Hace 10 años se descubrió que algunos miRNAs son activamente secretados por las células, pudiéndolos encontrar en circulación en condiciones normales así también como en condiciones patológicas. Todas las características mencionadas hacen de los miRNAs moléculas interesantes para ser estudiadas en cáncer no sólo como uno de los tantos mecanismos que se encuentran desregulados en esta patología, sino además como posibles biomarcadores diagnósticos o pronósticos de la enfermedad. El síndrome metabólico (SM) es otro problema grave de salud pública en el mundo moderno. Se lo describe como un conjunto de desórdenes fisiopatológicos cuyo diagnóstico requiere la detección de al menos 3 de los siguientes factores: obesidad visceral, triglicéridos elevados, bajos niveles de colesterol HDL, hipertensión y niveles elevados de glucemia en ayunas. El estudio del rol del SM en cáncer ha cobrado importancia en los últimos años. Un meta-análisis reciente encontró que existe una correlación significativa entre el SM y la agresividad y recurrencia bioquímica de tumores de próstata. C-terminal binding protein 1 (CTBP1) es un co-represor transcripcional cuya actividad requiere la unión de NAD+ o NADH, sin embargo es 100 veces más afín por el segundo por lo que es considerado un sensor del estado metabólico celular. Dado que su actividad se ve incrementada en condiciones de alta energía y que entre sus genes blanco se encuentran distintos supresores tumorales, es un candidato atractivo como posible vínculo entre el SM y cáncer. En trabajos previos de nuestro laboratorio empleando un modelo murino encontramos que el silenciamiento de CTBP1 en tumores de próstata xenotransplantados llevaba a una drástica disminución del crecimiento tumoral únicamente en animales con SM. El RNA obtenido de muestras de los xenotransplantes fue hibridado con un microarreglo de expresión del genoma completo y con un microarreglo de expresión de miRNAs, obteniéndose una lista de genes y una de miRNAs regulados por CTBP1 en condiciones de SM. A partir de estos resultados continuamos trabajando en este proyecto de tesis. Como primer objetivo nos planteamos el análisis y la validación de los resultados del microarreglo de expresión génica. Nos centramos en aquellos genes regulados por CTBP1 pertenecientes al proceso de adhesión celular. Fuimos capaces de validar los resultados del microarreglo tanto por RT-qPCR como mediante ensayos funcionales de adhesión celular. Encontramos que la sobre expresión de CTBP1 favorece el fenotipo mesenquimal, disminuye la adhesión celular y aumenta el potencial invasivo de las células tumorales prostáticas. Por el contrario, el silenciamiento de CTBP1 induce un aumento de la adhesión celular lo cual se evidencia en el incremento de la superficie de membrana plasmática en contacto con el sustrato. A continuación desarrollamos dos modelos in vivo de CaP y SM. El primer modelo nos facilitó el estudio de metástasis espontáneas. Brevemente, ratones de la cepa NOD scid gamma (NSG) de 4 semanas de edad fueron alimentados con una dieta control (DC) o una dieta enriquecida en grasa (DG), luego de 12 semanas los animales fueron inoculados con células PC3 con expresión disminuida de CTBP1 (PC3.shCTBP1) o control (PC3.PGIPZ). Al cabo de 4 semanas los animales fueron sacrificados y se tomaron muestras de tumor, pulmón y sangre para su posterior análisis histológico y/o por RT-qPCR según correspondiese. Encontramos que el silenciamiento de CTBP1 disminuyó significativamente el número y el tamaño de los focos metastásicos en los pulmones de los animales con SM. En el segundo modelo se trabajó con ratones de la cepa C57BL/6J, también de 4 semanas de edad, a los que se les administró una DC o una DG. Estos animales fueron inoculados en la semana 15 de dieta con células TRAMP-C1 sin modulación de la expresión de CTBP1. Luego de aproximadamente 8 semanas se sacrificaron los animales y se colectaron muestras de tumor, pulmón y sangre para su análisis posterior. Estos animales representaron una condición más aproximada al estado de SM ya que presentaban alteración de colesterol, glucosa en ayunas, esteatosis hepática, aumento de estradiol y sobrepeso. A su vez, presentaron un aumento del tejido adiposos gonadal y mesentérico. En cuanto al volumen tumoral, el SM incrementó de manera significativa el crecimiento de los mismos así como la expresión de CTBP1 que fue acompañada de una disminución en la expresión de E-cadherina (CDH1). En cuanto al microarreglo de miRNAs, validamos un grupo de miRNAs vinculados al proceso de adhesión celular. Además, detectamos por RT-qPCR 4 miRNAs en el plasma de ratones NSG xenotransplantados, de los cuales el miR-30b-5p se encontraba significativamente disminuido en la circulación de animales con SM e inoculados con células con expresión control de CTBP1. Finalmente nos abocamos al análisis de los miRNAs circulantes como biomarcadores en muestras de plasma de pacientes enrolados en 2 centros de salud de la Provincia de Buenos Aires. Los pacientes con CaP, vírgenes de tratamiento, fueron divididos en subcategorías de acuerdo al grado de Gleason de sus tumores y si presentaban o no parámetros relacionados con el SM. Por otro lado se colectaron muestras de pacientes con hiperplasia prostática benigna (HPB) y voluntarios sanos. Estos 2 grupos también fueron subdivididos en individuos que presentaban parámetros asociados al SM e individuos que no. Afortunadamente pudimos encontrar varios candidatos a ser estudiados en el futuro como posibles biomarcadores de CaP asociado a SM. En resumen en este trabajo de tesis se describe por primera que CTBP1 disminuye la adhesión celular, favoreciendo un fenotipo mesenquimal y pro-invasivo y que desempeña un rol crucial en la progresión del CaP desde el tumor localizado hasta la metástasis. Siendo esto mediante la regulación génica tanto de forma directa, en su rol de co-represor transcripcional, como a través de los miRNAs que comanda. Por último, comenzamos la etapa exploratoria en la búsqueda de biomarcadores de CaP asociado a SM, desarrollando las herramientas necesarias para la detección de miRNAs en plasma de pacientes y estableciendo las bases que nos permitirán encontrar miRNAs candidatos a ser analizados minuciosamente en el futuro como biomarcadores.

Las endotelinas (ET) son moléculas con importantes funciones en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. Sus roles fueron analizados tanto en colon normal como en el patológico, incluyendo además el estudio de los péptidos natriuréticos (NP) ANP y CNP. ET-1 es la principal isoforma en el colon distal, mientras que la ET-2 predomina en el segmento proximal. El principal receptor de endotelinas es ETB, localizado principalmente en los núcleos de células de la mucosa. El receptor ETA exhibe niveles débiles de expresión génica aunque presenta una amplia localización. Los resultados revelaron que tanto las ET como los NP exhiben una distribución que permite postular que estarían involucrados en el mantenimiento de las propiedades mecánicas de las criptas de colon. Para la inducción del cáncer colorrectal murino (CCR), se utilizaron azoximetano y sulfato de sodio dextrano. Las muestras se tomaron en la cuarta, octava, decimosexta y vigésima semana. La progresión tumoral, generada principalmente en el colon distal, se observó mediante técnicas histológicas. Además, se utilizó microscopía de generación de segundo armónico, para analizar la disposición de las fibras de colágeno en la matriz extracelular. En el CRC, el hallazgo más relevante es la remisión temprana de la expresión de ET-2 en el colon distal. Aunque ET-1 no mostró modificaciones relevantes, hubo un aumento en la expresión de ETA y una disminución del receptor de depuración, ETB, que podría potenciar la actividad de ET-1. El CNP mostró aumentos sostenidos en su expresión, lo que sugiere que podría actuar contrarrestando los roles de las ET.

El glucógeno es un polisacárído de α-D-glucosas altamente ramificado que se encuentra en distintos tipos celulares, desde bacterias a células humanas. El glucógeno tiene por función actuar como reservorio de glucosas. Sus uniones glucosídicas son α(l—)4) α(l—->6). Su estructura altamente ramificada le confiere alta solubilidad. Esta característica le posibilita almacenar grandes cantidades de glucosa, fácilmente movilizable en caso de ser requerida por el organismo y, a la vez ejercer una presión osmótica muy pequeña en comparación con la que ejercería la misma cantidad de moléculas de glucosa en estado libre. El músculo esquelético y el hígado son los tejidos donde se encuentra acumulado la mayor parte del glucógeno. En el músculo esquelético, el glucógeno es un substrato energético sumamente importante para la actividad muscular. Las características bioquímicas y las propiedades enzimáticas de las enzimas involucradas en la síntesis de novo del glucógeno fueron analizadas en los dos tipos de fibras de músculo esquelético (de contracción rápida y de contracción lenta). La concentración de glucógeno fue significativamente más elevada en el músculo de fibras rápidas (EDL) que en el músculo de fibras lentas (Soleus), pero el Soleus a diferencia del EDL, contenía una gran cantidad de moléculas intermedias, aceptores endógenos de tamaño molecular intermedios, capaces de actuar como sustrato de la Glucógeno Sintetasa. Cabe destacar que las actividades enzimáticas de las proteínas involucradas en la síntesis de novo del glucógeno en músculos EDL fueron muy fuertemente estimuladas en presencia de Glc-6-P, mientras que la presencia de este azúcar no fue capaz de modificar la actividad enzimática de las proteínas de músculo Soleus. El ejercicio en el músculo esquelético es uno de los estímulos fisiológicos más importantes para la síntesis de glucógeno. Resultó de interés examinar el efecto de la estimulación muscular crónica en músculos de fibras rápidas. Mediante este estudio fue posible hallar que la actividad contráctil no sólo afecta la concentración de glucógeno muscular, sino que también altera su estructura. Además, el ejercicio intenso y continuo fue capaz de alterar las actividades relacionadas con la biogénesis del glucógeno muscular. Adicionalmente, luego de un estímulo prolongado o luego de un estímulo seguido de reposo fue posible encontrar el fenómeno de supercompensacíón de glucógeno. Este fenómeno se caracteriza por un gran incremento de la concentración de glucógeno muscular, más allá de los valores hallados para músculos en buenas condiciones nutricionales y en reposo. Junto con este fenómeno, el metabolismo de los músculos EDL sometidos a este tipo de tratamiento, presentó una acumulación de propia de músculo Soleus. Como resultado de los datos presentados en este trabajo, se propuso un modelo que explica los pasos involucrados en la síntesis de novo del glucógeno de músculo esquelético de contracción rápida. En el hígado, donde el glucógeno se acumula como reserva de glucosa para tejidos extrahepáticos, las enzimas del metabolismo del glucógeno poseen propiedades que le permite al hígado actuar como sensor de los niveles de glucosa plasmática, y de esta manera, almacenar o movilizar dicho polisacárido de acuerdo con las necesidades periféricas. Por los tanto, el metabolismo del glucógeno hepático es muy importante en la homeostasis de la glucosa. A partir de hígado de rata, la Glucogenina, la proteína iniciadora del glucógeno fue parcialmente purificada y bioquímicamente caracterizada. En líneas de células de hepatoma (HUH-7; HepG2) se estudió la regulación de la síntesis del glucógeno y de las enzimas asociadas a su metabolismo. Las enzimas de estas células mostraron muchas de las características bioquímicas propias de las enzimas de hígado de rata. Por tal motivo, estas líneas de células de hepatoma humano representaron un modelo apropiado para el estudio de la síntesis de novo del glucógeno hepático. En experimentos orientados a develar las bases moleculares de la regulación de las enzimas involucradas en la síntesis de novo del glucógeno hepático, fue posible observar que tanto el suero como la insulina y la glucosa fueron capaces de incrementar la síntesis del glucógeno. Esta estimulación fue producida por un incremento en la actividad transcripcional y en la actividad enzimática de las proteínas involucradas en esta ruta metabólica (Glucogenina, Glucógeno Sintetasa). Por el contrario, el glucagon, el HGF y el TGF-β produjeron un descenso del contenido del glucógeno acumulado mediante principalmente la inhibición de las actividades enzimáticas involucradas en su síntesis o alterando la relación síntesis/ degradación del polisacárido. La Enzima Ramificante no mostró ningún tipo de alteración a nivel transcripcional ni en su actividad enzimática frente a la presencia de estos factores o nutrientes.