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La gran persistencia de los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) en el medio ambiente, particularmente en suelo, hace necesario que se planteen estrategias para lograr la remoción de manera eficiente, afectando mínimamente la calidad del suelo. En base a lo expuesto, se plantean las siguientes hipótesis y objetivos: Hipótesis: - La aplicación de oxidantes en suelos contaminados con PAH, manteniendo la humedad normal de estos suelos, logra la degradación de estos contaminantes. - La degradación de los PAH es más rápida cuando se utilizan procesos de oxidación química en reactores batch (en una relación suelo:agua 1:2). - La optimización de las condiciones experimentales (concentración de oxidantes, agregado de oxidante en etapas sucesivas, uso de activantes, uso de surfactantes, entre otras) aumenta la eficiencia del proceso. - Las características físicas, químicas y biológicas del suelo condicionan la selección del método de degradación más efectivos. Objetivos: El objetivo general del presente trabajo de tesis es estudiar la aplicación de oxidantes químicos en el tratamiento de suelos contaminados con PAH. Para ello se plantean los siguientes objetivos específicos: - Evaluar la eficiencia de tres oxidantes químicos (persulfato, peróxido de hidrógeno, y permanganato) sobre la eliminación de PAH de suelo contaminado comparando los resultados obtenidos con los de un reactor biótico (sin el agregado de oxidante). - Estudiar el efecto de distintos porcentajes de humedad en el suelo: normal de la zona (24,9 %), 36,5 % y condiciones saturadas en reactores batch. - Optimizar las condiciones experimentales de la aplicación de oxidantes considerando tanto la eficiencia en la eliminación de los PAH como la calidad del suelo tratado. - Encontrar los parámetros relevantes para la elección de un tratamiento por oxidación química según las características principales del suelo a remediar.

La actividad petrolera en nuestro país genera grandes volúmenes de residuos que impactan negativamente en suelos, agua y aire. Estos residuos se depositan como barros oleosos en los fondos de tanques de almacenamiento de crudo y se generan en grandes cantidades en la etapa final de su refinación, en separadores gravitacionales API (American Petroleum Institute). Los barros oleosos son considerados residuos peligrosos según la normativa vigente en Argentina, la cual exige tratamiento previo a su disposición final. En este contexto, la presente tesis tuvo como objetivo general remediar matrices sólidas complejas contaminadas con un barro petroquímico proviene del fondo de pileta API (FP), utilizando procesos combinados de oxidación química y bioaumento con un hongo ligninolítico. Para el desarrollo de la presente tesis se utilizó persulfato de amonio (PSA) como oxidante y al hongo ligninolítico Coriolopsis rigida LPSC 232. Es conocida la habilidad de este hongo para degradar hidrocarburos alifáticos y aromáticos provenientes del petróleo o suelos contaminados, involucrando complejos sistemas oxidativos que incluyen a enzimas extracelulares, siendo necesario que los contaminantes están biodisponibles. El pretratamiento con PSA tuvo la finalidad de oxidar los compuestos orgánicos presentes en los barros, a especies químicas eventualmente menos tóxicas con mayor solubilidad y biodisponibilidad. Por lo que la aplicación de estrategias combinadas potenciaría las ventajas de las técnicas individuales a fin de minimizar sus limitaciones. Inicialmente el barro FP fue caracterizado en función de sus propiedades físicas, químicas, microbiológicas y toxicológicas, revelando un efecto fitotóxico con una alta concentración de hidrocarburos totales (HT), representada principalmente por resinas. La abundancia relativa de representantes del phylum Proteobacteria, con miembros reconocidos degradadores de hidrocarburos sugiere la existencia de una microbiota bacteriana con un potencial metabólico para la degradación. La aplicación del PSA sobre el barro FP redujo un 31±5% el contenido de HT, actuando principalmente sobre la fracción de resinas, acompañado de la disminución de la concentración bacteriana. El análisis taxonómico (secuenciación masiva del gen 16S rARN) reveló la selección de representantes del orden Pseudomonadales, con miembros potencialmente degradadores de hidrocarburos, y representantes de Lactobacillales, reconocidos como generalistas. El impacto negativo también fue evidenciado sobre la comunidad fúngica nativa, con la consecuente dominancia de representantes del género Penicillium (Eurotiales). Dicho efecto indicaría que el pretratamiento con PSA reduce las posibilidades de competencia de la biota nativa con el inoculante fúngico. Paralelamente se evaluó la habilidad del hongo candidato para tolerar y/o transformar hidrocarburos modelos y del barro FP antes y después de la oxidación. Los resultados demuestran que C. rigida LPSC 232 posiblemente a través de procesos cometabólicos, tiene capacidad de tolerar bajo ciertas condiciones determinados PAH, incluyendo los más complejos disponibles en el barro FP. Bajo ciertas condiciones, se comprobó que hidrocarburos específicos alteran los procesos de glucólisis y la síntesis de ácidos grasos por el hongo, así como su habilidad para remover y/o mineralizar compuestos tóxicos. Bajo condiciones de fermentación en estado sólido se evidenció la capacidad fúngica de mineralizar componentes del barro FP, sin alterar la actividad de los microorganismos autóctonos del residuo. Sobre un suelo contaminado con barro FP al 10%, LPSC 232 removió eficientemente HT en presencia de la microbiota nativa luego de 90 días, disminuyendo su fitotoxicidad respecto del tratamiento control. En sistemas con barro FP al 25%, la estrategia de inoculación de LPSC 232 condicionó el alcance del proceso, siendo prometedor la aplicación de una suspensión miceliar en adición a un sustrato lignocelulósico en comparación a la utilización de este último como un simple vehículo de inoculación. Se sugiere que esto puede tener relación con los niveles de actividad lacasa detectados en los sistemas de estudio. Se comprobó que el tratamiento combinado de oxidación del barro FP seguido de bioaumento con C. rigida LPSC 232 promueve la recuperación de las comunidades bacterianas y fúngicas nativas del sistema. Además de generar cambios sobre los hidrocarburos del barro FP luego de 60 días, asociados a la formación de quinonas y a la desorganización de los núcleos aromáticos. Dichos cambios fueron evidenciados tempranamente en presencia de la microbiota nativa. De esta manera se demuestra que C. rigida LPSC 232 genera cambios en la microbiota asociada a matrices contaminadas con un barro FP API y promueve una activa degradación de hidrocarburos. No obstante, el proceso de remediación de una matriz contaminada como un barro FP es complejo, siendo aún necesarios estudios adicionales para confirmar la eficiencia del bioaumento a posteriori del tratamiento con un oxidante químico.

La contaminación en suelos por metales pesados, en particular por plomo, es una problemática ambiental de gran importancia; la movilidad y biodisponibilidad de dicho contaminante es fuertemente dependiente de los componentes bióticos y abióticos del suelo. Debido a la importancia toxicológica que la contaminación de Pb reviste en nuestro país, en esta tesis se propone analizar la interacción de este metal con los componentes del suelo y su posible remediación con plantas. Por lo tanto, los objetivos generales del presente trabajo son la determinación de la especiación del metal y su interacción con los componentes del suelo, y el estudio sobre la capacidad de acumulación del metal por parte de una planta de cultivo (Brassica napus, colza), analizando el efecto de dicha planta sobre la especiación del metal. En el estudio sobre la especiación química del metal en el suelo y su evolución temporal, se observó que el Pb se asocia rápidamente con las fracciones minerales, quedando una muy baja fracciónn en forma soluble e intercambiable al cabo de 60 días, que es en principio la fracciónn biodisponible. Luego, mediante el cultivo de Brassica napus en suelos con agregado de Pb reciente y otro con contaminación consolidada por Pb, se analizó la interacción e influencia de la rizosfera en la especiación del metal. El efecto resultó en una mayor concentración de Pb en la zona rizosférica del suelo con contaminación reciente, particularmente en la fracción mineral, y en la permanencia de fracciones intercambiables de Pb en la etapa de fructificación de la planta. En la madurez fisiológica de B. napus, no se detectó contenido de Pb en la fracción intercambiable. Brassica napus resultó ser una especie acumuladora de Pb en suelos con contaminación reciente. Se cuantificó su concentración en hojas, resultando mayor en hojas jóvenes y en granos. Se observaron efectos negativos en la ultraestructura celular (particularmente cloroplastos), y en el contenido de foto pigmentos, los cuales se cuantificaron exitosamente mediante metodos no invasivos. Aun así, no se observo un efecto negativo en su desarrollo fenológico. EN suelos con contaminación consolidada, no se detectó contenido del metal en los organos estudiados de B. napus. Se concluye entonces que la presencia de Pb recientemente incorporado al suelo resulta en la acumulación del metal por Brassica napus, mientras que si el metal ha permanecido en el suelo previamente sembrado, este no se encuentra disponible para la planta debido a que este evoluciona hacia formas químicas mas estables, no biodisponibles.

Las cepas de Bacillus sphaericus 2362 (cepa de referencia), C7 y C11 (nuevos aislamientos) todas pertenecientes al grupo IIA, son entomopatógenas contra larvas de mosquitos. Además de las envolturas habituales de bacterias Gram positivas, estas cepas están recubiertas de una capa externa de una estructura proteica cristalina: la capa S o Surface layer (S-layer) que estaría asociada un polímero secundario de pared (SWCP). En las 3 cepas se observa que la proteína S-layer tiene un PM de aproximadamente 125 kDa y que es reconocida por el mismo anticuerpo. Tratamientos con LiCl, que remueven la S-layer sin afectar la viabilidad, permitieron observar que en esa condición estas células (carentes de S-layer) crecen más lentamente que las células con S-layer y que en medios hipersalinos solo crecen al recuperar S-layer. El análisis por western blot con un anticuerpo anti S-layer de la cepa 2362, mostró que en las células tratadas la síntesis de S-layer se inició muy temprano durante el crecimiento bacteriano. Las modificaciones en tamaño, concentración, ubicación (fijadas a membrana, asociada a esporas, o libres en el sobrenadante) en función de las etapas de su crecimiento y de las condiciones de estrés hiperosmótico (altas concentraciones de NaCl), nos indican posibles modificaciones postraduccionales, siendo la glicosilación la más frecuentemente reportada. Los resultados de agregación de cultivos y tinción con azul de bromo-timol fueron contradictorios respecto a la presencia de glicosilación cuando se comprarn con los de tinción empleando un kit comercial que distingue proteínas glicosiladas. Se discuten distintas posibilidades: Oglicosilación no enzimática, desprendimiento de la S-layer con el SWCP. Por otro lado se exploraron dos funciones importantes que estas proteínas aportarían a la bacteria: bioabsorción de metales y actividad mosquitocida. Distintas especies de Bacillus han sido involucradas en la asociación con metales como bioadsorbentes, pero hasta el momento no hay un claro entendimiento de las propiedades quelantes. Con ese objetivo, se analizó la capacidad de bioadsorción de cobre en cultivos y esporas de bacterias Gram positivas de especies que producen o no S-layer. Sólo aquellas cepas provistas de S-layer, como Bacillus sphaericus y B. thuringiensis, mostraron una bioadsorción significativa tanto en cultivos como en esporas. Esta capacidad (cercana al 50%) se retuvo luego de un proceso de calentamiento suave de los cultivos, indicando que elementos estructurales de la envoltura son los responsables de esta propiedad. Las S-layer purificadas de dos cepas de Bacillus sphaericus mantuvieron la capacidad de bioadsorber cobre mostrando que la propiedad está directamente asociada a ellas. Se determinaron los parámetros de bioadsorción para la cepa B. sphaericus 2362 que responden al modelo de Langmuir. Tanto la afinidad como la capacidad de bioadsorción fueron comparables con otros bioadsorbentes de origen bacteriano. Se observó un efecto competitivo de Ca2+ y Zn2+, aunque no de Cd2+, lo que indicaría que esta proteína podría retener otros metales además de cobre lo que explicaría su persistencia en ambientes contaminados. La utilización del anticuerpo anti-S-layer permitió determinar que la S-layer permanece adherida a la espora y que sólo las esporas sin lavados intensivos (que eliminan la Slayer) captan eficientemente el cobre. Por primera vez se mostró una correlación directa entre el contenido de S-layer y la capacidad de bioadsorción. Esta capacidad está ligada a la retención de las S-layer adheridas a las células y esporas de Bacillus. Algunas cepas de Bacillus sphaericus son tóxicas para larvas de mosquitos, y sus propiedades insecticidas se deben principalmente a la inclusión cristal que se produce durante la esporulación. Se inspeccionó la actividad insecticida de las S-layer de las cepas 2362 y C7. Se encontró que las S-layer per se muestran actividad contra larvas de Culex. En experimentos con preparaciones de espora-cristal tóxicas en conjunto con la S-layer, se observó un efecto sinérgico aportado por esta proteína. La S-layer de la cepa C7 en particular aumenta el rango de huésped hacia mosquitos del género Aedes para los cuales B. sphaercius no es eficiente. Los análisis in silico de la estructura de la Slayer muestran un motivo con actividad hemolítica que fue confirmado por experimentos realizados in vitro. Esta actividad explicaría los resultados de toxicidad de las S-layer.

Tesis de Maestría