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El cáncer colorrectal (CCR) es una enfermedad frecuentemente letal con pronóstico y respuesta al tratamiento heterogéneos. Estas diferencias residen en las características moleculares intrínsecas de los tumores. Los pacientes con cáncer de recto (CR) avanzado reciben radio-quimioterapia (RQT) neoadyuvante con 5-Fluorouracilo (5Fu) como principal droga utilizada, seguida de cirugía y quimioterapia adyuvante. Un grupo de pacientes presenta una respuesta patológica completa al tratamiento neoadyuvante, mientras que un significativo grupo no obtiene una respuesta favorable. La vía del UPR se encuentra activa en tumores colorrectales y se ha demostrado que su activación confiere quimiorresistencia a células tumorales. En estudios previos de nuestro grupo, se demostró que RHBDD2 se sobrexpresa en estadios avanzados del CCR, se induce frente al tratamiento con 5Fu y se asocia a la vía del UPR. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la sobreexpresión de RHBDD2 en los estadios avanzados del CCR podría afectar la regulación de la vía del UPR dando lugar a un fenotipo celular quimiorresistente. En la presente tesis, demostramos que la sobreexpresión de RHBDD2 en la línea celular CACO2 confiere resistencia al tratamiento con 5Fu, favorece la migración, la adhesión y la proliferación celular. Además, tiene un profundo impacto en la expresión de los genes del UPR: BiP, PERK y CHOP, y en los genes de adhesión FAK y PXN. Mediante inmunoprecipitación, observamos que RHBDD2 se une a BiP, la chaperona principal del UPR. En tumores de recto, se determinó que aquellos que mantienen alta expresión de RHBDD2 luego del tratamiento neoadyuvante se asocian al desarrollo de metástasis local o a distancia. Estos resultados en conjunto posicionan a RHBDD2 como un biomarcador pronóstico prometedor para predecir la respuesta a la RQT en pacientes con CR.

En el presente trabajo de tesis se estudió la genética y bioquímica del glutatión en Rhizobium tropici y su relación con la protección frente a estreses ambientales. En nuestro laboratorio previamente se había aislado un mutante GshB‘ de esta bacteria, caracterizado por su sensibilidad a la acidez. En este trabajo se clonó y caracterizó el gen gshB (que codifica para la glutatión sintetasa) salvaje y su región adyacente. Mediante la construcción de fusiones transcripcionales y traduccionales se determinó que la expresión de este gen es independiente de los marcos de lectura contiguos. Asimismo, se encontró que este gen se activa en condiciones de acidez respondiendo a la demanda de mayores niveles de glutatión provocada por la acidificación. Al estudiar los niveles de potasio se observa que la cepa mutante en el gen GshB no aumenta su nivel de potasio interno luego de una acidificación, a diferencia de la cepa salvaje. Se obtuvieron mutantes en un gen que codifica para una proteína de un canal Kef (de eflujo de potasio regulado por el glutatión) de R. tropici, los cuales se caracterizaron. Los estudios que hemos realizado utilizando agentes inductores para canales Kef nos permiten concluir que probablemente exista más de un canal de tipo kef en esta bacteria. Por otra parte, se demostró que la mutación en el gen gshB no modifica la expresión de proteínas de shock ácido inducidas por esta bacteria. Asimismo, se estudió que el glutatión es necesario para la protección frente al estrés oxidativo, posiblemente a través de un mecanismo mediado por un regulador el tipo OxyR de Escherichia coli. Se demsotró que en R. tropici, el glutatión no está implicado en la protección frente al ayuno de nutrientes. Además, se demostró que un mutante GshB’ de Sinorhizobium meliloti 1021, seleccionada por ser una cepa intrínsecamente sensible a los estreses ambientales, el glutatión ejerce un efecto protector frente a dichos estreses, similar a lo observado en R. tropici. Por último se demostró que el glutatión es necesario para el mantenimiento de una simbiosis efectiva en poroto común, protegiendo al nódulo de la senescencia temprana.

La ritmicidad comportamental en Drosophila es sostenida por una red neuronal que en el cerebro adulto comprende alrededor de 150 neuronas. Entre éstas, las sLNv han demostrado ser esenciales para el control de la actividad rítmica. Desde el punto de vista circadiano, las sLNv tienen dos características sobresalientes: expresan el neuropéptido PDF, y atraviesan cambios estructurales circadianos en sus terminales axonales, proceso denominado plasticidad estructural. En esta tesis estudiamos qué otros cambios ocurrían concomitantes con la plasticidad estructural. Encontramos que ésta es acompañada por aumentos en el número de sinapsis y disponibilidad de vesículas en momentos de mayor complejidad del árbol axonal, que luego caen durante la fase de menor complejidad. Además demostramos que la plasticidad estructural depende de los niveles de PDF y a raíz de este análisis descubrimos un nuevo rol para PDF durante el desarrollo de las sLNv. La arquitectura adulta de las sLNv necesita que PDF actúe sobre su postsinapsis temprano en el desarrollo larval, proceso que requiere su receptor canónico. Sin embargo, la ausencia de PDF produce defectos presinápticos evidentes luego de la metamorfosis. Comprobamos que previo a la metamorfosis la postsinapsis libera GBB, quien actúa como señal retrógrada sobre las sLNv y promueve el correcto desarrollo del circuito. La ausencia de cualquier componente de la vía de GBB genera defectos semejantes o peores a la ausencia de la vía de PDF. De esta manera revelamos un nuevo mecanismo que provee un “marcado” temprano de blancos sinápticos que guiarán más tarde en el desarrollo el refinamiento neuronal presináptico.

El exceso de andrógenos es uno de los desórdenes endocrinos más frecuentes en mujeres en edad reproductiva y está fuertemente asociada a una reducción en la fertilidad o a infertilidad. En mujeres con esta condición, la administración de glitazonas (como la pioglitazona o rosiglitazona) mejora el perfil androgénico y la función ovárica. La pioglitazona ejerce su acción actuando como ligando del receptor nuclear activado por proliferadores peroxisomales gama (PPARG). Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual el sistema PPARG regula la función ovárica. En este trabajo, en una primera etapa nos planteamos investigar cómo el exceso de andrógenos altera la función ovárica temprana. Encontramos que el hiperandrogenismo indujo una regulación negativa sobre el sistema PPARG y alteró el desarrollo folicular temprano, la vía de la esteroidogénesis folicular estableció un ambiente pro inflamatorio en ovario e incrementó el estrés oxídativo (EO) sistémico. En una segunda etapa nos propusimos investigar si la administración de un ligando de PPARG, la pioglitazona (PGZ,) modificaba o prevenía las alteraciones inducidas por el estado hiperandrogénico. Encontramos que la PGZ activó al sistema PPARG, evitando así la regulación negativa del hiperandrogenismo sobre el sistema PPARG. La activación de PPARG también previno las alteraciones del hiperandrogenismo sobre el desarrollo folicular temprano y la vía de esteroidogénesis folicular, sobre el estado proinflamatorio y sobre el EO sistémico. Colectivamente, nuestros resultados indican que la activación del sistema PPARG en ovario de animales expuestos al exceso de andrógenos mejora la función ovárica temprana, ya que previno las alteraciones sobre la esteroidogénesis folicular, el estatus inflamatorio del ovario y el balance oxídativo sistémico.

Tesis para obtener el grado de Doctor en en Ciencias Biológicas presentado en la Universidad Nacional de Río Cuarto, en marzo 2019

El cáncer hematológico es un grupo de enfermedades que afectan elnormal funcionamiento de las células sanguíneas. Al igual que otros tipos decáncer, sus células presentan inmortalidad replicativa, inestabilidad genómica,alteraciones en el metabolismo, capacidad de invadir otros tejidos y de evadir larespuesta inmune. La susceptibilidad al cáncer, su desarrollo y progresióndependen tanto de factores genéticos como ambientales.Los procesos de metabolización y detoxificación de sustancias endógenasy exógenas son llevados a cabo por un conjunto de familias de enzimasmetabolizantes de xenobióticos (EMX). Tanto las variantes alélicas en losgenes metabolizantes de xenobióticos (GMX), como los niveles de exposición alos sustratos de estas enzimas, pueden impactar en la susceptibilidad alcáncer. De hecho, polimorfismos en los GMX se encontraron asociados adiversos tumores.La fisiología rítmica con una periodicidad cercana a las 24 horas estácoordinada, en los mamíferos, por un reloj central localizado en los núcleossupraquiasmáticos (NSQ) del hipotálamo, cuya función es mantener unahomeostasis diaria en los procesos vitales. También existen relojes circadianosen muchos órganos periféricos. Los genes reloj (aquellos implicados en elfuncionamiento del reloj circadiano) actuarían como supresores de tumores através de su participación en la proliferación celular, la apoptosis, el control delciclo celular y la respuesta al daño al ADN; variantes alélicas en estos genes seasociaron a distintos tipos de cáncer. Además, la Organización Mundial de laSalud clasificó al trabajo en turno rotativo con disrupción del ritmo circadianocomo factor de riesgo para el cáncer. En relación al sistema de metabolización,la manera en que funciona el reloj circadiano es fundamental para definir larespuesta individual frente a la exposición a xenobióticos, en tanto las EMX seencuentran bajo el control del marcapasos circadiano.El objetivo general de este trabajo fue estudiar la relación entre el sistemacircadiano, el sistema de metabolización de xenobióticos, los hábitos deconsumo y la funcionalidad del paciente, en el riesgo de cáncer y el desarrollotumoral. Para ello, se analizaron los patrones de expresión de genes reloj yGMX en un modelo animal de tumorigénesis, bajo condiciones normales o dedesincronización circadiana. Por otro lado, se evaluó la asociación entre lasenfermedades onco-hematológicas (EOH) y variantes alélicas de estos mismosgenes, hábitos dietarios, tabaquismo y funcionalidad del paciente, a través deun diseño caso-control.Para el modelo animal, se utilizaron ratones C57BL/6, inoculados con unalínea celular tumoral de melanoma y sus respectivos controles, sometidos acondiciones normales de luz-oscuridad (LD, light-dark, 12h:12h) o a unprotocolo de desincronización forzada por jet lag crónico (JL, consistente en unavance de 6 h en el ciclo LD, cada dos días). Utilizando RT-qPCR, se midióexpresión relativa de ARNm de los genes reloj Bmal1, Per1 y Per2, y de losGMX Gstt1, Nat1 y Cyp1a1, en tejido proveniente de los NSQ, hígado y tumor.Respecto de Bmal1, los resultados obtenidos bajo condiciones de iluminaciónnormales, tanto en animales sanos como con tumores, fueron los esperadossegún la bibliografía, ya sea en NSQ como en hígado; sin embargo este patrónde expresión se perdió en los animales bajo JL. Cyp1a1 presentó menorexpresión en tejido hepático de animales con tumor bajo LD, respecto de losanimales sanos en igual condición de luz. Este mismo gen mostró un patrón deexpresión diferencial en tejido hepático de animales con tumor bajo JL. Per1 yPer2 mostraron marcadas reducciones en sus niveles de expresión diurna alevaluar el tejido tumoral bajo JL, respecto del mismo tejido en animales bajoLD. Podría inferirse que: 1) el solo desarrollo de un tumor no es capaz deafectar el reloj central y hepático, al menos bajo las condiciones evaluadas; 2)niveles disminuidos de Per en el tumor se relacionan a su posible rol supresorde tumores, y 3) el tumor extra-hepático en condiciones desincronizadas podríamodificar la expresión de GMX en el hígado, a través de la desincronización delsistema inmune, favoreciendo el desarrollo tumoral.El diseño caso-control incluyó 125 casos (pacientes con leucemia, linfomay mieloma) y 310 controles, concurrentes al Hospital Interzonal General deAgudos Prof. Dr. Rossi (La Plata, Buenos Aires). Se tomaron muestras desangre y se les realizó una encuesta a los participantes, previo consentimientoinformado. A partir del cuestionario, se obtuvieron datos socio-demográficos einformación sobre hábitos de vida (tabaquismo, consumo de alcohol y café,ingesta de carnes asadas y alimentos enlatados), funcionalidad del paciente(cambios en el peso, en el apetito y en el humor, cansancio físico o mental,cansancio al despertar, y calidad del sueño, entre otros) e historia de laenfermedad. Se evaluaron el polimorfismo de longitud del gen reloj PER3 (4 o 5repeticiones de 54 pb) mediante PCR, las deleciones de los GMX GSTT1 yGSTM1 mediante PCR multiplex, y los alelos T/C de CYP1A1*2A (polimorfismoMspI) mediante PCR-RFLP, con posterior visualización en geles de agarosa.Los análisis estadísticos se realizaron con STATA 11.1. Los genotipos dePER3 4/5 + 5/5 se asociaron a un aumento en el riesgo de leucemia (OR=1.99,p=0.032). Además, los pacientes oncológicos con estos genotipos expresaronroncar más y sentir mayor fatiga al despertar. La variable ?cambios en elhumor? también se asoció significativamente al cáncer hematológico. Lasvariantes en los GMX no mostraron asociación alguna con las EOH evaluadas.El consumo de carnes asadas 3 o más veces/mes y el consumo diario de cafése asociaron significativamente a un aumento en el riesgo de enfermedad(OR=1.72, p=0.02 y OR=1.77, p=0.03, respectivamente). El polimorfismo dePER3 podría tener un rol en el riesgo de leucemia, y podría ser un marcador delas diferencias individuales en el sueño y la vulnerabilidad a su disrupción.Respecto a los hábitos dietarios de consumo de carnes asadas y café, nuestroestudio proporciona datos novedosos relacionados a la etiología de las EOH para nuestra población.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Histología y Embriología de Mendoza "Dr. Mario H. Burgos". Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo. Mendoza -Universidad Nacional de Córdoba. 2015 - 180 h. + CD. tabls.; figuras.: grafs. Contiene Referencia Bibliográfica y Publicaciones Científicas Asociadas a la Tesis. Abstract en español e inglés.

La extinción de la memoria es el proceso en el cual la respuesta condicionada disminuye gradualmente ante las repetidas presentaciones del estímulo condicionado (CS). Una gran cantidad de teorías plantean que la extinción es un aprendizaje nuevo que compite por la expresión de la respuesta comportamental adquirida durante el condicionamiento inicial. Se concluye entonces que la extinción está basada en la generación de una segunda asociación de carácter inhibitorio entre las representaciones del estímulo condicionado y el estímulo incondicionado (US). El objetivo principal de esta Tesis fue estudiar el rol de neurotransmisor GABA en las distintas fases de la memoria de extinción en Neohelice granulata. Primeramente se desarrollo un nuevo paradigma comportamental en el cangrejo Neohelice que denominamos condicionamiento contextual Pavloviano (CCP). Se estudiaron las características asociativas básicas de este nuevo paradigma, y en particular se analizaron las características paramétricas necesarias para inducir la formación de la memoria de extinción. Utilizando este nuevo paradigma, se analizo el rol del sistema GABAérgico sobre la adquisición, consolidación y expresión de la memoria de extinción. Proponemos un rol diferencial del sistema GABAérgico sobre la adquisición de la memoria de extinción dada su naturaleza inhibitoria. En este sentido, encontramos que una baja actividad GABAérgica sería necesaria para la consolidación de la extinción, pero que un elevado tono GABAérgico sería necesario para la adquisición y expresión de esta memoria. Luego, para caracterizar la distribución del neurotransmisor GABA y los receptores de GABAA en el sistema nervioso central (SNC) de Neohelice, en primer término se realizó un esquema neuroanatómico del SNC, y se diseñaron mapas detallados de neuropilos y clusters neuronales del cerebro. Se evaluó la presencia y localización de los receptores de GABAA realizando técnicas inmunohistoquímicas y ensayos de Western blot. Se demostró que están ampliamente distribuidos, y se detecto la presencia de las subunidades tipo α3 y β2/3. En su conjunto, estos resultados nos permitirán estudiar las posibles modificaciones plásticas sufridas por el sistema GABAérgico como consecuencia de la ocurrencia de las distintas fases de la memoria.

Los progenitores neurales generan todas las neuronas del sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario -proceso conocido como neurogénesis-, manteniéndose algunos nichos neurogénicos activos en el cerebro adulto. Es necesaria una regulación precisa de la neurogénesis, para el correcto funcionamiento del sistema nervioso, debido a que fallas en este proceso están asociadas al desarrollo de diversas patologías. La transición desde un estado multipotente y proliferativo de los progenitores a un estado de diferenciación neuronal, está estrictamente regulada por diferentes programas moleculares intrínsecos y factores extrínsecos. Entre estos últimos, los factores neurotróficos cumplen roles cruciales para el desarrollo, el mantenimiento y la sobrevida de diferentes poblaciones neuronales. El factor neurotrófico derivado de la glía, GDNF (del inglés, Glial Derived Neurotrophic Factor), fue originalmente descripto por su capacidad de promover la sobrevida de neuronas dopaminérgicas, aquellas afectadas en la enfermedad de Parkinson. GDNF señaliza a través de GFRα1, una proteína anclada a membrana por un dominio glicosil-fosfatidilinositol, en complejo con el receptor canónico Ret, o la molécula de adhesión neural, NCAM. El objetivo general de la presente tesis consistió en identificar y analizar nuevas funciones de GDNF y sus receptores durante la proliferación y diferenciación de progenitores neurales, tanto embrionarios como adultos. En la primera sección de la tesis se estudió el rol del sistema GDNF y su receptor GFRα1 durante el desarrollo de la corteza cerebral. El análisis de la expresión de GFRα1 durante el desarrollo indicó que GFRα1 se expresa desde edades tempranas en la corteza, incrementando sus niveles en forma inversamente proporcional a los niveles de expresión del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos básico, bFGF (del inglés, basic fibroblast growth factor), un factor que promueve la proliferación de los precursores corticales. Se observó que los niveles de expresión de GFRα1 se correlacionan con la diferenciación neuronal. Ensayos utilizando precursores corticales aislados en cultivo demostraron que GDNF inhibe la respuesta de los precursores a bFGF, reduciendo los niveles de expresión de su receptor. De acuerdo con estos resultados, el análisis de animales transgénicos en los cuales la expresión de GFRα1 fue suprimida en precursores neurales, presentaron una reducción en la complejidad neurítica de neuronas corticales y un aumento durante el desarrollo del número de precursores en proliferación. En su conjunto, estos resultados evidenciaron que el sistema GDNF/ GFRα1 cumple un rol fisiológico clave durante el desarrollo cortical, permitiendo una correcta sincronización entre los eventos de proliferación y diferenciación celular de los progenitores neurales. Por otro lado, se estudió la función del sistema GDNF/GFRα1 en la neurogénesis adulta. Estudios de la expresión de GFRα1 demostraron que éste se encuentra altamente expresado en el giro dentado del hipocampo, un nicho neurogénico en el cerebro adulto. Utilizando ratones transgénicos en los cuales la expresión de GFRα1 fue suprimida en progenitores neurales del hipocampo adulto, se observó que aquellas neuronas deficientes para este receptor presentaron una complejidad neurítica menor que aquellas neuronas generadas en animales control. Estos animales presentaron además defectos en su comportamiento, evidenciando un rol fisiológico del sistema GDNF/ GFRα1 en el desarrollo, diferenciación e integración de las neuronas generadas en el hipocampo adulto. De esta manera, en este trabajo de tesis doctoral se han identificado nuevas funciones para GDNF y su receptor, GFRα1, relevantes en la regulación de la fisiología de los precursores neurales tanto embrionarios como adultos. Si bien existen diferencias entre ambas poblaciones celulares, el sistema GDNF/GFRa1 emergería como un sistema de regulación general involucrado en procesos de diferenciación neuronal.

Los ritmos circadianos, presentes en la gran mayoría de los seres vivos, consisten en oscilaciones en diversas variables fisiológicas, que ocurren con un período cercano a 24 horas. Estos ritmos están sostenidos por un reloj circadiano endógeno que, en mamíferos, se localiza anatómicamente en los núcleos supraquiasmáticos (NSQ) del hipotálamo. El reloj circadiano controla un gran número de procesos y funciones y, generalmente, existen mecanismos de retroalimentación que permiten que el oscilador sea ajustado por el estado de algunas de las variables que controla. Las funciones llevadas a cabo por el sistema inmunológico se encuentran bajo un estricto control del reloj circadiano, y, recientemente, se ha descripto que la activación del sistema inmune es capaz de alterar al oscilador circadiano. En este trabajo se evaluó la participación de TNF-α y su receptor (TNFR1) en la comunicación bidireccional entre los sistemas inmune y circadiano, utilizando diferentes modelos murinos de inflamación. En el primer capítulo, se utilizó un modelo de inflamación aguda causado por dosis bajas de lipopolisacárido (LPS) bacteriano, el cual produce alteraciones en el reloj circadiano solo cuando es administrado en la noche temprana. Por lo tanto se profundizó en el estudio de este efecto. Demostramos que este estímulo es capaz de inducir la activación de los NSQ, y los núcleos paraventriculares (NPV), y de aumentar los niveles de TNF-α en ambas regiones, y de la proteína reloj PER2 en NSQ. El efecto circadiano del LPS estaría mediado por TNFR1, cuyos niveles de expresión son máximos durante la noche temprana. Adicionalmente, se demostró que los animales deficientes de TNFR1 (TNFR1 KO) no muestran cambios de fase ni activación de los NSQ o NPV luego de la estimulación con LPS en la noche temprana. En el Capítulo 2, se estudió como el sistema circadiano puede alterar la respuesta inmune, utilizando un modelo de shock séptico inducido por la administración de dosis altas de LPS. Estudios previos de otros grupos demostraron que existe una variación diaria en la susceptibilidad al shock séptico: la misma dosis de LPS que es capaz inducir aproximadamente el 90% de la mortalidad en ratones al ser administrada hacia el final del día (ZT11), es compatible con la sobrevida si se administra durante la mitad de la noche (ZT19). Pero aún no se conocen los mecanismos subyacentes. En un principio, observamos una hipotermia más pronunciada en los animales inoculados con dosis altas de LPS a ZT11 en comparación con aquellos inoculados a ZT19, acompañada por una mayor activación neuronal en NSQ, NPV y área preóptica del hipotálamo. Posteriormente se demostró que este mismo efecto podía ser causado por la administración de suero de animales estimulados, a animales naive. La única molécula medida en suero que presentó diferencia diurna en su inducción fue TNF-α, cuyos niveles fueron más altos en animales inyectados a ZT11. Asimismo, este estímulo produjo un descenso en los niveles y activación de macrófagos peritoneales, siendo ambas cosas menores luego de la inoculación a ZT11; mientras que en bazo tanto el porcentaje como la activación de éstas células se incrementó con el tratamiento en este horario. Por otro lado, se demostró que los animales TNFR1 KO poseen una mayor supervivencia y desarrollan menor hipotermia en respuesta al LPS a ambos horarios. Por último, se observó que animales con desincronización circadiana no poseen diferencia diurna a la mortalidad inducida por dosis altas de LPS, aunque sí en la respuesta hipotérmica. Adicionalmente, los ratones inyectados a ZT11 presentaron niveles más altos de TNF-α en suero, comparados con sus controles. En conjunto, todos estos resultados nos permiten afirmar que realmente existe una interacción bidireccional entre los sistemas inmune y circadiano, y que por lo tanto, trastornos en uno de los dos pueden afectar el funcionamiento del otro. A su vez, es posible postular a la citoquina TNF-α como mediadora de dicha interacción.