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Las propiedades de flexibilidad y dinámica de las proteínas han sido desde hace tiempo asociadas a sus funciones biológicas. Estas propiedades han sido originalmente usadas para explicar la heterogeneidad de las propiedades de unión de la seroalbúmina bovina por Kurush en 1950 y su descripción formal fue incluida en el clásico modelo de Monod-Wyman-Changeux de regulación alostérica, también conocido como modelo de pre-equilibrio. Actualmente está bien establecido que la forma funcional de una proteína, normalmente conocida como el estado nativo, no es única. El concepto de “embudo” propuesto por Wolynes et al. en 1995 ha sido utilizado para explicar los canales de plegamiento de las proteínas considerando un “fondo de potencial rugoso” representando al conjunto de isómeros conformacionales. El grado de la diversidad conformacional de una proteína puede entonces relacionarse con la extensión de la “rugosidad del fondo del embudo”. La distribución de los confórmeros en este potencial ha sido previamente asociada al plegamiento, la historia evolutiva, y la presencia de ciertas mutaciones. Actualmente, los conceptos antes mencionados han derivado en la noción de la preexistencia de poblaciones de confórmeros en equilibrio dinámico (dinamismo) sobre la superficie de energía potencial de una proteína. Este equilibrio dinámico soporta la hipótesis de la unión del ligando a una conformación específica de mayor afinidad y ofrece una visión central que permite explicar la función biológica. La dinámica vibracional intramolecular asociada a cada conformación garantiza las transiciones conformacionales que, debido a su importancia, podrían estar asociadas con rasgos conservados evolutivamente. El análisis de modos normales, basado en un modelo de “grano grueso” de la proteína, puede proporcionar la información necesaria para explorar estas características. En la primer parte de la tesis presentamos un nuevo procedimiento para identificar residuos en posiciones clave para el mantenimiento de la diversidad conformacional asociada a la unión al ligando. El método se aplicó a un conjunto de 188 pares de estructuras de proteínas, cristalizadas con y sin ligando. En primer lugar, se seleccionaron los modos normales implicados en el cambio conformacional de acuerdo con las distorsiones estructurales introducidas por unión al ligando. El subespacio definido por estos modos se utilizó para analizar el efecto de mutaciones puntuales en la conservación de la diversidad conformacional de la proteína. Definimos las posiciones cuyas mutaciones alteran en mayor medida estos subespacios como posiciones claves, es decir, son residuos dinámicamente importantes que median el cambio conformacional de unión al ligando. Encontramos una correlación negativa entre la conservación evolutiva de los residuos de una proteína y el impacto de sus mutaciones sobre los subespacios de modos normales asociados a la unión del ligando. Estas posiciones se muestran conservadas evolutivamente, en su mayoría son residuos con baja exposición al solvente, alifáticos y localizados en estructuras regulares de la proteína como hoja-β y hélice-α . Durante la segunda etapa del doctorado, combinamos la información obtenida de métodos basados en propiedades estructurales y dinámicas de proteínas con información relacionada con redes de interacciones de residuos. La representación de la estructura proteica como red facilita la búsqueda de determinantes topológicos, que pueden estar relacionados con residuos funcionalmente importantes. Cada estructura proteica de nuestro set de estudio se representó como una red de contacto de residuos y se realizó un análisis exhaustivo de las propiedades de la red. Se analizaron tres parámetros topológicos de redes, Grado, Centralidad de Intermediación y Proximidad Central. Particularmente los últimos dos se han previamente utilizado en diversos trabajos para identificar residuos funcionales ya que la Centralidad de Intermediación refleja el control que ejerce un nodo sobre las interacciones de otros nodos en la red y la Proximidad Central se asocia a cuan rápido se propaga la información desde un nodo dado a otros nodos alcanzables en la red. Estudiamos la correlación de estos parámetros topológicos de redes con nuestro parámetro para definir mutaciones que alteran en mayor medida el subespacio de modos normales asociado a la unión al ligando. Además, analizamos la correlación entre la conservación evolutiva y el área de accesibilidad al solvente, con estos parámetros topológicos. Encontramos una buena correlación entre los efectos de las mutaciones en los subespacios de modos normales asociados a la unión del ligando y los parámetros topológicos de redes. Estos parámetros han sido utilizados para predecir con éxito sitios activos o sitios funcionales en varias proteínas. Esto apoya nuestro método para detectar residuos dinámicamente importantes que median el cambio conformacional de unión al ligando. Determinamos que los residuos dinámicamente relevantes tienden a estar interconectados, por lo que es posible definir redes de residuos que modulan dinámicamente los cambios conformacionales. Como etapa final de la tesis, exploramos las posiciones claves que sustentan la estabilidad dinámica de la estructura homotetramérica de la Transtiretina Humana. El estado nativo de la Transtiretina presenta dos sitios de unión a la hormona tiroxina, que son generados por la interfaz dímero-dímero, mediante interacciones débiles. La disociación de la estructura tetramérica es el primer paso del proceso de formación de fibrillas de amiloide. Un gran número de mutaciones puntuales por desestabilizar la estructura cuaternaria del tetrámero muestran efectos pro-amiloidogénicos. Basándonos en el análisis de modos normales y su respuesta a las perturbaciones locales hemos identificado las posiciones cuyas mutaciones alteran en mayor medida la dinámica de equilibrio del tetrámero de Transtiretina. Encontramos que estas posiciones están localizadas principalmente en las hojas-β E y F, del monómero de Transtiretina y el loop entre estas estructuras secundarias. Determinamos que la interfase monómero-monómero es una de las regiones más vulnerables, ya que mutaciones en residuos de esta región conducen a cambios significativos en la dinámica de equilibrio del tetrámero y, por lo tanto, favorece la disociación de la estructura. Además, hemos encontrado que las mutaciones en los residuos localizados en la interfaz dímero-dímero y/o en el sitio de unión a la hormona tiroxina desestabilizan al tetrámero más que el promedio. La unión de la tiroxina estabiliza la estructura tetramérica estableciendo interacciones con los residuos en la interfaz dímero-dímero. Debido a esto se han propuesto varios compuestos como drogas en la terapia de la amiloidosis por Transtiretina, siendo clave la afinidad por el sitio unión del tetrámero, y por tanto, la contribución a la integridad de la estructura. Comparamos varios compuestos de acuerdo a su efecto sobre las vibraciones asociadas a la unión del ligando. Discutimos y analizamos nuestra comparación de drogas en términos de parámetros y mediciones asociadas a las afinidades de unión al ligando y la estabilización del estado nativo del tetrámero de Transtiretina. A pesar de la presencia en el tetrámero de dos sitios de unión idénticos, la unión de la tiroxina en solución se caracteriza por una fuerte cooperatividad negativa. La flexibilidad estructural del tetrámero, simulada mediante el análisis de modos normales, expuso patrones vibratorios asimétricos en ambos dímeros. Las fluctuaciones térmicas revelan diferencias en el tamaño y la flexibilidad de las cavidades de unión de los ligandos en la interfaz dímero-dímero. Es decir, pequeñas diferencias estructurales entre los dímeros, o monómeros pueden conducir a diferencias funcionales significativas en la dinámica del tetrámero de Transtiretina.

La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) cataliza la primera reacción en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada. Esta enzima es el sitio de acción de herbicidas dentro de los que se incluyen las imidazolinonas. La resistencia a imidazolinonas en girasol cultivado, incorporada a partir de una población de girasol maleza, está controlada por dos genes: Imr1 e Imr2. El primer gen se corresponde con una mutación de ahas1, el cual es uno de los tres genes que codifica para la subunidad catalítica de AHAS. Se desconoce el mecanismo relacionado con el segundo gen. Los objetivos de este trabajo fueron caracterizar la resistencia a imidazolinonas en estadios tempranos del desarrollo, a nivel fenotípico y bioquímico, evaluar la expresión de los tres genes ahas y determinar el mecanismo de resistencia relacionado a Imr2. La utilización de bioensayos de germinación en condiciones controladas permitió caracterizar la respuesta al herbicida imazapir en genotipos con distinto grado de resistencia a imidazolinonas. El crecimiento y desarrollo del sistema radical y la expansión del primer par de hojas verdaderas fueron los parámetros más sensibles para discriminar estos genotipos. De manera similar, la actividad AHAS in vivo permitió distinguir genotipos que difieren a nivel de Imr1. Los niveles relativos de transcriptos ahas fueron cuantificados mediante RT-qPCR en hojas y raíces de plántulas control y tratadas con imazapir. Estos niveles se correspondieron con la actividad AHAS evaluada in vivo e in vitro en dichos tejidos. El tratamiento con imidazolinonas produjo respuestas tejido-específicas y gen-específicas. Los niveles de expresión AHAS en plántulas control no difirieron entre los genotipos evaluados, por lo que la alteración o sobreexpresión de AHAS no serían mecanismos de resistencia presentes en las líneas de girasol bajo estudio. Para evaluar la participación de citocromo P450 monooxigenasas (P450s) en la detoxificación del herbicida, se evaluó la respuesta de plántulas sensibles y resistentes bajo el tratamiento combinado de imazapir e inhibidores de citocromo P450s. Se observó una disminución de parámetros de crecimiento por el tratamiento combinado en la línea resistente, por lo que existiría un mecanismo de detoxificación del herbicida imazapir mediado por isoformas de citocromo P450s. Este mecanismo estaría relacionado al locus Imr2 y completaría a la resistencia conferida por la mutación en ahas1.

El estudio de las interacciones celulares en el microambiente tumoral se ha convertido en una de las principales áreas de investigación en la lucha contra el cáncer. La hipoxia y la autofagia han sido reconocidas como fenómenos activos en el microambiente tridimensional de los tumores sólidos debido a la pobre difusión de oxígeno y nutrientes en regiones alejadas de los capilares sanguíneos. La respuesta celular a la hipoxia está mediada principalmente por el factor de transcripción HIF-1 el cual modula la activación de la angiogénesis y vías de supervivencia que permiten la adaptación de la célula tumoral a este microambiente hostil. Además, resulta interesante que, en los últimos años, se ha demostrado que dicho factor puede inducir la activación de la vía autofágica, un mecanismo que promueve la supervivencia celular bajo diferentes condiciones de estrés. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes, a través de los cuales HIF-1 induce autofagia, necesitan ser estudiados con detalle. Tanto HIF-1 como la autofagia han sido vinculadas a la resistencia a tratamientos antitumorales incluyendo la Terapia Fotodinámica (TFD). La TFD consiste en la aplicación de fotosensibilizadores que al ser irradiados producen Especies Reactivas del Oxígeno, las cuales provocan a la muerte del tumor. Sin embargo, no hay reportes que demuestren la implicancia de la autofagia mediada por HIF-1 sobre la respuesta tumoral a la TFD. En este trabajo, se emplearon tres modelos de estudio (cultivos en monocapa, cultivos tridimensionales y tumores in vivo) y evaluó cómo HIF-1 y la autofagia trabajan juntos para modular la respuesta celular a la TFD, además, se estudió el mecanismo molecular a través del cual HIF-1 controla autofagia para mediar la resistencia de células tumorales de cáncer de colon al tratamiento fotodinámico.Se demostró que la activación de HIF-1, induce autofagia a través de un nuevo mecanismo que involucra la regulación transcripcional de la proteína autofágica VMP1. HIF-1 aumentó el flujo autofágico determinado por un aumento de la relación LC3-II/LC3-I, disminución de p62, aumento de VMP1 y agregación de RFP-LC3. Asimismo, la autofagia inducida por HIF-1 promueve resistencia a la TFD. Por otro lado, se demostró que el tratamiento fotodinámico, per se, puede inducir autofagia a través de la activación de la vía HIF-1/VMP1.Empleando cultivos 3D que recapitulan la arquitectura tridimensional de los tumores sólidos así como algunas de las características biológicas observadas en pacientes con cáncer, tales como la hipoxia, se estudió la naturaleza molecular de la resistencia a la TFD en un contexto de microambiente tumoral y revelamos, por primera vez, que la resistencia intrínseca a la TFD, observada en los cultivos 3D, puede ser explicada en términos de una ?autofagia protectora? controlada por HIF-1.Por último, se evaluó el efecto de la inhibición farmacológica de la autofagia con Cloroquina (CQ) sobre el crecimiento tumoral. Se generaron tumores en ratones inmunodeprimidos y los animales se trataron con TFD, CQ o TFD+CQ. Los tumores fueron resistentes a la TFD. Sin embargo, hubo una disminución del 40% del crecimiento tumoral cuando la autofagia fue inhibida con CQ y la combinación TFD+CQ redujo dramáticamente el crecimiento de los tumores en un 75% respecto al tratamiento con TFD.En conclusión, esta tesis reporta por primera vez que: 1- HIF-1 controla autofagia a través de la regulación de la expresión de VMP1; 2- La TFD induce autofagia, a través de la vía HIF-1/VMP1, como mecanismo de resistencia; 3- Los cultivos tridimensionales son resistentes a la TFD debido, al menos en parte, a la actividad autofágica intrínseca dependiente de HIF-1; 4- La combinación de TFD con el inhibidor farmacológico Cloroquina, sensibiliza los tumores resistentes al efecto fototóxico.

La abeja europea Apis mellifera L. tiene una gran importancia, tanto ecológica como económica, a nivel mundial. En los últimos años se han reportado muchas pérdidas de colmenas en distintas regiones del mundo. Entre las principales causas de la muerte de colonias, se encuentra el ácaro ectoparásito Varroa destructor. El objetivo de la presente Tesis Doctoral fue estudiar la problemática generada por V. destructor, considerando dos grandes cuestiones: I) la resistencia a acaricidas de síntesis en V. destructor y los posibles mecanismos que le dan origen, y II) el efecto de moléculas de origen vegetal como estrategia de mitigación de los daños colaterales ocasionados por los tratamientos con acaricidas de síntesis. Se evaluó el estado de resistencia a los acaricidas de síntesis de uso común en apicultura a través de bioensayos, en poblaciones de Argentina y Uruguay, y las alternativas para el manejo de la parasitosis. Se logró identificar un nuevo foco de resistencia a la flumetrina en poblaciones de ácaros de Uruguay. A su vez, no se observó reversión de la resistencia al cumafós en una población de ácaros que por siete años no había sido expuesta a dicho acaricida. Se estudiaron, además, las bases de la resistencia a flumetrina y cumafós mediante el desarrollo de protocolos para la aplicación de técnicas de biología molecular, lográndose identificar una mutación en el gen del canal de sodio en los ácaros de las poblaciones resistentes a la flumetrina. Por otra parte, se evaluó el efecto de moléculas de origen vegetal como potenciales mitigadoras de los efectos negativos ocasionados por los acaricidas de síntesis en abejas. Se observó que la suplementación con ácido indolacético (IAA) y ácido p-cumárico (Cum) en la dieta de abejas nodrizas aumenta la supervivencia de las mismas frente a la exposición al tau-fluvalinato. A su vez, se observó que la suplementación dietaria con dichas fitomoléculas causa cambios significativos en la actividad de enzimas de detoxificación. Los cambios enzimáticos relacionados con los mecanismos de detoxificación observados en las abejas que fueron alimentadas con Cum y con IAA podrían ser los responsables de la mayor supervivencia observada frente a la exposición al tau-fluvalinato. Teniendo en cuenta los resultados reportados en la presente Tesis Doctoral, debe dirigirse especial atención a la interpretación de las dinámicas poblacionales de V. destructor en la región, de manera de poder implementar un Manejo Integrado de Plagas. También surgen resultados prometedores en cuanto al desarrollo de un producto a base de fitoquímicos, con el fin de mejorar la performance de las colonias de A. mellifera frente a posibles estresores a los que habitualmente se encuentran expuestas, como son los acaricidas de síntesis.

Una de las ventajas de vivir en grupo es la posibilidad de resolver de manera colectiva aquellos problemas que superan la capacidad cognitiva y/o física de los individuos. Definir qué factores determinan las estrategias de resolución (i. e., individual y/o colectiva) que los organismos sociales utilizan para resolver sus problemas es importante para comprender la evolución y el mantenimiento de la vida en grupo. Sin embargo, los estudios al respecto son escasos. En esta tesis describí cómo las hormigas cortadoras de hojas resuelven individual y colectivamente dos tipos de problemas que afectan negativamente el ingreso de recursos a la colonia: el viento y la presencia de obstáculos en los senderos de forrajeo. Además, estudié los posibles factores que pueden afectar la decisión sobre qué estrategias de resolución utilizar. Encontré que el viento afecta negativamente el movimiento de las obreras provocando que el ingreso de material vegetal se reduzca un ~ 70 % cuando el viento aumenta 1 km/h. Para mitigar estos efectos negativos, las obreras utilizan ambas estrategias de resolución: individual y colectiva. Individualmente, las obreras seleccionaron cargas que interceptan menos al viento; es decir, cargas de menor área, más livianas y alargadas. Gracias a este ajuste en el tamaño, masa y forma de las cargas, las obreras son capaces de ingresar material vegetal al nido pese a las condiciones ventosas. Mientras que colectivamente, las colonias asignaron obreras de mayor tamaño las cuales lidian mejor con los efectos negativos del viento. Esta respuesta colectiva redujo un 32% el efecto negativo del viento. En cuanto a la presencia de obstáculos en los senderos de forrajeo, encontré que tanto el tamaño del obstáculo como el flujo de hormigas determinan el costo para la colonia (medido como la reducción en el flujo de hormigas en el sendero). En concordancia, la xiii decisión sobre remover o no un obstáculo dependió de este costo. Cuando el costo superó el 50% de reducción en el flujo de hormigas, las hormigas siempre removieron los obstáculos. Además, al aumentar el tamaño del obstáculo el número de hormigas removiendo aumentó, pero cuando el obstáculo fue muy grande y el flujo de hormigas en el sendero alto, las colonias asignaron un menor número de hormigas a la remoción. Por último, el tamaño del obstáculo y el flujo de hormigas afectaron la eficacia de las resoluciones individuales y colectivas. Aquellos obstáculos muy grandes solo pudieron ser removidos colectivamente y al aumentar el flujo de hormigas aumentó la eficacia de las resoluciones colectivas pero disminuyó la eficacia de las individuales. Estos resultados resaltan que tanto características intrínsecas como extrínsecas al obstáculo determinan cuándo y cómo se resuelve un problema; y que las colonias ajustan el número de individuos asignados a la resolución de problemas de acuerdo a las limitaciones individuales (i.e., ineficiencia) y la interacción entre los individuos (i.e., interferencia). Esta tesis ilustra cómo los organismos que viven en grupo se ven beneficiados de la posibilidad de solucionar de manera colectiva aquellos problemas que exceden las capacidades individuales.