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En este trabajo de Tesis se demuestra cómo ciertos lípidos son capaces de regular la diferenciación de células madre neurales (NSCs). Estas células, presentes en el cerebro adulto, tienen la capacidad de migrar y diferenciarse a neuronas luego de una lesión cerebral. Sin embargo, debido a que el proceso de regeneración neuronal no es completo, surge la necesidad de identificar moléculas que tengan la capacidad de aumentar el proceso de diferenciación en NSCs. Como modelo de estudio, se utilizaron NSCs embrionarias obtenidas de la corteza lateral de ratones de 13-15 días de gestación, amplificadas mediante el método de neuroesferas. En primer lugar, se demostró que diferentes fosfolípidos inducen la diferenciación neuronal de manera selectiva: fosfatidilcolina (PC) promueve la diferenciación neuronal, mientras que fosfatidiletanolamina (PE) aumenta la población de astrocitos. En base a estos resultados, se decidió estudiar de qué manera ambos fosfolípidos regulan el proceso de diferenciación. Se comprobó que la población de progenitores neuronales y astrogliales no se altera en presencia de PC o PE, es decir, no se promueve la proliferación celular de progenitores específicos. Además, tampoco se modifica el número de células viables, demostrando así que los fosfolípidos no ejercen efecto neuroprotector. Al mismo tiempo, se evidenció que el aumento en la diferenciación no ocurre por una aceleración del proceso de diferenciación neuronal o astroglial. Mediante la utilización de microscopía de lapso de tiempo y del análisis por inmunofluorescencia de las poblaciones celulares presentes en el cultivo de NSCs, se demostró que tanto PC como PE actúan en la población de células post-mitóticas. Específicamente, PC promueve la diferenciación neuronal alterando el destino de células precursoras astrogliales e indiferenciadas. Por otro lado, PE induce la diferenciación astroglial a expensas de una disminución en la población de células indiferenciadas. Posteriormente, se estudiaron los mecanismos moleculares involucrados en cada caso, y se comprobó que PC activa la vía de señalización PKA/CREB, así como PE promueve la diferenciación astroglial por un mecanismo dependiente de la activación de la vía de señalización MEK-ERK. Desde el punto de vista terapéutico, es importante que los lípidos modifiquen la especificación de NSCs en ambientes reactivos de daño cerebral. Por este motivo, se estudió el efecto de PC en una condición de estrés oxidativo. Se utilizó el compuesto peróxido de hidrogeno para generar estrés oxidativo en cultivos de NSCs, y se demostró que PC promueve la diferenciación neuronal, aún en condiciones de daño cerebral. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis contribuyen al conocimiento de los mecanismos que regulan la diferenciación de NSCs y aportan herramientas para el desarrollo de nuevas estrategias para inducir la diferenciación neuronal de NSCs en condiciones de daño celular.

El núcleo es una de las características distintivas que definen a las células eucariotas, permite una compartamentalización que es crítica para procesos que se desarrollan dentro del mismo, como la replicación, transcripción, splicing de pre-mRNA y ensamblado de ribosomas. Los Lípidos Neutros (LN) nucleares son fuentes alternativas de ácidos grasos (FA) y colesterol para membranas, vías de señalización y ligandos de factores de transcripción. Los objetivos de la presente tesis fueron: 1) Determinar la organización estructural y espacial de los lípidos nucleares. 2) Determinar el o los mecanismos de incorporación de los ácidos grasos (FA) exógenos en los lípidos nucleares. Como modelo experimental se trabajó con núcleos y matrices nucleares aislados de hígado de rata. La pureza de las fracciones aisladas se determinó mediante ensayos morfológicos y bioquímicos y se corroboró la alta pureza e integridad de cada fracción. Mediante análisis bioquímicos tradicionales se determinó la composición lipídica nuclear y se pudo concluir que los lípidos nucleares se ubican en dos localizaciones principales, la doble membrana nuclear compuesta de glicerofosfolípidos, esfingolípidos y colesterol; y dentro del núcleo, los lípidos endonucleares están enriquecidos en triacilglicéridos (TAG) y ésteres de colesterol (CE). En particular, los LN nucleares se organizan en la matríz nuclear como Gotas Lipídicas nucleares (nLD), que serían análogas a las gotas lípidicas citosólicas (cLD). Esta hipótesis fue corroborada al observar nLD en el interior de núcleos y matrices aislados de hígado de rata, en hepatocitos de rata y en células HepG2, mediante microscopía de campo claro y de fluorescencia en muestras tratadas con coloraciones específicas para lípidos. Las nLD se caracterizan por ser esferas, de número limitado por núcleo y estar separadas espacialmente de los dominios nucleares nucleolo, Speckles y Paraspeckles y lámina nucleas. Poseen además diámetros menores a los de las cLD. Se elaboró un protocolo para aislar nLD de los demás componentes nucleares y se corroboró la presencia de gotas de lípidos en la fracción aislada por microscopía de campo claro y electrónica con tinciones específicas. Las nLD son estructuras supramoleculares nucleares compuestas principalmente por CE, C, TAG y proteínas, con una baja proporción de lípidos polares. Las nLD constituyen un nuevo dominio nuclear donde los LN se almacenan y organizan y seguramente participan en la homeostasis lipídica nuclear. Las nLD podrían actuar como un sistema buffer endonuclear proveyendo o incorporando lípidos y proteínas involucrados en diferentes procesos. Se determinó que la membrana nuclear corresponde a una zona de fluidez mayor a la de la membrana plasmática y la matriz nuclear es más rígida, utilizando la sonda Laurdan y microscopía de 2 fotones. Para evaluar el mecanismo de incorporación FA exógenos en los lípidos nucleares se incubaron núcleos con distintos [14C]FA y se analizó la incorporación de la radiactividad en los lípidos. Los FA saturados y polinosaturados exógenos estudiados se incorporan como FA y se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA no se esterifican directamente a los pooles lipídicos nucleares sino que primero deben ser convertidos en ésteres de CoA. Este proceso es llevado a cabo por acción de acil-CoA sintetasas. Los ácidos 16:0, 18:0, 18:1n-9, 18:2n-6 y 20:4n-6 se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA ensayados se incorporan como FA libre tanto en núcleos, membranas nucleares aisladas, matrices nucleares como en las nLD y se esterifican en los lípidos de las mismas (LP y LN en los núcleos, matrices y nLD y LP en las membranas nucleares). Sin embargo, los FA no se esterifican en lípidos de nLD aisladas en las condiciones ensayadas, esto pude deberse a que se necesiten componentes nucleares que se pierden durante el aislamiento o que no haya remodelado de FA dentro de la gota. La L-FABP participa en la movilización y transporte de FA nucleares. Existe un transporte reverso de FA unidos a L-FABP desde los pooles lipídicos nucleares y endonucleares (matrices nucleares) hacia el citosol. La L-FABP moviliza al 20:4n-6, 18:0 y 18:1n-9 fuera del núcleo hacia otros compartimentos celulares. Estimula la movilización y redistribución de los mismos dentro del núcleo entre los diferentes pooles lipídicos. En especial, determina un incremento de 20:4n-6 esterificado en PI. El PI de la matriz nuclear forma parte del activo sistema de transducción de señales del núcleo, y la L-FABP estaría favoreciendo la adecuada composición de este fosfolípido. El 20:4n-6 movilizado por la L-FABP de los pooles endonucleares, podría ser el ligando de factores de transcripción, en particular del PPARα, dado que existe colocalización entre PPARα y L-FABP.

La producción de granos es una de las principales actividades de nuestro país y por ende, es de suma importancia la preservación de su calidad durante el almacenamiento. La contaminación insectil es uno de los mayores problemas de los granos almacenados. Según estimaciones de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO), entre 10 y 30% de la producción agrícola mundial se pierde anualmente durante la última etapa de la comercialización por la acción de las plagas insectiles, cifra que se eleva a más del 50% en países subdesarrollados. Los insectos plaga pueden causar reducción del peso, calidad, valor comercial y poder germinativo de las semillas. En las etapas de almacenamiento, el método de control más utilizado es el químico, pero su aplicación debería ser rigurosamente controlada para evitar consecuencias negativas sobre el alimento del hombre y animales. Es allí donde la búsqueda de agentes de control natural, control biológico, nuevas técnicas de monitoreo, prácticas culturales adecuadas, mejoramiento genético y otras medidas terapéuticas de bajo impacto ambiental son necesarias. Basado en estudios previos obtenidos en este laboratorio, en esta tesis se propuso avanzar en el conocimiento de la bioquímica de los hidrocarburos (HC) epicuticulares y las secreciones volátiles de origen lipídico de insectos tenebriónidos (Coleóptera); así como investigar métodos alternativos de bajo impacto para el control de estos insectos plaga de granos almacenados. Este conocimiento podrá contribuir al desarrollo de nuevas estrategias ecológicamente aceptables para el control de plagas. En este trabajo se efectuó el análisis de los HC epicuticulares de adultos de Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) empleando cromatografía gaseosa capilar (CGC) de alta resolución acoplada a espectrometría de masa (MS). Se detectaron 42 componentes lineales y ramificados. Comparada con las de otros órdenes de insectos, la composición de HC en T. castaneum es menos compleja; incluye estructuras saturadas y/o ramificadas con longitudes de 23 a 39 átomos de carbono, predominando n-C27:0 y n-C29:0. Se identificaron y cuantificaron secreciones de defensa de Ulomoides dermestoides (Coleoptera: Tenebrionidae), extraídas del espacio de cabeza mediante la técnica de microextracción en fase sólida (HS-SPME) acoplada a CGC-MS. Los principales compuestos volátiles orgánicos (VOC) identificados fueron metil-1,4-benzoquinona (MBQ), etil-1,4-benzoquinona (EBQ) y 1-pentadeceno (n-C15:1); estos compuestos son semejantes a los reportados en Tribolium spp. El análisis cuantitativo de las secreciones liberadas por adultos vivos de ambas especies mostró que las benzoquinonas representan alrededor del 80% de las mismas en condiciones de estrés. Basado en el empleo de estas técnicas, se desarrolló una metodología para detectar VOC de insectos plaga en muestras de granos almacenados, que podría ser de utilidad como indicador de contaminación insectil. La técnica de HS-SPME acoplada a CGC permite detectar las secreciones volátiles de insectos vivos, en forma rápida, con alta sensibilidad y sin utilizar solventes. Este es el primer método químico que propone la detección de quinonas volátiles como un indicador de contaminación con tenebriónidos en granos almacenados. En cuanto a su metabolismo, se demostró que la síntesis de n-C15:1 ocurriría vía de novo en la glándula a partir de [1-14C] acetato, o a partir de palmitato exógeno (incorporado a través del alimento, o sintetizado en integumento y/o cuerpo graso). Asimismo, se demostró síntesis de novo de BQ en las glándulas. Estos ensayos se efectuaron empleando trazadores radiactivos y análisis por radiocromatografía en capa fina (radio-TLC). En referencia a herramientas de bajo impacto para el control de insectos plagas de granos almacenados, se evaluó el potencial insecticida de tierras de diatomeas (TDs) de yacimientos locales, logrando seleccionar un yacimiento con capacidad insecticida similar a la de un producto comercial. Dentro de los coleópteros plaga de granos almacenados ensayados, T. castaneum fue la especie más tolerante. El empleo de esta metodología permitirá incorporar valor agregado a las TDs de yacimientos locales. Finalmente, se evaluó el efecto del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana en la supervivencia y ciclo de vida de T. castaneum y U. dermestoides. Ambos tenebriónidos mostraron una disminución significativa en la progenie, a pesar de los bajos índices de mortalidad observados. Es probable que la infección produzca un estado de aislamiento e inanición, alterando el desarrollo de las colonias de ambas especies. Los resultados de este trabajo de tesis aportan al conocimiento de la bioquímica de los lípidos cuticulares y secreciones volátiles de tenebriónidos; asimismo proporcionan información de utilidad para el desarrollo de nuevas estrategias ecológicamente aceptables para el control de insectos plaga de granos almacenados

Las lipoproteínas, ya sean plasmáticas o vitelínicas, cumplen una función importante en el transporte y utilización de los lípidos en los organismos. Los estudios realizados hasta la actualidad sobre lipoproteínas de invertebrados son abundantes en algunos grupos taxonómicos y escasos en otros. Los grupos más estudiados dentro de los artropodos son los insectos y los crustáceos, aunque en nuestro modelo de estudio (Macrobrachium borellii, camarón de agua dulce), las lipoproteínas no habían sido caracterizadas. Dado que la investigación sobre algunas funciones y comportamiento de las lipoproteínas plasmáticas y de vitelo de los crustáceos, fueron el objetivo general de este trabajo de tesis, fue necesario comenzar con una caracterización detallada de las lipoproteínas presentes en esta especie. Estos modelos lipoproteicos bien caracterizados, fueron luego utilizados para desarrollar la mayor parte de esta tesis y alcanzar los objetivos específicos. Uno de ellos fue aportar conocimientos acerca de la relación entre lipoproteínas circulantes y vitelínicas; otro fue analizar las modificaciones generadas en estas últimas a lo largo del desarrollo embrionario, como así también determinar la capacidad de intercambio de lípidos entre lipoproteínas y tejidos. Otro conjunto de objetivos específicos estuvo relacionado con los primeros estudios acerca del efecto que ejercen los plaguicidas sobre las estructuras y funciones de las lipoproteínas. Para esto se emplearon como modelos lipoproteinas de M. borellii con diferentes composiciones lipídicas y apoproteicas.