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Mientras que el incremento en los niveles del inhibidor de quinasas dependiente de ciclinas p21 ha sido reportado extensamente en respuesta a variados tratamientos genotóxicos, lo opuesto ocurre en respuesta a la irradiación UVC en donde p21 disminuye sus niveles de expresión como consecuencia de una proteólisis. Esta degradación sugiere que p21 podría estar reprimiendo algún proceso relevante para la respuesta celular a la irradiación UVC. En este trabajo demostramos que la estabilización forzada de p21 luego de luz UV bloquea la replicación sobre ADN lesionado. Este impedimento está relacionado con un defecto en el reclutamiento de polimerasas especializadas necesarias para replicar sobre ADN dañado, que forman parte de un proceso conocido como Síntesis de ADN por Translesión, TLS, (del inglés Translesion DNA Synthesis). Los defectos observados en la replicación de ADN lesionado correlacionan con un aumento en los marcadores de estrés replicativo, inestabilidad genómica y aumento de la muerte celular. Interesantemente estos efectos deletéreos desaparecen si se remueve el sitio de unión a PCNA, (PIP box) de p21, sugiriendo que la perdida de interacción entre p21 y PCNA es suficiente como para permitir el reclutamiento de proteínas de unión a PCNA (como las polimerasas especializadas) relevantes para la respuesta a irradiación UV. Por otro lado la expresión de una construcción degradable de p21 tuvo un efecto transiente sobre los eventos de replicación temprana y sobre el reclutamiento de las polimerasa de TLS en respuesta a irradiación UV. Estos defectos temporarios desaparecen en correlación con la degradación de p21, sin observarse consecuencias sobre eventos de replicación tardía o sobre la estabilidad genómica. En conjunto, nuestros datos sugieren que la función biológica asociada a la degradación de p21 en respuesta a irradiación UV es la de promover la replicación sobre ADN lesionado a través de una correcta y efectiva activación de los eventos de TLS.

A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetada principalmente por protaminas en lugar de histonas. Las cisteínas presentes en las protaminas forman puentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad y resistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta el sitio de fecundación. Luego que el espermatozoide penetra el oocito es imprescindible que se produzca la descondensación de su cromatina para que se reemplacen las protaminas espermáticas por histonas oocitarias. La descondensación de la cromatina involucra dos eventos: se deben reducir los puentes disulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesos serían el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) oocitarios. Cuando este proceso de condensación de la cromatina, que ocurre durante la espermatogénesis para mantener la integridad del espermatozoide, se ve afectado por diversas causas, puede resultar en fallas de la descondensación que se evidencian una vez que el oocito es penetrado. Por otro lado, es sabido que la exposición a tóxicos ambientales puede provocar efectos deletéreos sobre la calidad de los espermatozoides y la fertilidad masculina. Las técnicas de reproducción asistida han podido resolver problemas de motilidad, defectos espermáticos, concentración de gametas muy reducida en el fluido seminal (oligozoospermia) pero todavía no pueden solucionar los defectos de la descondensación del núcleo espermático dentro del oocito. Esto pone en evidencia la importancia del proceso de descondensación, que no puede ser reemplazado por las técnicas de reproducción asistida, y permite pensar en utilizarlo como un posible indicador del efecto de disruptores endocrinos, tanto in vivo como in vitro. Los objetivos de esta tesis fueron (1) avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina de espermatozoides, así como también en su (2) rol como posible bioindicador de efectos deletéreos causados por tóxicos ambientales o ingeridos, tales como el alcohol y el plaguicida endosulfán. En primer lugar, fue posible caracterizar el sistema de descondensación in vitro en el modelo de ratón al coincubar los espermatozoides con distintos glicosaminoglicanos y GSH, determinándose de esta manera las moléculas candidatas a ser posibles agentes descondensantes, las concentraciones y tiempos óptimos de incubación. Como consecuencia de esto, fue posible detectar un efecto sinérgico existente entre la heparina (utilizada como equivalente molecular del heparán sulfato) y el dermatán sulfato, los únicos glicosaminoglicanos estudiados con potencial capacidad descondensante. El efecto de estos dos glicosaminoglicanos también fue evaluado mediante la técnica de microscopia electrónica de transmisión, la cual puso en evidencia los cambios sufridos por los espermatozoides durante el proceso de descondensación. Una vez caracterizado el sistema, se logró evidenciar el aumento de la descondensación in vitro que ocurre cuando se incuban los espermatozoides con endosulfán o etanol, como también luego de la ingesta de etanol. Además, fue posible evaluar el efecto del plaguicida sobre la fragmentación del ADN, así como también si existe alguna correlación entre la misma y la descondensación de la cromatina. Los efectos del etanol observados in vitro fueron confirmados en experimentos in vivo, en los cuales se intoxicaron ratones macho para realizar experimentos de fecundación in vitro. Estos son los primeros resultados obtenidos descondensando in vitro en presencia de heparina y GSH, espermatozoides previamente incubados con endosulfán o etanol, que ponen de manifiesto que este ensayo podría utilizarse como centinela para evaluar posibles efectos de tóxicos ambientales o ingeridos.

Para una comunidad de bosque de la cuenca del Río Manso Superior se ha estudiado: a) su composición específica, grado de asociación entre especies, estructura horizontal y vertical y b) la aplicación de la teoría del nicho ecológico a la misma. Para ambos aspectos se ha analizado la comunidad bajo el efecto del ramoneo por grandes herbívoros, comparándola con la parte de la comunidad protegida del mismo. Para el estudio de nichos se analizaron las variables ambientales en función de las cuales ocurre la separación de nichos y las distintas estrategias de distribución de recursos y disminución de competencia interespecífica. La comunidad es definida en base a las asociaciones de Nothofaqus antarctica con distintas especies de arbustos y, en menor grado, de hierbas. Ocurren además otras dos especies arbóreas: Maytenus boaria y Schinus patagonicus. Cada una de estas especies determina una subasociación al interior de la comunidad, con especies que les son características. De las variables ambientales estudiadas, las que condicionan porciones del nicho total características para cada especie, son en orden de importancia: la intensidad luminosa, la profundidad de arraigamiento y el período de desarrollo vegetativo y reproductivo. Los nichos ecológicos se caracterizan en función de las medidas de amplitud, superposición, forma y desplazamiento. Todas estas medidas son útiles para identificar distintos aspectos de las relaciones de competencia interespecífica. La intensidad lumínica es variable al interior de la comunidad y está determinada por la posición y tamaño de las copas de árboles y de los claros entre ellas. La profundidad de arraigamiento está condicionada por la humedad del suelo y en menor grado por la disponibilidad de nutrientes. El período de desarrollo estaría determinado por factores climáticos. El pastoreo es, en la zona de estudio, moderado. Aún así provoca la modificación de las asociaciones espaciales, relaciones de dominancia, abundancia de especies, estructura vertical y características microtopográficas. Asimismo se convierte en el factor principal de la determinación de nichos en la comunidad coaccionada.

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Biológicas presentada en la Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales, en diciembre 2018

El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad.

En la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección con dengue, resultando la enfermedad viral transmitida por artrópodos de mayor importancia en todo el mundo. A pesar de la creciente incidencia de este virus, al momento no existen vacunas o quimioterapia antiviral disponibles. Dado que el conocimiento del ciclo de multiplicación viral es indispensable como punto de partida para el diseño de agentes quimioterapéuticos, el presente trabajo de tesis se propuso estudiar los pasos iniciales de la infección con DENV: el mecanismo de entrada a la célula huésped. Nuestro estudio se centralizó en el análisis in vitro de los factores celulares involucrados en la internalización, transporte intravesicular y desnudamiento del virus y la influencia del tipo de célula (mamífero o insecto), cepa y serotipo viral sobre dichos procesos. Mediante el uso combinado de inhibidores químicos y moleculares, medidas de infectividad y técnicas de microscopía electrónica y de fluorescencia demostramos que la entrada del serotipo DENV-1 en células Vero ocurre por endocitosis dependiente de clatrina, mientras que la entrada del serotipo DENV-2 tiene lugar por un mecanismo no clásico independiente de clatrina, caveolas y lipid-rafts, pero dependiente de dinamina. Al extender nuestro estudio a otros sistemas celulares (C6/36 HT y A549) encontramos que la endocitosis de DENV-1 y DENV-2 ocurre por un mecanismo clásico dependiente de clatrina. Por lo tanto, estos resultados demuestran por primera vez que un mismo serotipo viral puede utilizar diferentes vías de entrada en líneas celulares de distinto origen, y que a su vez, distintos serotipos virales pueden utilizar vías de entrada alternativas en un mismo tipo celular. Asimismo, observamos que en todos los sistemas celulares analizados, la entrada de DENV ocurre con dependencia de la exposición de los viriones a pH ácido. Esto implica un tránsito de las partículas virales en compartimentos endosomales hasta el momento en que se dispara la fusión entre la membrana viral y la membrana de la vesícula transportadora. Encontramos que los viriones son primeramente transportados hacia endosomas tempranos para luego continuar hasta endosomas tardíos o endosomas de reciclaje dependiendo de características propias de cada cepa viral. Por lo tanto, los hallazgos presentados en este trabajo no sólo aportan conocimientos básicos sobre los pasos iniciales del ciclo de replicación de este importante patógeno humano, sino que además proveen una nueva perspectiva para encarar el desarrollo racional de agentes antivirales para esta enfermedad de creciente reemergencia global.

Los arroyos de montaña que reciben agua de deshielo (nieve o de glaciares) son particularmente vulnerables al cambio climático global y a los factores de estrés asociados, ya que están fuertemente aislados y fragmentados en el paisaje terrestre. A medida que los glaciares retroceden, nuevos paisajes y arroyos glaciares emergen. La evolución de estos cursos de agua y sus zonas ribereñas reflejan las interacciones entre el suministro de sedimentos, el régimen del caudal, y la vegetación. El paisaje norpatagónico muestra profundos cambios en la estructura de su paisaje a causa del cambio climático. La continua recesión de los glaciares y las numerosas alteraciones en la estructura del bosque (colonización post-retracción glaciaria, sequías, incendios) afectan a las condiciones físicas, biogeoquímicas y ecológicas en los ríos y arroyos de montaña, con implicancias para la composición de la comunidad acuática y la productividad del ecosistema. En la presente tesis se propuso analizar los distintos ambientes lumínicos que se producen como consecuencia de la retracción glaciaria (con mayor o menor ingreso de arcillas) y debidos a diferentes estructuras del bosque. Estas condiciones lumínicas generarían condiciones contrastantes en la relación luz: nutrientes que se trasladarán a la estequiometría de los productores y de toda la cadena trófica. Por lo tanto, el objetivo general fue analizar cómo el cambio climático afectará a la dinámica estequiométrica mediada por la relación luz: nutrientes en arroyos glaciares. Para ello, combinando trabajos de campo con experimentación in situ, se estudiaron las relaciones elementales C:N:P en productores y macroinvertebrados en ambientes lóticos norpatagónicos frente a diferentes condiciones de luz: nutrientes, afectados directamente por la concentración de arcillas glaciarias o indirectamente por cambios en la estructura del dosel. La Tesis fue organizada en seis capítulos. En el primer capítulo se presentan y se introducen los conceptos teóricos enfocándolos hacia la pregunta de esta Tesis; asimismo se presentan los objetivos generales-específicos, y las hipótesis. En el segundo capítulo se describe el contexto del ambiente glaciario del Monte Tronador y se caracteriza el área de estudio. En el tercero, se analiza el efecto de las arcillas glaciarias sobre la relación luz: nutrientes y cómo se afectan las funciones fotosintéticas y las relaciones elementales de los productores primarios de ambientes lóticos sin dosel arbóreo. En el cuarto se analiza el efecto de diferentes tipos de dosel arbóreo sobre la actividad fotosintética y la estequiometría de los productores primarios acuáticos de arroyos de montaña. En el quinto capítulo, se determina cómo se ve afectada la diversidad y composición elemental del ensamble de macroinvertebrados bentónicos frente a diferentes condiciones luz: nutrientes de su alimento (productores primarios del perifiton). Por último, en el sexto capítulo se incluyen las conclusiones finales de la Tesis. En dos arroyos glaciares de bajo orden y libres de dosel, localizados en el Monte Tronador (Patagonia, Argentina) se analizó cómo la carga de arcillas glaciares influye en la relación luz: nutrientes afectando a los parámetros fotosintéticos de las algas del perifiton y la relación carbono: fósforo (C:P) de los productores primarios. En estos arroyos se llevaron a cabo estudios a campo y además, se realizó un experimento de colonización in situ con tres tratamientos de luz diferentes. En cada muestreo y en el experimento, se estimaron parámetros lumínicos y químicos de los ambientes. La biomasa perifítica (tanto en valores de concentración de clorofila a como en contenido de carbono) en los arroyos y en el experimento se relacionó directamente con la turbidez (carga de arcilla en suspensión). Los parámetros fotosintéticos variaron de manera similar registrándose un aumento de la eficiencia en la transferencia de electrones (ETR) por centro reactivo en el arroyo más turbio y una reducción en el arroyo más claro. Como consecuencia de esta diferencia en la fijación de C, la relación C:P del perifiton varió directamente con la turbidez. Los resultados obtenidos sugieren que un aumento en el derretimiento de los glaciares, con un consecuente incremento de arcillas glaciares prevendría a los productores primarios de la fotoinhibición crónica a la que están expuestos los arroyos libres de dosel. Los arroyos andinos cubiertos por dosel (bosque de Nothofagus fundamentalmente) estarán influenciados por cambios que puedan ocurrir en la estructura del bosque como consecuencia del cambio climático. Por ello, se propone que los futuros cambios climáticos que alteren la composición y estructura del bosque afectarán a la producción primaria y la estequiometría del perifiton en arroyos de bajo orden a través de modificaciones en la estructura del dosel. Con la finalidad de poner a prueba esta hipótesis, se realizó un estudio en campo de cuatro arroyos de montaña con diferentes niveles de dosel. Asimismo se llevó a cabo un experimento a campo en el que se manipularon las condiciones de luz durante 4 meses. Por último, se vincularon los resultados obtenidos con los escenarios futuros de cambio climático (cerca de futuro: 2015-2039 y futuro lejano: 2075-2099) predichos por el Grupo Intergubernamental de expertos sobre el Cambio Climático (IPCC). Se observó que la biomasa, los parámetros fotosintéticos y el contenido elemental del perifiton exhibieron una relación en forma de campana con la disponibilidad de luz, que era, a su vez, dependiente de la cobertura del dosel. Por lo tanto, las condiciones de luz intermedias resultaron en un escenario óptimo para la fotosíntesis de los productores primarios del perifiton; sin embargo, estas zonas intermedias con dosel disminuirán de acuerdo con los modelos de cambio climático. Finalmente los datos obtenidos permiten predecir cambios en la estequiometría del arroyo debido a las variaciones en la fotosíntesis y la composición elemental del perifiton como resultado de las modificaciones en la estructura del bosque. Las modificaciones en las condiciones lumínicas a causa del ingreso de arcillas glaciarias conllevan cambios significativos en la calidad del perifiton como recurso alimentario (debido a la variación en la composición elemental) y esto afectará al ensamble de macroinvertebrados. Al mismo tiempo el ambiente glaciario resulta hostil para los macroinvertebrados bentónicos debido al alto contenido en sólidos en suspensión. Para realizar el estudio de la estequiometría de niveles tróficos diferentes, se realizaron muestreos en los arroyos glaciarios del Monte Tronador, en donde se colectaron durante 4 años y en diferentes períodos muestras de perifiton y de macroinvertebrados bentónicos. Asimismo se realizó un experimento a campo en el que se manipularon las condiciones de luz para observar los cambios estequiométricos en los pastoreadores resultantes de la condición elemental del recurso. El arroyo más claro tuvo mayor densidad y diversidad de macroinvertebrados que el arroyo más turbio. La diversidad de macroinvertebrados del arroyo más claro estuvo positivamente afectada por la temperatura del aire y negativamente por la precipitación. Asimismo las precipitaciones afectaron la abundancia del grupo funcional más abundante en el arroyo, los pastoreadores. Meridialaris chiloeensis y Notoperla magnaspina fueron los pastoreadores más abundantes, cuyas densidades fueron afectadas negativamente por las precipitaciones y positivamente por la abundancia de su recurso alimentario (algas). La calidad del recurso alimentario dependió de la disponibilidad lumínica y la consecuente relación luz:nutrientes tanto en el campo como en el experimento. La regulación homeostática de la composición elemental de los pastoreadores dependió indirectamente de las condiciones lumínicas, debido a que el nivel de desbalance obedeció a la fijación de carbono de los productores primarios y a las relaciones con los otros elementos (N y P). La conclusión final de esta Tesis señala que los cambios en las condiciones lumínicas en los arroyos norpatagónicos, producidos por las arcillas en suspensión o por la estructura del dosel, generan una serie de cambios en el mecanismo fotosintético de los productores primarios; y en la estequiometría y la composición comunitaria del perifiton. Asimismo, estos cambios implican diferentes calidades de alimento que influyen sobre niveles tróficos superiores como los consumidores primarios.

Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) es un insecto hematófago, vector del parásito Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la Enfermedad de Chagas, considerada endémica de Argentina. En el sur de La Rioja, la persistente infestación por triatominos, fomentó que a partir del año 2008, se implementara un Programa de Erradicación de Ranchos y construcción de Viviendas Nuevas en la zona rural, con el objetivo de disminuir la infestación. Al analizar esta situación desde el contexto de la teoría de metapoblaciones, se considera que cada vivienda se comporta como un parche con distintos grados de calidad, en relación a la disponibilidad de refugios para T. infestans. De esta forma, las Viviendas Nuevas son consideradas de menor calidad comparadas con las Viviendas Rancho-Tradicionales. Los principales objetivos del presente trabajo fueron actualizar el estado de infestación en los Llanos riojanos, identificar los factores de riesgo asociados a la misma y evaluar la infestación en parches de diferente calidad y tamaño. El estudio se realizó analizando 397 viviendas con distintas Tipologías pertenecientes a los Departamentos Ángel Vicente Peñaloza, Rosario Vera Peñaloza y San Martín (Los Llanos, La Rioja) durante el período 2014-2017. Se realizaron muestreos pasivos y activos para estimar la infestación por T. infestans en los diferentes parches.Los principales resultados mostraron heterogeneidad espacial respecto a la infestación por T. infestans en el área de estudio, siendo Rosario Vera Peñaloza y San Martín los Departamentos con mayor infestación. El análisis de factores de riesgo a través de un enfoque de inferencia multimodelo, permitió ponderar las variables con mayor impacto en la probabilidad de infestación. Se observó que la Cantidad de Viviendas y su condición entomológica influyen de manera directa en la infestación de la Unidad Domiciliaria. Otras variables, como Cantidad de Estructuras Peridomésticas y Tipología de la Vivienda, no mostraron efecto cuantificable sobre la probabilidad de infestación. Durante el período estudiado, se registraron cambios en el estado de colonización y extinción de los parches entre tiempos consecutivos, permitiendo evaluar la dinámica de infestación en el área. Se constató que parches de diferentes características, incluso los considerados de baja calidad y menor tamaño, se encontraban ocupados por T. infestans. Adicionalmente, se obtuvo un registro detallado de las especies, que junto a T. infestans, invaden los parches en estudio, siendo las más frecuentes T. guasayana y T. garciabesi. La integración de estos resultados, permitió evaluar el impacto de la construcción de Nuevas Viviendas y el control químico aplicado en el área, sobre la prevalencia de infestación por T. infestans, en un contexto metapoblacional.