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La especie Paspalum notatum Flüggé (P. notatum) es utilizada como modelo en genética reproductiva vegetal debido a que presenta citotipos diploides de reproducción sexual y citotipos poliploides apomícticos y pseudógamos. Esta característica permitió evaluar: 1- El efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo y características de la semilla y fruto (efecto xenia) y 2- Las diferencias durante la formación de semillas entre citotipos apomícticos y sexuales. En el capítulo I, se exploró el efecto xenia, el cual se define como el efecto directo del genotipo del polen en el desarrollo de la semilla o fruto. Tiene gran importancia agronómica, utilizándose en el mejoramiento genético vegetal, por ejemplo, en la búsqueda del incremento del rendimiento de granos. Aunque se reportan numerosos estudios sobre xenia, su efecto a nivel molecular ha sido poco estudiado. Por ello, se realizó un estudio molecular utilizando la especie P. notatum. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1- Analizar el efecto de xenia en el desarrollo del endospermo a nivel molecular. 2- Evaluar si los genes expresados diferencialmente ejercen funciones durante el desarrollo de la semilla. 3- Explorar los procesos metabólicos y la(s) molécula(s) señal(es) que median el efecto xenia en el endospermo. Para ello, luego de tres horas de ocurrida la polinización, momento en el que ya ha ocurrido la fecundación de los núcleos polares, se realizó la comparación mediante cDNA-AFLP de una planta madre testigo sin polinizar, de genotipo Q4117 (4x apomíctico pseudógamo), con respecto a dos cruzamientos de esta madre con distintos dadores de polen: Q4117xH398 (2x sexual) y Q4117xQ3775 (4x apomíctico pseudógamo). Del análisis de la expresión génica diferencial se obtuvieron bandas únicas, tanto para el cruzamiento Q4117xH398 como para el cruzamiento Q4117xQ3775. A partir del análisis del patrón de bandas obtenidas, se encontraron 33 bandas de expresión diferencial únicas para los cruzamientos analizados, de las cuales 24 fueron secuenciadas, y se les asignó una posible función biológica mediante búsquedas blastn, blastx y blastp. Del análisis funcional de secuencias se obtuvo que siete de ellas (CG5, GA4, GA6, GG5, CG3, TG2 y CC1) presentaron homología con loci de Arabidopsis thaliana (A. thaliana) con funciones asociadas al desarrollo del saco embrionario, desarrollo del tubo polínico, doble fertilización, formación del cigoto y el endospermo. En artículos previos se puso en evidencia que al generarse fenotipos mutantes de A. thaliana para estos loci el tamaño de la silicua, el número, tamaño y el set de semillas (porcentaje de semillas llenas con respecto al número total de semillas).disminuye. Estos resultados mostraron evidencias del efecto xenia en las funciones asociadas a la reproducción y de que el genotipo del polen es uno de los factores que determinan la expresión de diferentes transcriptos que podrían estar asociados con el rendimiento de granos. Además, las secuencias CC3, GA4, GA6 y GA2 estuvieron asociadas a loci de A. thaliana que codifican para ARNm móviles, lo cual sería evidencia de que el mecanismo para xenia estaría relacionado con ARNm móviles que difundirían desde el tubo polínico por la micrópila del óvulo. En el capítulo II se trabajó en base a la teoría del número de balance endospérmico (NBE), la cual establece que la relación de las contribuciones genómicas debe ser 2materna:1paterna para el normal desarrollo del endospermo. Sin embargo, las plantas apomícticas de P. notatum son NBE insensibles. Los objetivos del presente trabajo fueron: 1) Realizar cruzamientos entre diferentes genotipos, a fin de generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica. 2) Realizar un análisis de la expresión génica diferencial 48h luego de ocurrida la polinización (LOP). Para ello, a partir del ARNm de 20 ovarios de cada cruzamiento 48h LOP, se llevó a cabo el análisis de la expresión génica diferencial mediante la técnica cDNA-AFLP. Se obtuvieron numerosas secuencias candidatas: AC1, AC2, AC3, AC4, AC5, GG1 y GG3 para ser utilizadas en futuros análisis funcionales en A. thaliana, las cuales se expresarían en distintos estadíos de desarrollo de la semilla y estarían relacionadas con el desarrollo del endospermo y con la viabilidad o no de la semilla en P. notatum. En el capítulo III se trabajó sobre el silenciamiento génico post-transcripcional en A. thaliana a patir de secuencias candidatas de P. notatum. Para ello, se evaluó en primer lugar la eficiencia del método de transformación por Floral dip mediante la expresión transitoria del gen gus. Posteriormente, se seleccionó la secuencia candidata GG13 (gen GG13) de P. notatum con el objetivo de ser silenciada en A. thaliana y se generó un hpRNA, el cual contenía las secuencias del gen GG13 en sentido y anti-sentido separadas por un intrón. Se validó el silenciamiento mediante una RT-qPCR y el subsiguiente cálculo de expresiones relativas. Además, se evaluaron caracteres fenotípicos en silicuas de plantas silenciadas y control. Los resultados obtenidos a partir del análisis fenotípico permitieron concluir que el gen GG13 afecta tempranamente el número y la forma de las semillas y el largo de silicua. Por lo tanto, se evidenció la correspondencia entre los resultados obtenidos por el análisis funcional con lo predicho por el análisis bioinformático.

El género Alternaria incluye especies fitopatógenas y con potencial para la producción de micotoxinas con implicancias en la agricultura y en la industria alimenticia. Se analizaron 60 muestras de semillas de trigo de 12 localidades trigueras de Argentina y de cinco cultivares de trigo con el objetivo de identificar morfoculturalmente los grupos de especies de Alternaria presentes. Luego se seleccionaron 10 aislamientos de cada uno de los grupos de especies presentes: A. arborescens, A. tenuissima, A. infectoria y A. alternata para realizar pruebas de patogenicidad en hojas y en semillas de trigo. Un representante de cada grupo de especies fue caracterizado molecular y bioquímicamente. Dos aislamientos de Pithomyces chartarum, especie relacionada con Alternaria, aisladas a partir de semillas de trigo fueron caracterizadas morfológicamente, y una molecular y bioquímicamente. La caracterización molecular de los aislamientos de los grupos de especies de Alternaria y la de Pithomyces chartarum confirmaron la identificación morfocultural. La presencia de los grupos de especies de Alternaria arborescens, A. tenuissima, A. infectoria y A. alternata se corroboró en todas las zonas trigueras del país. Los ensayos de patogenicidad demostraron la existencia de aislamientos pertenecientes a todos los grupos de especies de Alternaria patógenas en hojas (medido a través de la incidencia e índice de daño). Se comprobó el comportamiento patógeno de Pithomyces chartarum en semillas de trigo de los cultivares estudiados. Pithomyces chartarum y los grupos de especies de Alternaria produjeron en semillas de trigo disminución de la germinación, plántulas debilitadas y necrosis en el coleoptile. En relación a las micotoxinas, los grupos de especies A. arborescens, A. tenuissima y A. alternata produjeron alternariol, alternariol monometil éter, altenueno, altertoxina I y II, tentoxina y ácido tenuazónico. El grupo especie A. infectoria produjo altertoxina I y II y tentoxina y Pithomyces chartarum produjo alternariol y alternariol monometil éter, no citados previamente.

Phaseolus vulgaris es una leguminosa de grano de amplio interés económico y social, la cual establece una interacción simbiótica con la bacteria Rhizobium etli que resulta en la formación de nódulos fijadores de nitrógeno. En esta interacción, las plantas de origen mesoamericano son noduladas preferencial y más eficientemente por cepas de rizobios que son predominantes en la misma región geográfica. Nuestro grupo de investigación ha identificado y caracterizado varios genes involucrados en esta asociación preferencial. En la presente Tesis doctoral nos planteamos como objetivo general identificar y caracterizar a nivel funcional aquellos pequeños ARNs (sARNs) que desempeñan una función en el establecimiento de esta simbiosis eficiente. Se construyeron y secuenciaron bibliotecas de sARNs de raíces inoculadas con cepas de rizobio de alta y baja eficiencia en la nodulación o con el medio de cultivo control utilizando la tecnología Illumina. Se obtuvieron en promedio 28 millones de lecturas por biblioteca, de las cuales aproximadamente el 90 % mapearon al genoma de P. vulgaris. A partir del análisis in silico, se identificaron microARNs (miARNs) conservados y nuevos que muestran cambios en su perfiles de acumulación en respuesta al rizobio. Se seleccionó un miARN conservado, el miR390b, el cual se acumula a mayores niveles en respuesta a la cepa más eficiente. En paralelo, se seleccionó y caracterizó funcionalmente un nuevo miARN diferencial, denominado miR5924, el cual es procesado a partir de la región no traducida del transcripto que codifica para Dicer-like 1 (DCL1). Los resultados obtenidos sugieren que este nuevo miARN cumple una función clave en el establecimiento de la simbiosis. Los resultados obtenidos han permitido avanzar y profundizar el conocimiento acerca de las bases moleculares de la nodulación eficiente. A su vez, los miARNs caracterizados proveen nuevos candidatos a ser utilizados en futuros programas de mejoramiento genético que contribuyan a mejorar la fijación biológica de nitrógeno y la productividad del cultivo de P. vulgaris.

Los virus en frutilla son responsables de importantes pérdidas del rendimiento y calidad de los frutos. En Argentina se ha detectado la presencia de Strawberry mild yellow edge virus (SMYEV), Strawberry mottle virus (SMoV) y Strawberry crinkle virus (SCV). Entre 2015 y 2016 en los laboratorios del IPAVE-INTA se obtuvieron fragmentos genómicos correspondientes a un polerovirus infectando frutilla. Simultáneamente se reportó en Canadá a Strawberry polerovirus 1 (SPV1). El objetivo de esta tesis fue identificar y caracterizar específica e intraespecíficamente el nuevo virus detectado en el país, y evaluar aspectos epidemiológicos que permitan dilucidar la importancia del patógeno. Los objetivos específicos fueron: 1) Identificar y caracterizar el posible polerovirus detectado en frutilla de Argentina. 2) Implementar un sistema de diagnóstico capaz de detectar el virus en cultivo. 3) Obtener la secuencia genómica completa de virus. 4) Detectar y analizar la variabilidad específica e intraespecífica del polerovirus y su filogenia. 5) Implementar un sistema de diagnóstico sensible que permita el análisis simultáneo de los virus. 6) Evaluar aspectos epidemiológicos que contribuyan a determinar la importancia y distribución del SPV1 en zonas productoras de frutilla en relación a otros virus presentes. Los resultados confirmaron la presencia de SPV1 en Argentina, se implementó un sistema para su detección y se transmitió a plantas de Fragaria vesca var. Semperflorens ?Alpina?. Se obtuvo el 99,5% de la secuencia genómica del virus y su análisis filogenético permitió detectar que SPV1 forma un cluster diferente en el género Polerovirus. Se obtuvieron 8 secuencias del gen de la cubierta proteica del virus y se detectaron diferencias genómicas entre los aislamientos reportados, relacionadas con el origen de plantas madres. Se determinó la incidencia y prevalencia del SPV1 en las principales regiones productoras del país y su relación con los parámetros climáticos, regiones, cultivares, síntomas y su relación con SMYEV, SMoV y SCV, para los cuales se implementó un RT-PCR Multiplex para su detección. El SPV1 fue el tercer virus más frecuente de frutilla en Argentina y se relacionó de manera positiva con la región de Coronda y las precipitaciones

El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

El Virus de Epstein Barr (EBV), agente etiológico de la mononucleosis infecciosa (MNI), se asocia también a neoplasias. Si bien las causas por las cuales contribuye a la linfomagénesis están aún en estudio, la identificación de variantes virales asociadas a tumores podrían responder en parte este interrogante. Dado que LMP1 es la principal proteína oncogénica de EBV, el objetivo fue identificar y caracterizar las variantes moleculares en sus regiones promotora y codificante, y determinar su participación en la patogenia de las enfermedades asociadas. Se incluyeron 29 pacientes pediátricos con linfomas asociados a EBV, 30 con MNI y 14 controles con hiperplasia reactiva. Se amplificaron mediante PCR las regiones promotora ED-L1 y codificante, se secuenciaron y se realizó análisis filogenético. Se analizó además in vitro la actividad del promotor. Región ED-L1: se definieron 4 clados denominados según las líneas celulares B95.8, Cao, Raji and P3HR1. B95.8 fue el más frecuente (47%), pero no se asoció a a ninguna patología en particular. Se observaron mutaciones en sitios de unión a factores de transcripción, la pérdida del C/EBP disminuye 3 veces la actividad de ED-L1. Región codificante: se identificaron 6 clados (China1, China2, Med-, Alaskan, B95.8 and Argentina [Arg]) de los cuales prevaleció la variante de circulación local, Arg, (46%) potencialmente originada por recombinación Raji/China1 y que podría tener un origen africano. No se observó una asociación entre variantes específicas y linfomagénesis, aunque algunos polimorfismos tuvieron mayor frecuencia en linfomas. Se estimó una tasa de evolución acelerada en comparación a lo esperado para un herpesvirus, quizás influenciado por la presión de selección positiva sobre codones específicos. Este análisis muestra una evolución compleja de este gen y revela la importancia de su potencial utilización como marcador de variantes virales geográficas.

La senescencia foliar es el proceso del desarrollo previo a la muerte en el que la hoja se autodesmantela y libera sus componentes, v.g., nitrógeno, fósforo, posibilitando la reutilización de estos nutrientes por otras partes de la planta. A nivel celular, este proceso causa la degeneración total de los cloroplastos, donde reside la mayor parte de las proteínas foliares. El mecanismo de degradación del cloroplasto, y del resto de la maquinaria celular durante la senescencia es desconocido. El objetivo general de esta tesis fue estudiar la actividad proteolítica involucrada en la degradación masiva de proteínas foliares durante la senescencia. Se investigaron las características de la actividad de las proteasas implicadas y su ubicación subcelular, y se examinó en que compartimientos celulares tiene lugar la proteólisis. Se examinó la hipótesis de que en la degradación de proteínas cloroplásticas participan proteasas extraplastidiales, y que al menos parte de la proteólisis ocurre en otros compartimientos además del cloroplasto. En experimentos in vitro, se detectó un grupo de proteasas cisteínicas que está presente en las hojas no senescentes en forma inactiva, y cuya actividad es dependiente del pH y característica de la senescencia foliar de trigo, “natural” o monocárpica, o inducida por incubación en oscuridad o déficit hídrico.

Con el desarrollo del siguiente trabajo nos proponemos: - Caracterizar antígenos celulares de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum mediante ensayos inmunoquímicos con antisueros específicos y anticuerpos monoclonales específicos. - Caracterizar la reactividad cruzada entre antígenos de Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum. - Caracterizar la reactividad de sueros de pacientes con paracoccidioidomicosis y otras micosis frente antígenos de Paracoccidioides brasiliensis. - Desarrollar nuevos métodos inmunoquímicos de detección de anticuerpos específicos y de antígenos circulantes empleando anticuerpos monoclonales y evaluar su utilidad en el diagnóstico de la paracoccidioidomicosis.

Brucella abortus, el agente etiológico de la brucelosis bovina, es una bacteria intracelular que replica en células fagocíticas y que también infecta a humanos, por lo que la enfermedad es considerada una zoonosis. Esta enfermedad produce grandes pérdidas en el sector pecuario y de salud pública del país y del mundo. Los factores de virulencia de esta bacteria son pobremente conocidos, y el diagnóstico de la enfermedad es aún dificultoso y poco confiable. Una manera de sobrellevar estas dificultades es por medio del estudio genético de la bacteria. En este trabajo se caracterizaron tres genes y las proteínas que éstos codifican de B.abortus S19, la cepa vacunal bovina. La estrategia para conocer el rol en la fisiología bacteriana fue por un lado obtener la de los genes y buscar homologías en bancos de datos, y por otro lado mutagenizartos por intercambio alélico y estudiar el comportamiento de las cepas mutantes in vivo e in vitro. Se lograron identificar genes del operón 2-oxoglutárico deshidrogenasa y la enzima superóxido dismutasa dependiente de cobre y zinc. En el primer caso, las mutantes muestran claras diferencias con respecto a la cepa salvaje, demostrando un rol fundamental de estas proteínas en la fisiología bacteriana. En el segundo caso, la cepa mutante no muestra diferencias significativas, confirmando resultados previos, por lo que se demuestra que esta proteína no es un factor de virulencia.