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Trypanosoma cruzi es el parásito causante de la Enfermedad de Chagas, la cual continúa siendo una problemática de salud pública desatendida que merece una atención prioritaria no solo en nuestro país, sino a nivel mundial. A lo largo de su ciclo de vida, este patógeno utiliza una elaborada red enzimática para superar las barreras oxidativas y establecer la infección en el contexto del vector y del hospedador mamífero. La enzima tripanotión sintetasa (TryS), es clave ya que cataliza la biosíntesis de tripanotión (T[SH]2), el principal tiol utilizado por el sistema antioxidante de los tripanosomátidos. En este trabajo, mediante un abordaje de sobre-expresión e inhibición farmacológica, analizamos el rol de la enzima TryS en la biología de T. cruzi, evaluando su efecto sobre la proliferación, la tolerancia al estrés oxidativo y la resistencia a drogas anti-parasitarias. De acuerdo a nuestros resultados, los epimastigotes sobre-expresantes (TryShi) mostraron un menor tiempo de duplicación y mayor capacidad de metaciclogénesis. Además, tanto epimastigotes como tripomastigotes TryShi presentaron una mayor tolerancia a H2O2 y a las drogas tripanocidas utilizadas en la actualidad: benznidazol y nifurtimox. El tratamiento con inhibidores específicos de TryS, anuló estas ventajas de una manera dosis-dependiente. Por otro lado, el análisis de la interacción de los parásitos TryShi con macrófagos murinos in vitro, sugiere que la sobre-expresión de TryS tendría un efecto pro-inflamatorio y pro-apoptótico, que podría favorecer su escape temprano de la célula infectada. A través de este enfoque, se puso de manifiesto no sólo el carácter esencial de TryS para T. cruzi en condiciones normales y de estrés oxidativo, sino también que su expresión le confiere una ventaja en la resistencia frente a los fármacos utilizados para el tratamiento de la enfermedad. Postulamos que el uso de un inhibidor de esta enzima, solo o combinado con los tratamientos disponibles, podría ser una nueva estrategia terapéutica para combatir la Enfermedad de Chagas.

El virus del Mal de Río Cuarto (MRCV, Fijivirus, Reoviridae) causa la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Este virus es capaz de replicar de manera persistente y no citopática en delfácidos (chicharritas) y en el floema de varias especies de gramíneas donde provoca síntomas severos y económicamente importantes. Nuestro trabajo anterior demostró que el MRCV es una especie viral independiente de las conocidas hasta el momento cuyo genoma está formado por 10 segmentos de RNA de doble cadena que codifican para 13 proteínas (PMRCVs) e identificó aquellas proteínas estructurales. Sin embargo, aún se desconoce la función de la mayoría de las proteínas virales (en particular de aquellas no estructurales) y los mecanismos moleculares que determinan el establecimiento y desarrollo de la infección. El objetivo general de esta Tesis fue estudiar, definir y caracterizar la función de distintas proteínas codificadas por el MRCV a nivel molecular en hospedantes vegetales. En particular se propuso identificar las proteínas virales implicadas en el movimiento intercelular del virus dentro de la planta, en la producción de los síntomas del MRCV en plantas (determinantes de patogenicidad) y la(s) posible(s) proteina(s) con actividad supresora del silenciamiento de RNA. Este trabajo de Tesis representa el primer avance en la caracterización a nivel molecular de la función de 10 las 13 PMRCVs (P4, P5-1, P5-2, P6, P7-1, P7-2, P8, P9-1, P9-2 y P10) en sistemas vegetales. Para identificar proteínas del MRCV responsables del movimiento viral en plantas, se ensayó la capacidad de las distintas proteínas en estudio de complementar el movimiento de un Potato virus X (PVX) mutante, defectivo en esta función en Nicotiana benthamiana (Nb). Mediante este sistema, no fue posible identificar proteínas de movimiento entre las codificadas por el MRCV. A continuación se analizaron las características de la infección de plantas de Nb con recombinantes de PVX portando distintas secuencias codificantes para las PMRCVs. Se encontró que la expresión temprana de la proteína no estructural P7-2 produce un drástico aumento en la severidad sintomática que no es acompañado por un aumento en la acumulación viral, mientras que la expresión de P7-1 a partir del mismo vector retrasa la infección viral y reduce la severidad sintomática. Por otra parte, la presencia de los secuencias codificantes para las proteínas P9-1 (mayoritaria del viroplasma) y P10 (mayoritaria de cápside externa) en el mismo vector viral impidió el establecimiento de la infección, sugieriendo que estas proteínas podrían desencadenar una respuesta de resistencia a la infección viral en Nb. Con el objetivo de identificar proteínas del MRCV con actividad supresora del silenciamiento del RNA se utilizó un sistema modelo que se basa en la inducción del silenciamiento en plantas transgénicas que expresan GFP mediante la agroinfiltración con una cepa capaz de expresar un inductor de silenciamiento (GFP o dsGFP). Ninguna de las proteínas del MRCV evaluadas logró interferir con el silenciamiento tanto local como sistémico en este sistema. Sin embargo, mediante el uso de este sistema modelo se logró demostrar que la expresión de las proteínas no estructurales P7-1 y P7-2 codificadas por el segmento 7 del MRCV da lugar a reducciones en la acumulación del mRNA de transgenes expresados de manera transitoria o estable en un proceso que probablemente sea de origen postranscripcional. Esta actividad no había sido descripta hasta el momento para otras proteínas virales y es muy novedosa e interesante, en particular cuando se considera que la proteína P7-2 no está presente en el virus Nilaparvata lugens reovirus (NLRV) que pertenece al mismo género que el MRCV pero que es incapaz de infectar plantas. En conjunto los resultados sugieren que las proteínas P7-1 y P7-2 podrían estar implicadas en la regulación de la expresión tanto de genes virales como del hospedante durante el desarrollo de la infección del MRCV. Finalmente, al estudiar la expresión transitoria de las PMRCVs en Nb se encontró que sus niveles de expresión son bajos y que la utilización de dicotiledóneas como sistemas modelo para el estudio funcional de estas proteínas podría no ser conveniente en ciertos casos. Al analizar comparativamente el uso de codones de las PMRCVs en Nb, maíz y Nilaparvata lugens (delfácido en el que replica el NLRV), no se encontraron diferecias en el uso de codones que pudieran explicar los bajos niveles de expresión en Nb. La información y herramientas biológicas aquí generadas constituyen un gran progreso en el estudio de la actividad de las proteínas coficadas por el MRCV lo cual contribuirá al diseño de futuras estrategias efectivas de control de esta enfermedad en plantas.

Las quimerinas son una familia de GAPs (GTPase Activating Proteins) especificas para la familia de proteínas de Rac, reguladas por el segundo mensajero diacilglicerol (DAG) y los esteres de forbol. En mamíferos los genes CHN1 (o α) y CHN2 (o β) codifican para las cuatro isoformas conocidas, α1 y β1 presentan un dominio C1 y un dominio de GAP, mientras que α2 y β2 poseen un dominio adicional SH2. En el primer capitulo de este trabajo se muestra que el gen beta codifica para al menos 3 nuevas isoformas. La resolución de la estructura cristalográfica de β2-chimaerin. Se demuestra que es necesaria la unión del ligando al dominio C1 y la interacción con fosfolípidos de membrana para la activación del GAP. En el tercer capitulo se muestra que el dominio SH2 de β2-chimaerin es capaz de unir proteínas fosforiladas en tirosina y se identifican tres de estas proteínas. En el capitulo cuarto se reporta el clonado y caracterización de z-chimaerin, el producto del único gen de quimerinas presente en el pez cebra. Esta proteína posee características similares a las de mamíferos y se expresa de forma materna y zigotica a lo largo del desarrollo embrionario. En el ultimo capitulo se estudia la función de z-chimaerin en el desarrollo embrionario. Se determino que su actividad de GAP es necesaria en la capa sincitial del saco vitelino para regular el movimiento de epíboli.

El melanoma es un cáncer maligno y altamente metastásico. Siendo el interferón-alfa humano recombinante (rhIFNa) un tratamiento aprobado para el melanoma, se propone la administración del gen del IFNa/B como estrategia alternativa para la terapia del melanoma. Esto permitiría una exposición sostenida a la proteína IFNa/B producida por las células tanto tumorales como no tumorales. Ensayamos la sensibilidad in vitro a la lipofección con el gen IFN-B de tres líneas celulares de melanoma cutáneo humano y cinco líneas de melanoma mucoso canino. El gen IFN-B produjo citotoxicidad tanto en cultivos de monocapas como de esferoides. Se comprobó la existencia de un efecto bystander en la lipofección con el gen IFN-B. Por otro lado, el gen IFN-B inhibió la migración celular en cultivos de monocapas y esferoides, a través de un mecanismo dependiente de especies reactivas del oxígeno (ROS), y redujo la adhesión celular al colágeno. La droga bortezomib aumentó la eficacia antitumoral del gen IFN-B, se observó un efecto de potenciación sobre la supervivencia celular, la supervivencia clonogénica, la apoptosis y la migración celular. La inhibición de la generación de ROS disminuyó la citotoxicidad inducida por el bortezomib, y suprimió el efecto de potenciación sobre la supervivencia celular del tratamiento combinado. Dado que la efectividad anti-tumoral del gen IFN-B no fue afectada por una baja eficiencia de lipofección, estos resultados fundamentan ampliamente el potencial clínico de este abordaje.

La enfermedad de Chagas afecta a más de un millón y medio de personas en Argentina y es transmitida principalmente por la vinchuca Triatoma infestans (Klug, 1834). El control químico del vector con insecticidas piretroides constituye la herramienta más utilizada para reducir la incidencia de la enfermedad. En los últimos años se han detectado fallas de control a campo en zonas del Gran Chaco Argentino, corroborándose en el laboratorio la ocurrencia de resistencia. El objetivo de esta tesis fue avanzar en el conocimiento de la evolución de la resistencia a insecticidas en poblaciones de campo de T. infestans mediante el uso combinado de herramientas de la toxicología, la genética y la ecología. Se analizó la distribución de la susceptibilidad en 69 poblaciones recolectadas en relevamientos entomológicos realizados por el Programa Nacional de Chagas y criadas en el laboratorio. Como resultado del análisis toxicológico, el 83 % de las poblaciones resultaron susceptibles a deltametrina, todas ellas pertenecientes a las provincias de Mendoza, San Juan, Tucumán, Santiago del Estero, Formosa, Catamarca y Chaco. Sólo se hallaron poblaciones resistentes en el Departamento chaqueño de Gral. Güemes. En este lugar, se caracterizó un patrón toxicológico complejo, compuesto por un 23 % de poblaciones susceptibles, un 41 % de poblaciones con baja resistencia (sin fallas de control a campo) y un 36 % de poblaciones con alta resistencia, estas últimas con los grados de resistencia (GR) más elevados detectados hasta el momento. La totalidad de las poblaciones resistentes a deltametrina resultó susceptible a fenitrotión, remarcando la importancia de este insecticida como la única alternativa de control a campo. Los ensayos bioquímicos en las poblaciones del foco resistente evidenciaron el aumento en la actividad de las enzimas degradativas oxidasas P450 y esterasas como mecanismo contributivo de la resistencia observada. Sin embargo, frecuencias altas de la mutación puntual L925I en el sitio de acción de los piretroides (el canal de sodio dependiente de voltaje) estarían determinando los GR elevados. Finalmente, se logró explicar el 70 % de la variabilidad toxicológica del foco a partir de predictores de temperatura, precipitación y extensión del paraje. Las variables de rociado, usadas como indicadores de la presión de selección por parte del insecticida, no contribuyeron a explicar el patrón toxicológico. Se propone que el ambiente podría estar modulando la presión de selección del insecticida, promoviendo la variabilidad toxicológica en una zona de gran complejidad en cuanto al control de T. infestans. Este conocimiento busca contribuir a generar estrategias integrales de control vectorial que permitan reducir la incidencia de la enfermedad.

El objetivo principal de esta tesis fue estudiar la interacción entre las vías de MAP quinasas de Saccharomyces cerevisiae. Estas vías están representadas en humanos, donde su mal funcionamiento puede conducir a patologías tales como cáncer o problemas en el desarrollo. La complejidad de los circuitos de señalización de MAP quinasas en células de mamíferos dificulta la comprensión de como estas integran las señales que los activan. Para resolver este problema, una estrategia es analizar sistemas biológicos más simples que comparten propiedades con los más complejos. En este sentido, nos propusimos caracterizar exhaustivamente sistemas de señalización de MAP quinasas en un sistema biológico simple, la levadura S. cerevisiae. En esta tesis decidimos determinar los puntos de flujo de información entre las vías de "Respuesta a Shock Hiperosmótico" (HOG) y de "Respuesta a Feromona" (PR) de levaduras, ya que estas vías comparten componentes en sus vías de señalización y existe controversia sobre sus interacciones. A su vez, estudiamos estas vías en células individuales, estimulando las mismas controlando la dosis de los estímulos utilizados y en una variada serie de condiciones experimentales. Finalmente, medimos las respuestas de estas vías de un modo cuantitativo, estudiando su dinámica temporal y analizando el mayor número de respuestas posible en cada célula. Resumiendo los resultados obtenidos, podemos decir, que la vía de HOG no presenta osmoadaptación perfecta como se había afirmado previamente y permanece activa en estado estacionario. Su activación es mayor cuanto mayor es la osmolaridad externa, y también depende del gradiente químico de glicerol. Además, vemos una alta variabilidad de la respuesta de HOG en células individuales. A nivel de las interacciones entre las vías de MAP quinasas, determinamos que la vía PR es capaz de activar a la vía HOG en células adaptadas a alta osmolaridad. Esta compleja activación requiere de la MAPK de la vía de integridad de la pared celular (CWI) Slt2/Mpk1 y del polarisoma. La activación de HOG es pulsátil y presenta una alta variabilidad en células individuales. Los picos de actividad de HOG coinciden con eventos morfogenéticos inducidos por PR en los cuales se activa Slt2/Mpk1. La vía PR induce una salida de glicerol, que estaría mediada por Slt2/Mpk1, y este sería el mecanismo que llevaría a la activación de la vía HOG. La inducción de HOG también puede lograrse a través de la activación de Slt2/Mpk1 mediante shock térmico. Ambos tipos de activaciones (por feromona o alta temperatura) son proporcionales a la osmolaridad externa y dependen del gradiente químico de glicerol. Una consecuencia fisiológica de esta activación de HOG promovida por la vía PR es que las células en estas condiciones presentan una mejor capacidad de osmoadaptación. Finalmente, podemos agregar que los shocks hiperosmóticos inhiben a la vía PR durante la etapa de respuesta aguda, pero no hemos establecido aún los actores moleculares que median esta inhibición. Sin embargo, podemos descartar algunos componentes de la vía de HOG como Sho1, Ssk1 y Hog1. Para terminar, la alta osmolaridad, a largo plazo, en células ya adaptadas, cambia la dinámica de la respuesta de la vía PR reduciendo su sensibilidad a α factor. Esta reducción es proporcional a la osmolaridad externa. Esperamos que los resultados encontrados en este sistema biológico sean de utilidad, para pensar de una manera más integrativa, como se comporta la dinámica de la respuesta en un dado sistema frente a múltiples señales externas, de acuerdo a como el mismo las integra globalmente.

Este trabajo estudia el contenido polínico de los recursos de la colmena (cargas corbiculares y miel inmadura) de un colmenar y de la producción de miel del mismo colmenar en la región del Delta del Río Paraná. El colmenar produce dos cosechas de miel anuales. La variabilidad intra-anual esta relacionada con la sucesión fenológica de las floraciones, y la inter-anual con el clima. El contenido de la miel inmadura refleja la floración de la vegetación que rodea las colmenas. La miel madura muestra un enriquecimiento en el polen de las floraciones tardías. El origen floral de las cargas corbiculares varió a Io largo de la temporada, en cantidad, diversidad y calidad de la cosecha. Un incremento de la densidad de 0,5 a 12,5 colmenas por hectarea no produjo diferencias ni en el contenido polínico de las cargas ni en el de la miel con respecto al histórico del colmenar. El trabajo permitió establecer el momento de la temporada en que los apicultores podrian trabajar en la producción de mieles monoflorales. La variabilidad de las floraciones de una temporada a otra hace difícilpredecir la magnitud de estas cosechas.

El sistema de barros activados es uno de los modelos más estudiados en ecología microbiana. En las últimas décadas se han realizado grandes avances en el conocimiento de la composición de las complejas poblaciones microbianas participantes en dicho proceso. Si bien se ha visto que las variables ambientales y operativas son factores críticos en la estructuración de las comunidades bacterianas, aún son escasos los estudios sobre los diferentes niveles tróficos presentes en el sistema. El objetivo de este trabajo es comprender la influencia de factores bióticos y abióticos en la estructura y dinámica de los diferentes niveles tróficos de comunidades microbianas de un sistema de tratamiento de efluentes cloacales. Para ello, se estudiaron los tres niveles tróficos principales de los barros activados: bacterias, eucariotas y bacteriófagos, en una planta de tratamiento de efluentes domiciliarios de Buenos Aires. El período evaluado comprendió tres años en los que la planta operó bajo un gradiente creciente de tiempo de residencia de sólidos (TRS) y atravesó una etapa de fluctuaciones operacionales. Los microorganismos eucariotas se analizaron por microscopía mientras que la composición bacteriana se estudió por secuenciación de amplicones de la región hipervariable V3-V4 del gen ARNr 16S y secuenciación al azar sobre el ADN metagenómico. La presencia y abundancia de bacteriófagos se siguió por secuenciación al azar del ADN presente en el sobrenadante (metaviroma). Luego del co-ensamblado de los 60 metagenomas, de la serie temporal, se utilizó una metodología de binning basada principalmente en cobertura diferencial con la que se reconstruyeron 257 genomas. Los perfiles de co-ocurrencia de especies bacterianas resultaron altamente dependientes del régimen operativo, donde el período de fluctuaciones y de bajo TRS, fue dominado por filos mayormente compuestos por estrategas-r (copiótrofos); contrastando con el período de alto TRS, en el que predominaron los estrategas-K (oligótrofos). La partición de poblaciones bacterianas en base a diferencias en las estrategias de crecimiento fue confirmada por la determinación del número de operones ARN ribosomales (rrn) estimados a partir de los genomas ensamblados. Por su parte, el índice biótico de barros (SBI), basado en la abundancia y diversidad de protozoos, correlacionó positivamente con la abundancia total de bacterias oligotróficas, apoyando el uso del SBI como indicador para el control de calidad del tratamiento y reflejando la modulación por depredadores eucariotas. Finalmente, los cambios en la composición de fagos reflejaron un patrón similar al revelado por las poblaciones bacterianas. La reducción en la abundancia relativa de virus de la familia Podoviridae y el correspondiente aumento en Siphoviridae que acompañan el aumento en TRS es consistente con el hecho de que los Podoviridae infectan principalmente Proteobacteria, mientras que sifovirus pueden ser lisogénicos por varias generaciones, un comportamiento que ha sido asimilado a estrategas K. Las interacciones entre los fagos y las poblaciones bacterianas, detectadas a través de la búsqueda de elementos CRISPR y por similitud de secuencias, permitieron la identificación de mecanismos de interacción tipo Lotka-Volterra depredador-presa, así como de modelos alternativos de interacciones múltiples, en los que un fago infecta a más de un hospedero y/o un hospedero es infectado por más de un tipo de fago. Se concluye que los parámetros de proceso determinan la composición de poblaciones bacterianas en base a sus estrategias de crecimiento, mientras que sobre esta estructuración, determinada por factores abióticos, se superpone una modulación fina mediada por depredadores.

La colocación inmediata de implantes dentales postexodoncia en alvéolos infectados sigue siendo un tema controvertido en implantología oral. Objetivos: Evaluar los resultados de la colocación inmediata de implantes dentales en alvéolos infectados con respecto al nivel del hueso marginal y la estabilidad del implante en comparación con implantes colocados en los alvéolos sanos y evaluar un procedimiento de limpieza a fin de eliminar los microorganismos presentes en estas situaciones. Material y Métodos: Fueron seleccionados cincuenta (50) pacientes con dientes con infecciones crónicas que requieren extracción y recibieron 50 implantes dentales. (Grupo E). Todos los casos fueron dientes unirradiculares en el maxilar superior. Se evaluaron los aspectos microbiológicos y el procedimiento de limpieza tomando una secuencia de muestras para cultivos de la siguiente manera: 1-Muestra del fluido crevicular. 2- Muestra luego de la extracción del diente. 3- Muestra después del desbridamiento utilizando curetas manuales y 4- Muestra después de aplicar ácido cítrico al 2% durante 1 minuto. Después de esto, los implantes fueron colocados y se tomaron Valores Periotest (VPT) iniciales y el nivel de hueso marginal. A los 4 meses (segunda fase), antes de iniciar la parte protésica, se registraron nuevos valores Periotest y nivel de hueso marginal. Otros datos se obtuvieron a los 12 y 24 meses. Cincuenta implantes colocados en alvéolos sanos en cincuenta pacientes sirvieron como control. (Grupo C) Resultados: Se produjo un fracaso en cada grupo durante el período de evaluación. Los valores Periotest (VPT) promedio en el grupo E fueron: Inicial: -3,19 (0,66), 2da Fase: -3,77 (0,29), 12 meses: -3.89 (0,15) y 24 meses: -3,95 (0,12). Mientras que los valores Periotest promedio en el grupo E fueron: Inicial: -3,25 (0,90), 2da Fase: -3,91 (0,72), 12 meses: -3,99 (0,23) y 24 meses: -4,03 (0,27). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. El nivel óseo marginal fue considerado cero al inicio, con el fin de evaluar luego los cambios. El nivel óseo promedio, en milímetros, en el grupo E fue: 2da Fase: -0,21 (0,12), 12 meses: -0,52 (0,35) y 24 meses: -0,61 (0,24). El nivel óseo promedio, en milímetros, en el grupo C fue: 2da Fase: -0,18 (0,07), 12 meses: -0,55 (0,17) y 24 meses: -0,67 (0,23). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Los microorganismos más comúnmente encontrados fueron Streptococos grupos C, H (S. sanguis) y K (S. salivarius), Staphylococcus aureus, Bacteroides forsythus and Fusobacterium nucleatum. También se observó Candida albicans en algunas muestras. Los antimicrobianos más eficaces fueron ciprofloxacina, amoxicilina más ácido clavulánico y metronidazol. Fluconazol fue el antimicótico más eficaz. El desbridamiento manual con curetas no fue capaz de producir una limpieza adecuada del alveolo. Sin embargo, la misma mejoró después de la aplicación de ácido cítrico al 2% como se demostró en los cultivos. Conclusiones: Dentro de las limitaciones del presente estudio, la colocación de implantes inmediatos en alvéolos infectados podría ser considerado un procedimiento predecible. No hubo diferencias estadísticamente significativas en comparación con los implantes colocados en los alvéolos sanos. El desbridamiento manual por sí solo no fue suficiente para realizar una limpieza adecuada. En este estudio, el ácido cítrico al 2% mostró resultados interesantes en cuanto a control microbiológico. Los Valores Periotest mejoraron durante los 2 años de seguimiento. El nivel del hueso marginal mostró una cierta pérdida, pero esta fue similar en ambos grupos.

Fil:Pando, Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.