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Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales

Entre las plagas principales y recurrentes en las producciones de frutas de pepita se encuentra la “Carpocapsa” (Cydia pomonella Linneaus (Lepidoptera: Tortricidae)). Su control se basa en el empleo de insecticidas químicos con todos los riesgos medioambientales que acarrean, por lo que otros métodos que contemplen organismos benéficos, como tecnologías que tengan a Bacillus thuringiensis como base, constituyen una alternativa eficaz y ambientalmente segura. En este estudio se trabajó en la construcción e identificación de proteínas de esta bacteria entomopatógena tóxicas para larvas de C. pomonella, consolidándose en el laboratorio, una estrategia para el clonado y expresión de genes cry en B. thuringiensis. Se evaluó la toxicidad individual y de mezclas de protoxinas Cry, en base a lo que se propone que Cry1Aa y Cry1Ab podrían ser usadas para el control de C. pomonella. El uso simultáneo de Cry1Ab/Cry1Ia en organismos genéticamente modificados podría ser utilizado debido a que mostraron efecto sinérgico. El uso combinado de Cry1Aa/Cry2Aa y Cry1Ab/Cry2Aa debería ser evitado porque mostraron un antagonismo moderado. Se estudió la biodiversidad natural de B. thuringiensis en larvas vivas y sanas de C. pomonella. La estrategia de aislamiento resultó factible pero ninguno de los aislamientos resultó portador de los genes cry más difundidos, ni de las toxinas significativamente tóxicas para las especies estudiadas. Asimismo, se trabajó en la selección de las cepas más tóxicas conteniendo las proteínas insecticidas más activas para C. pomonella. Se realizó la caracterización genotípica y fenotípica de las mismas, la cual mostró gran similitud con la cepa de referencia B. thuringiensis HD-1. Finalmente se analizaron los componentes de un medio de cultivo líquido que influyen en la producción de proteínas insecticidas de la cepa nativa de B. thuringiensis INTA H42-1, en el cuál la glucosa constituyó un componente importante del caldo BM que influyó significativamente y positivamente en la producción de proteínas.

La toxoplasmosis congénita, es la segunda infección transplacentaria más frecuente. Y cuando sucede, existen altas probabilidades de afección de la salud del futuro niño. Pero la toxoplasmosis congénita sólo es posible cuando la madre se encuentra en la fase aguda de la toxoplasmosis. En tales casos, hay tratamientos para evitar que el parásito alcance al gestante, pero estos son peligrosos. Por ello, no deben indicarse a menos que se tenga total seguridad de que la mujer se encuentra en la fase aguda de la infección. En el presente trabajo se evaluaron diferentes regiones de las proteínas P22, P30 y P35 (específicas de la fase aguda) del parásito Toxoplasma gondii, como antígenos recombinantes en ensayos de diagnóstico clínico para diferenciar las fases de la infección. Las diferentes regiones se ensayaron por separado en ELISAs indirectos detectando individualmente anticuerpos específicos IgG, IgA e IgM; en ensayo de avidez; en dot blot y en dot blot semicuantitativo. Además, se realizó un estudio de las proteínas a través de bioinformática. Mediante el cual se consiguió explicar los diferentes resultados de los ensayos experimentales, principalmente logrando ubicar las regiones antigénicas de las proteínas. Respecto a la detección de la fase aguda de toxoplasmosis, se obtuvieron resultados significativos empleando las secuencias antigénicas denominadas P22c y P35B; con la detección de IgG mediante ELISA y con el ensayo de avidez. Inclusive se alcanzó una sensibilidad y especificidad del 100 % al medir avidez de los anticuerpos contra P35B

Tesis presentada para optar al título de Doctor en Ciencias Biológicas, presentada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Airres, el 15 de noviembre de 2018

En el presente trabajo se mostró que la expresión de versiones mutantes de RabA2 y ARFA1 en raíz interfirió en su localización subcelular y afectó el tráfico de vesículas entre membranas. Esto remarca la importancia del tráfico de vesículas en eventos de crecimiento polar que tienen lugar en la simbiosis. En particular, los resultados obtenidos en raíces transgénicas de P. vulgaris que expresan variantes mutantes de RabA2 sugieren que la maquinaria molecular implicada en el crecimiento polar durante la infección por el IT es la misma que participa en otros procesos de crecimiento polares, como el que tiene lugar en el pelo radical y en el crecimiento del tubo polínico. Los resultados obtenidos para esta GTPasa monomérica en P. vulgaris proveen evidencias esta proteína está implicada en mecanismos moleculares que determinan la preferencia de cepas más eficientes durante la formación del IT. El conocimiento de estos procesos es clave para la manipulación genética en leguminosas que genere plantas capaces de discriminar y seleccionar las cepas de rizobios más eficientes. En la última etapa de la tesis, se realizó un análisis de transcriptómica por RNAseq para analizar los mecanismos moleculares asociados a la señalización por rizobio. Los datos generados a partir de RNAseq constituyen una fuente de información valiosa para analizar los procesos biológicos que ocurren en etapas tempranas de la nodulación. El análisis permitió detectar que las moléculas de EPS, LPS y NF modulan vías de señalización por hormonas, probablemente implicadas en la regulación de las respuestas de defensa de la planta. Además, es posible hipotetizar que los receptores identificados en este análisis participen en el reconocimiento del rizobio en las etapas de la infección. Otro resultado de interés fue la gran proporción de genes diferenciales que codifican TFs y proteínas de remodelación de pared celular regulados por NF, EPS y LPS. Los resultados permiten especular sobre los procesos que tienen lugar durante la infección, sin embargo, será indispensable realizar ensayos de RT-qPCR para validar los datos de RNAseq y realizar análisis funcionales para estudiar la participación de los genes candidatos en la simbiosis fijadora de nitrógeno. Asimismo, logramos identificar dos genes diferenciales que participan en el mecanismo de acción de sRNAs que participan en producción de tasiRNAs y en la modificación de la cromatina (argonautas y metilasas de DNA), que constituye un proceso biológico poco explorado en simbiosis.

Goya, M. E. (2018). Estudio de las bases moleculares de los ritmos circadianos en C. elegans mediante un sistema reportero luminiscente. (Tesis de posgrado). Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina.

Las hipótesis de trabajo planteadas en esta Tesis Doctoral fueron las siguientes: a) Las células intersticiales (CI) de la glándula pineal de vizcacha exhiben variaciones citológicas e inmunohistoquímicas estacionales, sugiriendo una activa participación en la función glandular b) Las células pigmentadas (CP) de la glándula pineal de vizcacha se modifican en relación a los esteroides gonadales. Nuestro modelo de estudio fue la vizcacha, un roedor autóctono de hábitos nocturnos. En machos, la condición reproductiva fue determinada por histología testicular y se trabajó con ejemplares adultos para estudios estacionales y con inmaduros sexuales para estudios relacionados con la edad. En hembras, la condición reproductiva se determinó por histología de ovarios y la preñez se clasificó en inicial, media y final. Para el estudio estacional, relacionado con la edad y el sexo de las CI, se realizaron técnicas histológicas e inmunohistoquímicas utilizando como marcadores a las proteínas S-100, glio-fibrilar acídica (GFAP) y vimentina. Para estudiar las CP se utilizaron diversas técnicas histológicas e histoquímicas. Se complementaron los estudios para ambos tipos celulares con microscopia electrónica de transmisión y determinaciones séricas de testosterona, estradiol y progesterona. El estudio estacional de las CI reveló que el porcentaje de área inmunopositiva para S-100 y GFAP (%AI-S-100 y %AI-GFAP) fue más alto en los animales capturados en invierno y menor en los de verano. En inmaduros sexuales, los parámetros morfométricos fueron menores que en las vizcachas adultas. Durante la preñez media, los % AI-S100 y % AI-GFAP fueron los más altos en comparación a las no preñadas cuyos valores fueron los más bajos. Las CP fueron frecuentes en hembras y excepcionales en machos. Aquellas vizcachas en preñez media presentaron mayor porcentaje de CP respecto de las no grávidas. Finalmente, los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis Doctoral nos permiten demostrar y aceptar las hipótesis planteadas. Además, podemos concluir que ambos tipos celulares; CI y CP, son necesarias para garantizar un adecuado microambiente celular en la glándula pineal de la vizcacha, asegurando así su óptima función neuroendocrina.

Tesis presentada para optar al grado de Doctor en Ciencias Naturales en la Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata en 2016.

Los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) son simbiontes obligados que proporcionan importantes servicios ecosistémicos, entre ellos la mejora en la nutrición fosforada de las plantas. En las últimas décadas, ventajas económicas sumadas al uso de la siembra directa y de variedades genéticamente modificadas favorecieron una masiva expansión del cultivo de soja, incluso en lotes dedicados a explotaciones ganaderas o áreas silvestres. El objetivo general de esta tesis fue estudiar comunidades nativas de HFMA asociadas al cultivo de soja en agroecosistemas del Sur de la Provincia de Córdoba, con énfasis en la nutrición fosforada del cultivo. Se realizó un muestreo en 126 lotes de soja correspondientes a zonas de historial agrícola, mixto, y de reciente deforestación de las sierras cordobesas. En primer lugar, se cuantificó el nivel de micorrización de las raíces de soja y la infectividad micorrícica de los lotes y se correlacionaron con variables medidas en el suelo y en el cultivo. Se observó que la totalidad de las plantas estaban colonizadas por HFMA, pero en menor cantidad en suelos arenosos y bien provistos de fósforo (P). La misma tendencia se observó con el grado de infectividad micorrícica. Esta variable se correlacionó positivamente con el carbono (C), arcilla y agua del suelo, y con la acumulación de materia seca y P de las plantas de soja. Posteriormente se analizó la estructura de las comunidades nativas de HFMA mediante identificación taxonómica de esporas (suelo) y por secuenciación del gen 18S SSU rRNA (suelo y raíces). Las esporas mostraron una mayor riqueza y diversidad de especies en los sitios recientemente deforestados. El P del suelo afectó en forma negativa a estos parámetros e impactó significativamente sobre la composición de las comunidades. Mediante secuenciación del gen 18S SSU rRNA se observó que las comunidades de HFMA del suelo no difirieron entre las tres zonas de estudio y que el gradiente textural fue la variable más influyente. En las raíces, en cambio, la zona agrícola tuvo una comunidad de HFMA diferente a la hallada en las zonas mixta y de las sierras. También se halló un efecto significativo de la textura, los suelos arcillosos fueron más ricos en especies dentro de las raíces que los arenosos. Finalmente, se realizó un experimento en macetas con plantas de soja en presencia y ausencia de micorrizas nativas, con alta y baja disponibilidad de P. Se utilizó como inóculo suelo de un ensayo de 40 años de monocultivo de soja sin fertilización. Se midieron variables relacionadas a la simbiosis micorrícica, al crecimiento, acumulación de P y partición de fotoasimilados. Se observó que la oferta de P afectó negativamente el nivel de micorrización, la longitud de hifas extra-radicales y la actividad de estructuras micorrícicas dentro de la raíz. Sin embargo, independientemente de la oferta de P, las micorrizas promovieron mejoras en el crecimiento de las plantas de soja. La mayor demanda de fotoasimilados de las raíces para mantener a la simbiosis micorrícica no afectó negativamente el crecimiento de las plantas. En general, se concluye que las comunidades nativas de HFMA, tanto del suelo como de las raíces, fueron diferentes según el historial de las zonas de producción de soja, y que la textura y P del suelo fueron factores determinantes de su composición. No se halló evidencias para descartar beneficios atribuidos a la simbiosis aún en niveles de suficiencia de P. La información generada en esta tesis aporta conocimiento sobre la importancia y prevalencia de estos organismos en los agroecosistemas actuales.

El objetivo general del estudio es conocer la dinámica de las comunidades de aves asociadas a bosques de Ñire (Nothofagus antartica) del Noroeste de Chubut, sometidos a diferentes tipos de impacto. El estudio se desarrolló entre julio de 2008 y junio de 2010, realizándose muestreos de campo trimestrales. Se estudiaron ñirantales sometidos a los siguientes usos: extracción de leña por parquizado y por manchones, bosques incendiados hace 15 y 25 años, bosque convertido a pasturas y como testigos se consideraron ñirantales primarios. El área de muestreo se encuentra dentro de la cuenca del río Futaleufú, entre los meridianos 71º23’ y 71º36’ O y los paralelos 43º05’ y 43º14’ S y la altura de los sitios de muestreo fluctuó entre 525 y 855 m.s.n.m. Los objetivos específicos del trabajo fueron: 1) realizar el inventario de la avifauna representada en los ñirantales del centro-oeste de Chubut, 2) determinar la abundancia, riqueza específica, diversidad y, caracterizar la estructura de las comunidades de aves asociadas a ñirantales sometidos a diferentes impactos, 3) determinar la magnitud de los cambios intra e interanuales en la estructura de la comunidades de aves, 4) caracterizar los gremios tróficos asociados a la estructura de la vegetación y a la comunidad de artrópodos y, 5) analizar la estructura de la comunidad de aves según sus niveles de conservación. Por cada tipo de impacto se consideraron 2 réplicas (en total 12 sitios de muestreo) para el muestreo de la vegetación y, en cada sitio de muestreo se seleccionaron al azar tres parcelas de 100 m2 cada una. Los muestreos de frutos fueron realizados durante el verano en las cinco especies que más frutos ofertaban en cada réplica. Para las capturas de artrópodos se utilizaron trampas fluid interception, sticky traps y se obtuvieron muestras del dosel de la vegetación y del suelo mediante el uso de sacabocados. A partir del material recolectado se calcularon los principales índices biológicos. Los muestreos de aves fueron realizados trimestralmente mediante dos técnicas: puntos de conteo (PC) y línea transecta (LT). En cada uno de los sitios de muestreo se ubicaron tres LT de 350 metros cada una y seis PC. En base a los datos registrados se calcularon los principales índices biológicos, el Índice SUMIN, el Índice SUMIN máximo, la categorización de conservación y se describió la estructura trófica. Para todos los casos en donde se realizaron comparaciones, se utilizó el número de especies (S) y el número de individuos (N). Los ñirantales primarios presentaron un estado de conservación adecuado, lo cual permite la preservación de su variabilidad espacial y estacional. En el estrato arbustivo de los sitios perturbados por incendios se observó una clara disminución de especies de origen nativo y un mayor porcentaje de especies de origen exótico. En dichos sitios el estado sanitario de los ñires fue bueno, siendo bajo su diámetro, lo que se corresponde con el estado de regeneración de los individuos. En el estrato arbóreo de los sitios con extracción de leña por manchones y por parquizado predominaron especies pertenecientes al estrato arbóreo de origen nativo tales como Ñire y Maitén. Estos Ñires presentaron un estado sanitario fluctuante entre deficiente y muy bueno y, un tamaño relativamente grande, aunque no se registraron renovales debido a la actividad ganadera que no favorecen el renuevo del bosque. Los sitios convertidos a pasturas presentaron la mayor cobertura de especies pertenecientes al estrato herbáceo de origen nativo. Allí no se registraron especies pertenecientes al estrato arbóreo, encuentrándose seriamente comprometida la regeneración y rehabilitación del bosque de Ñire. Los artrópodos asociados a los diferentes usos de los ñirantales se mantuvieron activos durante todo el año, tolerando condiciones extremas durante los meses fríos y presentando picos de actividad durante los meses más cálidos. No se observaron diferencias en cuanto a la abundancia de los órdenes representados en los sitios sometidos a diferentes tipos de impacto, e incluso la riqueza e índices de diversidad, dominancia y equitatividad fueron similares entre los sitios. La variación estacional de la abundancia de los órdenes de artrópodos, los índices de diversidad y de dominancia estuvo relacionada con las condiciones climáticas, principalmente la temperatura y la fenología de la vegetación independientemente del tipo de impacto. La abundancia de individuos de los artrópodos representados en las capturas aumentó con el incremento de la cobertura del estrato arbóreo. Sin embargo, en los sitios convertidos a pasturas se observó una relación inversa entre el número de individuos, la cobertura del estrato herbáceo y la temperatura. Este patrón se explicaría por las mayores temperaturas relativas, las que en pasturas afectan negativamente a los artrópodos y, por la menor heterogeneidad de estos ambientes, lo que está asociado a una menor disponibilidad de micro-hábitats. Las técnicas de muestreo, mediante muestras provenientes de las trampas “Sticky traps”, “Fluid interception”, y del dosel de la vegetación capturaron una mayor cantidad de individuos del orden Díptera, debido a que son más eficientes en la captura de individuos voladores. Las muestras provenientes de las trampas “Fluid interception”, del suelo y del dosel de la vegetación fueron más abundantes y diversas que las provenientes de las trampas “Sticky traps”. La diversidad de los órdenes artrópodos asociados a bosques de Ñire fue similar entre los sitios de muestreo, no siendo afectados drásticamente por las perturbaciones derivadas de la extracción de leña por parquizado y por manchones y de los incendios dado que en éstos sitios se mantuvo la cobertura vegetal con hábitats y condiciones microclimáticas favorables. Sin embargo, en los bosques convertidos a pasturas las condiciones microclimáticas y los hábitats se encuentran drásticamente modificados, lo que afecta la dinámica comunitaria de los artrópodos. Con respecto a la avifauna, se registraron un total de 49 especies mediante el método PC y 44 especies mediante LT, este bajo número de especies es propio de los bosques andino-patagónicos debido a: a) la insularidad de los bosques andino-patagónicos, b) movimientos orogénicos, c) glaciación relativamente reciente y, d) fríos extremos en el semestre otoño-invierno. La riqueza específica (13 – 29), la abundancia de individuos (1,73 – 10,44 indv./ha/estación), la diversidad específica (0,55 – 2,05), y el índice de conservación (9,5 – 12,5) variaron según el tipo de ñirantal considerado. Se observó mayor abundancia, riqueza específica y diversidad de aves en los ñirantales sometidos a disturbios intermedios, principalmente ñirantales con extracción de leña mediante parquizado, seguidos por ñirantales incendiados hace 15 años y 25 años, luego ñirantales con extracción de leña por manchones, observándose los menores valores en los ñirantales transformados en pasturas y en los primarios. Los ñirantales primarios poseen una comunidad de aves con especies de mayor nivel del índice de conservación, emblemáticas o vulnerables debido a que en este sitio: 1) es el único donde se encuentra el Carpintero Gigante Patagónico considerado especie clave para la conservación de los bosques templados, 2) cuenta con la totalidad de los Rhinocríptidos, grupo altamente sensibles a los cambios del hábitat, 3) habitan la totalidad de los carpinteros propios de los bosques maduros, 4) se observó una alta relación aves residentes/aves migradoras, por lo que poseen una comunidad de aves de alta estabilidad ecológica. Lo mencionado está generado por la existencia de árboles de gran porte y de alta heterogeneidad en cuanto a su estado sanitario, y por la presencia de vegetales con gran oferta de frutos (Maytenus, Rosa Mosqueta y Laura). En todos los ambientes predominó el gremio de las aves insectívoras, seguido por el de las aves granívoras. Este patrón es común en el bosque andino-patagónico debido principalmente a que los artrópodos son generalistas y se encuentran presentes durante todo el año. La única excepción se observó en los ñirantales convertidos en pasturas donde el gremio carnívoro secundó a los insectívoros. La relativa baja abundancia de aves granívoras se debería a que el ganado y los roedores eliminan los granos. En la totalidad de los sitios, con respecto a la abundancia y riqueza específica de las aves se observó una relación positiva con la temperatura del aire y negativa en relación al viento. Las variables que mejor explican la dinámica de la avifauna se encuentran la equitatividad, diversidad y abundancia de artrópodos, abundancia de dípteros, transitabilidad, la temperatura del aire, velocidad del viento, y abundancia de frutos de Maytenus, Rosa Mosqueta y Laura. La metodología mediante PC resultó ser más eficiente que la LT. Las diferentes acciones antrópicas afectaron en distintos niveles la comunidad de aves siendo los ñirantales primarios el último relicto para la conservación de las especies emblemáticas, vulnerables o de importancia para su conservación, y por ello se debe evitar continuar con la fragmentación del paisaje y propender a ambientes en mosaicos continuos de tal modo que esos corredores permitan mantener el hábitat lo mas adecuado posible para el natural desarrollo de la biodiversidad de los ñirantales del bosque andino-patagónico.