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La hipótesis que se pretende demostrar en este trabajo es que los complejos de vanadio ejercerían acción antitumoral por medio de mecanismos que regulan la adhesión, migración y proliferación de células neoplásicas, como así también regulando la actividad de macrófagos. Los mecanismos de acción podrían involucrar efectos proapoptóticos mediados por la mitocondria y / o la generación de estrés oxidativo a través de la producción de ROS y especies reactivas de nitrógeno (RNS). Objetivos 1.- Sintetizar, caracterizar y estudiar la estabilidad de complejos de vanadio en solución y en estado sólido. 2.- Analizar la potencia citotóxica de los complejos de vanadio sobre cultivos de células óseas. 3.- Evaluar la generación de ROS y RNSy su eventual relación con los procesos apoptóticos así como también con la potencia citotóxica. 4.- Analizar los efectos de los complejos de vanadio sobre los procesos metastásicos (adhesión, invasión y clonogenicidad). 5.- Estudiar el efecto de los complejos sobre la activación de células macrofágicas en cultivo.

En la agricultura se utiliza una amplia variedad de biocidas, los cuales luego de su aplicación migran hacia los sistemas acuáticos y pueden producir diferentes efectos sobre la fauna acuática, dentro de la cual encontramos a los cangrejos de la especie Zilchiopsis collastinensis (Decapoda: Trichodactylidae). Clorpirifós es letal a concentraciones menores que endosulfán, siendo en ambos casos los embriones más resistentes que los adultos. La exposición a estos biocidas puede causar modificaciones en las células hepatopancreáticas, especialmente en las células F y B, relacionadas con los procesos de detoxificación. Estos plaguicidas no producen efectos en los índices gonadosomáticos y en el volumen de los ovocitos, pero pueden producir aumentos en la proporción de ovocitos atrésicos, especialmente aquellos expuestos a clorpirifós. Las concentraciones de endosulfán bioacumuladas en hepatopáncreas fueron decreciendo a medida que disminuyeron las concentraciones en agua. Las concentraciones en gónadas se mantuvieron en el tiempo, sin observarse diferencias entre las concentraciones de exposición. La exposición de embriones a ambos plaguicidas causó aumentos en el tiempo de incubación, disminución en la eclosión efectiva y en la supervivencia de los neonatos. El metabolismo de los juveniles fue modificado por la exposición a endosulfán, disminuyendo el consumo de proteínas y aumentando el consumo de lípidos como sustrato energético. Los cangrejos de esta especie son resistentes a plaguicidas. Sin embargo las concentraciones subletales pueden producir efectos que a largo plazo causen la muerte de los individuos, disminuyendo la población. Debido a las características que posee, esta especie podría utilizarse en campañas de biomonitoreo.

En los últimos años, la expansión de la frontera agrícola de la mano de la “nueva revolución verde” condujo a la adopción de nuevas tecnologías por parte de los productores agrícolas. La fragmentación del hábitat y la contaminación de los recursos por la aplicación de plaguicidas tienen efectos sobre la biodiversidad nativa, afectando sus poblaciones. Los anfibios anuros se encuentran en retroceso numérico y han sido clasificados como organismos bioindicadores de la calidad ambiental. Es conocido que algunos plaguicidas producen efectos en las gónadas de los anfibios, afectando de manera directa su reproducción, aspecto esencial para la supervivencia de las especies. En este contexto, el objetivo del presente trabajo de tesis doctoral fue estudiar el efecto del herbicida glifosato sobre la diferenciación gonadal de Leptodactylus latrans. En el primer capítulo, se desarrolló el estudio de la biología reproductiva de L. latrans con el objetivo de poner a punto el método de inducción artificial de la reproducción en esta especie. Para ello, se realizó un monitoreo continuo durante noviembre de 2013 y febrero de 2016, en cinco sitios de estudio previamente seleccionados con escasa perturbación. Con la intención de conocer la variación en las variables e índices morfométricos externos como predictores de la condición reproductiva, se colectaron machos y hembras adultos de L. latrans diferenciando en épocas reproductiva y post-reproductiva. Se registraron longitud hocico-cloaca (LHC), distancia inter-ocular externa (DIOE), diámetro del vientre (DV), peso corporal (PC), peso de la gónada (PG), de los cuerpos grasos (CG) y del hígado (H). Con estas variables, se calcularon los índices de condición corporal (K) = P/LHC3, de condición reproductiva (ICR) = DV/DIOE, gonadosomático (IGS) = (G/P)*100, de cuerpos grasos (ICG) = CG/P, e índice hepatosomático (IHS) = (H/P)*100. Asimismo, y con el objetivo de caracterizar y actualizar algunas condiciones propias del micro-hábitat de desove, así como parámetros de los nidos de espuma en poblaciones locales de L. latrans, se registró la profundidad del agua, forma, diámetro mayor y menor del nido, diámetro del orificio central, volumen del nido y número de huevos por desove (fecundidad). Se colectó un total de 102 individuos, 47 machos y 55 hembras. Los índices morfométricos externos que mostraron diferencias significativas entre hembras en condición reproductiva y post-reproductiva fueron el ICR (p < 0,0001) y el K (p = 0,045); aunque éste último con menor grado de significancia que el primero. De acuerdo a estos resultados, se determinó al valor promedio del ICR en el grupo reproductivo (ICR = 2,53), como el mínimo valor al cual las hembras se encuentran maduras para reproducirse, y en el cual la inducción hormonal de la reproducción podría resultar efectiva. No se observaron diferencias significativas al comparar las variables e índices morfométricos de los machos en condición reproductiva y post-reproductiva (p > 0,005). Se estudiaron un total de 36 nidos de espuma, de los cuales se obtuvo que los mismos son depositados en cuerpos de agua a una profundidad promedio de 10,24 ± 3,91 cm, y una temperatura de 25,61 ± 1,2 °C. Los nidos presentaron distinta morfología, resultando predominante la amorfa (68,75% de ocurrencia). El diámetro mayor promedio fue de 42,77 ± 15,09 cm, y el volumen promedio registrado de 880 ± 775,6 ml. La fecundidad promedio resulto de 23.236 ± 10.874 huevos. Como resultado adicional de los monitoreos, se puede destacar el hallazgo de nidos comunales y la actividad de machos satélite. Si bien el hallazgo de machos satélite ya había sido previamente documentado en esta especie, los nidos comunales representan una novedad para la biología reproductiva de la especie, e incluso para el género Leptodactylus. Con el objetivo de poner a punto el método de inducción hormonal de la reproducción en L. latrans, se realizaron 5 experimentos de inducción, en época estival, con individuos colectados de los sitios de estudio. Se utilizaron para los mismos distintos volúmenes de agua y naturaleza del sustrato, y se varió la utilización o no de un cebado previo a la inyección hormonal, que se realizó de acuerdo al método AMPHIPLEX. Las parejas fueron monitoreadas diariamente 1 a 3 veces por día, durante 96 horas, registrándose como variables biológicas la emisión del canto nupcial, observación de amplexos y presencia de desove o nido de espuma. Asimismo, se registraron variables fisicoquímicas dentro de los tanques reproductivos (temperatura del aire y del agua, concentración de oxígeno disuelto, conductividad, pH). Como resultado, se observó una inducción efectiva en los machos de L. latrans en los experimentos 1, 3 y 4, con una frecuencia de entre el 25 y 100%; mientras que para las hembras resulto efectiva solo en el experimento 4, con una ocurrencia del 25%, observándose un único evento de desove. El ICR de la hembra en que la inducción resultó efectiva fue de 2,67, lo que coincide con el rango de valor promedio de ICR en hembras reproductivas estudiadas en la naturaleza. Las condiciones físico-químicas en el desove coincidieron con las condiciones promedio registradas en la naturaleza (prof: 10 cm, Tagua: 26°C). En resumen, en este primer capítulo, los monitoreos de campo permitieron determinar y actualizar algunas condiciones propias del micro-hábitat de desove, y parámetros de los nidos de espuma, que resultaron de utilidad para poner a punto el método de inducción artificial de la reproducción. El ICR permitió distinguir entre hembras reproductivas y no-reproductivas en L. latrans. Los valores de ICR, permitieron seleccionar hembras en condición reproductiva, resultando en una inducción exitosa en una hembra con ICR en el rango del promedio. Finalmente, estos resultados representan el punto de partida para la puesta a punto de la inducción hormonal de la reproducción en cautiverio. En el capítulo II, se propuso caracterizar el proceso de desarrollo gonadal de L. latrans desde el punto de vista morfológico, e histológico. En ese sentido, fue necesario establecer un método de mantenimiento para la especie en cautiverio. Se realizaron 6 experimentos evaluando distintas densidades, tipos de alimento, frecuencia de alimentación y cantidad de alimento per cápita. Como puntos finales se evaluó la supervivencia, crecimiento y desarrollo. Los resultados indicaron que la mayor supervivencia se observó en las densidades de 5 y 10 individuos/L (id/L) (p < 0,05), mientras que densidades de 1 id/L resultaron con mortalidad a las pocas horas de iniciados los experimentos. El alimento balanceado para peces (Shulet®), en cantidad de 0,04 g/individuo y la frecuencia de alimentación cada 24 horas, fueron las condiciones que mostraron en una mayor supervivencia (p < 0,05). Las condiciones que resultaron en un mayor crecimiento de los individuos fueron el alimento balanceado para peces y una densidad de 5 id/L (p < 0,05), mientras que para el desarrollo, las diferencias se observaron solamente en el factor densidad, con un mayor desarrollo en los individuos mantenidos en la condición de 5 id/L (p < 0,05). Estos resultados permitieron establecer un protocolo de mantenimiento de la especie en cautiverio para llevar a cabo el estudio del desarrollo gonadal desde etapas tempranas del desarrollo, considerando el punto de vista morfológico e histológico. Para tal fin, se realizaron extracciones de porciones de nidos de espuma de L. latrans en los sitios de estudio previamente mencionados. Una vez eclosionadas las larvas, fueron mantenidos bajo condiciones controladas en densidad de 10 Id/L, como alimento se suministró lechuga licuada y alimento balanceado para peces en escamas. La frecuencia alimentaria fue cada 24 h y se realizaron recambios del agua una vez por semana. Una vez que la larvas alcanzaron el estadio 42 de Gosner (Gs42), fueron transferidas a bateas conteniendo un fondo de agua y colocadas en pendiente. A partir de este estadio, se eliminó el suministro de alimento. En el Gs45, los individuos fueron transferidos a cámaras individuales con un fondo de agua, donde permanecieron hasta el estadio de juvenil. En el Gs46 se reanudo la alimentación, suministrando larvas de Tenebrio molitor. Se extrajeron muestras periódicas de larvas con el fin de obtener individuos (N=10) de cada estadio larval. Las larvas extraídas fueron anestesiadas en solución de benzocaína, decapitadas, fijadas en solución Bouin y conservadas en etanol 70°. Previo a la eutanasia se registraron peso, LHC, LT y Gs. Se disecó complejo riñón-gónada, el cual fue procesado mediante técnicas de histología clásica y cortado serialmente. Se procesaron un total de 89 individuos entre los estadios de Gs25 hasta juveniles de 4 semanas post-metamorfosis. A nivel microscópico, se pudo determinar un estado de gónada indiferenciada desde el Gs25 hasta el Gs35 inclusive. A partir del Gs36 comenzó a observarse la delimitación de una región cortico-medular, correspondiéndose con una diferenciación ovárica, mientras que las gónadas que no muestran esta diferenciación permanecieron como gónadas indiferenciadas (testículo presuntivo). En el Gs40 se observó el primer indicio de diferenciación testicular, como una medula de células germinales, sin corteza, que comienzan a agruparse formando cistos. Los lóbulos seminíferos se hacen evidentes en juveniles de 4 semanas post-metamorfosis. En resumen, L. latrans resulto una especie gonocórica con un patrón de diferenciación sexual de tipo “indiferenciado”. La tasa de diferenciación del ovario de L. latrans fue de tipo acelerada, mientras que la tasa de diferenciación testicular fue de tipo retardada. La proporción de sexos observada fue de aproximadamente 50:50, con variaciones en algunos estadios. En el capítulo III se estudiaron los efectos del herbicida glifosato sobre larvas de L. latrans. En tal sentido, se realizaron bioensayos de toxicidad aguda (96 h de exposición) con el objetivo de evaluar los efectos letales y subletales del herbicida Roundup Ultramax (RU) y del glifosato grado técnico (GLY) en larvas de L. latrans en dos estadios del desarrollo, Gs25 y Gs36. Se colectaron nidos de espuma, que fueron mantenidos bajo condiciones controladas hasta alcanzar el estadio requerido para el inicio de los experimentos. Para el Gs25, se evaluaron 23 concentraciones de RU (0,0007-9,62 mg e.a./L) y 7 concentraciones de GLY (3-300 mg/L), más un grupo control. Todos los tratamientos se evaluaron con dos variantes, con y sin alimentación. Para el Gs36, se evaluaron 7 concentraciones de RU (0,37-9,62 mg e.a./L) y 7 de GLY (3-300 mg/L), más un grupo control. Las larvas Gs36 no fueron alimentadas durante el bioensayo. Todos los tratamientos, tanto para Gs25 como Gs36, se evaluaron por cuadruplicado, bajo una densidad de 10 id/L. Como puntos finales se evaluó la mortalidad y actividad natatoria (cada 24 h), crecimiento (LHC), desarrollo (Gs), anormalidades morfológicas e histopatología hepática (a las 96 h). Como resultado, se pudo observar que las larvas Gs25 del bioensayo sin alimentación no superaron las 72 horas de exposición, en ninguno de los tratamientos (incluido el control); por lo que el alimento resulto un factor clave para el desarrollo de los experimentos en L. latrans. Las CL50 a las 24, 48, y 72 h de RU para larvas Gs25 con y sin alimentación no mostraron diferencias significativas (p>0,05), lo que indica que el suministro de alimento no interfiere con la toxicidad del compuesto en los tiempos evaluados. La CL50 (96 h) de RU para larvas Gs25 fue de 3,26 (3,04-3,43) mg e.a./L; mientras que para Gs36 fue de 8,67 (8,12-9,28) mg e.a./L. Asimismo, se observó que en larvas Gs25 la concentración letal incipiente de RU se alcanzó a las 72h de exposición. Por otro lado, el GLY no mostro efectos letales en ninguno de los bioensayos, tanto con larvas Gs25 como Gs36. Finalmente, el formulado RU resulto ligeramente tóxico (clase III), y el GLY como prácticamente no tóxico (clase IV) según categorías de toxicidad para organismos acuáticos de la US EPA. En lo que respecta a los efectos subletales, pudo observarse que para larvas Gs25 el RU indujo aceleración del desarrollo y crecimiento a partir de los 0,007 y 0,37 mg e.a./L, respectivamente. Ambos tipos de efectos también fueron observados en larvas Gs25 expuestas a GLY, a partir de 15 mg/L, ambos. Asimismo, se observaron efectos de anormalidades morfológicas por exposición a RU y GLY en ambos estadios larvales, a partir de los 2,96 mg e.a./L de RU para Gs25 y 2,22 mg e.a./L de RU para Gs36. Por otra parte, para el caso del GLY, las anormalidades se observaron a partir de los 30 mg/L en ambos estadios larvales. A nivel general, las anormalidades observadas fueron la presencia de edemas y anormalidades orales (pérdida de la mandíbula inferior o superior, anormalidades en crestas dentarias y la pérdida de queratodontes). Finalmente, también se observaron efectos en la actividad natatoria en larvas de Gs36 expuestas a RU, a partir de los 5,18 mg e.a./L. Los resultados de la histopatología hepática con larvas Gs36 mostraron un aumento en el número de melanomacrófagos/área en la concentración más baja de RU (0,37 mg e.a./L) y las dos concentraciones más altas de GLY (75 y 300 mg/L). Por otro lado, el número de centros de melanomarófagos/área resulto significativamente elevado en las concentraciones de 0,37 y 0,74 mg e.a./L de RU y en la concentración de 300 mg/L de GLY. Finalmente, se observaron otras patologías hepáticas como la infiltración, congestión y lipidosis en larvas expuestas a ambos compuestos, observándose diferencias significativas a partir de los 2,22 mg e.a./L de RU para la congestión y lipidosis. El aumento MMc y MMC indican un aumento en la actividad fagocitica y un aumento en la actividad citoprotetora de la melanina. Además, MMc y MMC muestran una curva dosis-respuesta no-monótonica y desaparición de efectos a concentraciones de RU elevadas, con aparición de daño hepático. Con el objetivo de explorar los posibles efectos de perturbación endócrina (Ej: alteración en la proporción de sexos) producidas por la exposición de larvas de L. latrans al herbicida RU y a GLY, se realizó un bioensayo de toxicidad con larvas Gs34 a dos concentraciones subletales de 0,37 mg e.a./L de RU y 100 mg/L de GLY, más un grupo control. Todos los tratamientos fueron evaluados por triplicado y bajo una densidad de 10 id/L. El tiempo de exposición fue de 14 días, durante los cuales las larvas fueron alimentadas con alimento balanceado para peces (Shulet®) cada 24 h, previo a la renovación del medio de ensayo. Los puntos finales evaluados fueron crecimiento (LHC y PC), desarrollo (Gs) e histología gonadal (relación sexos), determinándose cuatro estados de diferenciación sexual: Macho, Hembra, Intersexo y gónada indiferenciada. Los resultados no mostraron efectos (p > 0,05) en el crecimiento ni desarrollo de las larvas tratadas respecto al grupo control. En lo que respecta a la relación de sexos por histología gonadal, se pudo observar en el grupo control una relación de sexos 50:50 (macho/hembra), en el grupo tratado con GLY una relación de 40:60 y en el grupo tratado con RU de 30:70. Si bien estos datos no resultaron estadísticamente significativos (p > 0,05), pudo observarse una tendencia a la feminización en los grupos expuestos a glifosato bajo ambas formas, siendo más pronunciado en el caso del RU. Estos resultados podrían ser indicadores de un posible efecto estrogénico por parte del RU y del GLY sobre las larvas de anfibios. En este sentido, sería necesario ampliar los estudios de este trabajo de Tesis, incluyendo las mediciones de la expresión génica de genes obtenidos para su utilización como biomarcadores de diferenciación sexual en ensayos ecotoxicológicos.

El manejo de los ecosistemas produce cambios en la composición de las comunidades, que pueden influir sobre la susceptibilidad de la comunidad a ser invadida y sobre los impactos de la invasión. En esta tesis, avanzo con la comprensión del rol que ejerce la composición funcional de plantas sobre la invasión de especies exóticas, usando dos aproximaciones experimentales. El experimento de remoción mostró que la pérdida selectiva de grupos funcionales promovió la invasión de acuerdo a la cantidad de biomasa removida, pero también a partir de un efecto de identidad de los pastos nativos de verano. La falta de compensación de los grupos remanentes, permitió que la invasión persista hasta al menos dos años después de cesados los disturbios. El experimento de ensamble en donde varió la composición de la comunidad, mostró una interacción sub-aditiva entre grupos funcionales nativos, generando que comunidades más diversas sean menos resistentes a la invasión respecto de comunidades compuestas por el grupo funcional más resistente. La composición de la comunidad determinó la invasión por Lolium multiflorum pero apenas afectó a Lotus tenuis. La intensidad de defoliación aumentó la invasión, pero en general no cambió los efectos de la composición funcional, excepto cuando la resistencia a la invasión estuvo dada por una alta superposición de nichos. La invasión por L. multiflorum o L. tenuis afectó negativamente a los pastos nativos de invierno, mientras que la productividad primaria neta aérea aumentó o no fue afectada. La superposición temporal de nichos, el efecto de prioridad y el fitness relativo de la invasora regularon el éxito de la invasión y los impactos generados sobre la comunidad receptora. Sin embargo, los efectos interactivos observados en ambos experimentos sugieren que la facilitación indirecta puede jugar un rol importante en controlar el éxito de las invasiones y los impactos que éstas generan.

Las evaluaciones ecotoxicológicas son herramientas fundamentales en las estimaciones de riesgo ambiental y la toma de decisiones de políticas de control y prevención de daños ecológicos. A nivel regional la caracterización ecotoxicológica de sedimentos se determina principalmente evaluando en ellos niveles de contaminantes considerados como prioritarios, sin tener en cuenta factores tales como biodisponibilidad, resuspensión posibles interacciones o impacto sobre estructura y funcionamiento de las comunidades asociadas a sedimentos. En ese sentido los bioensayos son herramientas esenciales para evaluar la calidad del ambiente porque responden de manera integrada a los efectos adversos de mezclas químicas complejas con las que están en contacto y cuya ecotoxicidad interesa conocer. Los bioensayos con anfípodos tienen considerable relevancia en la evaluación toxicológica de agua dulce, siendo Hyalella azteca, de amplia distribución en el hemisferio norte, la especie más utilizada. Los protocolos para bioensayos estandarizados fueron diseñados en el hemisferio norte en función de los requerimientos y biología de esta especie. Además, estos protocolos se centran primordialmente en la evaluación de parámetros tradicionales (mortalidad y crecimiento) sobre los anfípodos, asumiendo que la ausencia de efecto indica que el medio de ensayo es ecotoxicológicamente aceptable. Sin embargo, hay una tendencia mundial a evaluar el impacto de los contaminantes en un sistema acuático particular a través del monitoreo ecotoxicológico con especies nativas. La necesidad de utilizar especies locales se hace evidente, entre otras razones, porque el uso de las mismas adaptadas a las características del ambiente, pueden proporcionar resultados mucho más cercanos a la realidad que los obtenidos con una especie exótica. Por lo tanto, debido a que las especies propuestas en los protocolos internacionales no son las mismas que encontramos en nuestros ecosistemas acuáticos, es muy importante evaluar el efecto de los contaminantes sobre especies autóctonas sobre la base del conocimiento biológico, ya que estas pueden mostrar requerimientos y características diferentes a las de las especies estandarizadas en dichos protocolos. Es recomendable que cada región geográfica tenga protocolizado diversos métodos de ensayo donde las especies autóctonas estén representadas. Este trabajo presenta resultados obtenidos a partir de la evaluación de efectos de matriz acuosa y sedimentos contaminados sobre dos especies de anfípodos dulceacuícolas presentes en la región: Hyalella curvispina y Hyalella pseudoazteca, por medio de bioensayos de toxicidad en condiciones controladas de laboratorio. Utilizando organismos de dos estadios de vida, se realizaron ensayos de exposición aguda y subcrónica a dos metales pesados, tóxicos referentes (cobre y cadmio) en matriz acuosa, sedimento procesado y agua de poro extraída del mismo, adaptando una metodología estandarizada para H. azteca. Los puntos finales fueron concentración de metal en tejidos, sobrevivencia y crecimiento, siendo los dos últimos parámetros tradicionales para estos protocolos experimentales. A su vez, se investigó la utilidad del Índice de Masa Corporal (IMC) como nuevo parámetro evaluador de efecto subletal. Con el objetivo de utilizar nuevos puntos finales de evaluación de efecto temprano por exposición a metales en H. curvispina, se determinaron efectos sobre el contenido de glucógeno, proteínas totales, lípidos totales, triglicéridos, arginina fosfato, niveles de peroxidación lipídica (TBARS) y actividad de catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y Na+/K+ ATPasa, en matriz sólida y acuosa. Además se ajustó e implementó para esta especie la técnica de sistema de transporte de electrones (ETS) como biomarcador de estado metabólico. Se llevó a cabo la evaluación de la ecotoxicidad de sedimentos ambientales realizando ensayos con sedimento completo y agua de poro, utilizando a H. curvispina como organismo prueba, evaluando como puntos finales parámetros tradicionales de efecto. A su vez, sobre muestras de sedimento completo se investigó la utilidad de biomarcadores de efecto temprano (niveles de lipoperoxidación y actividad de SOD, CAT y ETS). En relación al efecto del cadmio y cobre en solución H. curvispina probó ser sensible a concentraciones ecológicamente relevantes de ambos metales. Los resultados reafirman su importancia como una especie adecuada para ensayos de evaluación ecotoxicológica en cuerpos de agua dentro de su área de distribución. Con respecto a la toxicidad de ambos metales en bioensayos en matriz sólida, se demostró que ambas especies sufren efectos negativos sobre el crecimiento a concentraciones de Cd y Cu cercanas a los Niveles Guía de Calidad de Sedimentos (SQGs), desarrollados para el hemisferio norte, siendo el IMC el mejor parámetro discriminador de efecto. En cuanto al desarrollo de nuevos puntos finales de efecto temprano para ensayos con anfípodos se confirmó que la exposición a Cu ó Cd, tanto en solución como en sedimento, afectó de manera significativa a la mayoría de los parámetros metabólicos y bioquímicos evaluados. Se postula al ETS como nuevo biomarcador de efecto en bioensayos ecotoxicológicos con H. curvispina. El protocolo aplicado, los parámetros determinados y la especie test elegida, resultaron ser aptos para monitorear la calidad toxicológica de sedimentos ambientales. El uso de biomarcadores demostró una mayor sensibilidad y un más preciso ajuste de evaluación de efectos que el obtenido por el ensayo estándar de sobrevivencia y crecimiento, y se revelan más contundentes en relación a la evaluación de efectos proponiéndose su implementación en estudios de biomonitoreo de sedimentos. Por último, se estableció una línea de base como contribución al incremento del conocimiento biológico de las especies de ensayo, utilizando como criterio el IMC y parámetros del metabolismo energético, comparando el estado general de los animales en medio acuoso y sedimento en situaciones control. Se concluyó que H. curvispina puede ser empleada en bioensayos tanto en matriz sólida como acuosa, pero la especie resulta más apropiada para la realización de bioensayos en presencia de sedimentos. Con respecto a H. pseudoazteca resulta una especie apropiada para su uso en bioensayos en matriz sólida, pero no es recomendada para su utilización en ensayos en matriz acuosa.

El Bosque Atlántico Interior es reconocido como un área de alto endemismo y diversidad a nivel global. Para los anuros habitando esta ecorregión su topografía altamente compleja, con varios pequeños microhábitats y la alta humedad del Bosque, reduciendo los riesgos de desecación, favorecerían especializaciones y la persistencia de especies raras, dando lugar al grado de diversidad de anuros presentes. A pesar de la importancia que esta ecorregion tiene para la biodiversidad, podría decirse que es una de las regiones más devastadas y, actualmente se encuentra altamente amenazada. La cubierta original del Bosque Atlántico, ha sido reducida a solo el 7, 8 % de su extensión original. En la provincia de Misiones, entre las actividades extractivas que condujeron a la degradación del Bosque Atlántico, la más importante fue la deforestación. Hoy en día, los monocultivos son manejados intensivamente, resultando esto en una menor complejidad y variedad de hábitats para las especies que allí habitan. Considerando que en el Bosque Atlántico Interior está ocurriendo un proceso creciente de reemplazo del bosque nativo por plantaciones de monocultivo forestal (Pinus taeda), en este trabajo se propuso evaluar el efecto de la degradación del hábitat sobre la comunidad de anuros del Bosque Atlántico de Misiones. En el desarrollo de esta tesis se caracterizó la comunidad de anuros del Bosque Atlántico del norte de Misiones, en función de la riqueza y abundancia de especies, como también de la estructura y la dinámica de sus poblaciones. Se comparó la composición de especies presentes en ambientes del Bosque Atlántico y de Monocultivos Forestales del norte de Misiones, utilizando como herramienta el análisis de la diversidad. Se evaluó la relación entre estos patrones de diversidad y las variables de la estructura de la vegetación (dosel, sotobosque y mantillo) e hidroperiodo (frecuencia y duración de cuerpos de agua) presente en estos dos ambientes. Además se analizó comparativamente la variabilidad del tamaño corporal de las especies habitando en el Bosque Atlántico y los Monocultivos Forestales. Específicamente, para las comunidades de anuros de Argentina, no existen antecedentes sobre el efecto que los Monocultivos Forestales producen sobre la comunidad. Si bien a nivel global no existe un consenso generalizado sobre el efecto de los monocultivos en la diversidad, nuestros resultados muestran que cuando se trata de la comunidad de anuros del Bosque Atlántico de Misiones se produce una drástica alteración de la composición y estructura de la comunidad, reflejado por la disminución de la riqueza y abundancia de especies, como también por la pérdida de especies especialistas de hábitat. Adicionalmente, nuestros resultados reflejan que los cuerpos de agua de los Monocultivos Forestales no son idóneos para la reproducción de muchas especies. Aún así, aquellas especies que son resistentes a la degradación del hábitat producida por los Monocultivos, como Elachistocleis bicolor y Odontophrynus americanus encuentran amplios beneficios en este ambiente, reflejado esto en el incremento de su tamaño corporal.

Entre agosto de 2000 y febrero de 2005 se estudiaron la organización de los ensambles de aves en fragmentos de caldenal en la Estancia La Primavera, ubicada en el centro este de la provincia de La Pampa. Los objetivos generales de este trabajo fueron: 1) analizar los cambios en los ensambles de aves producidos por la fragmentación del bosque y por la incorporación de una matriz agrícola; y 2) determinar los efectos de borde tanto en sus aspectos abióticos (mediante análisis de variables microambientales), como bióticos (a partir del análisis de los ensambles de aves y de un experimento con nidos artificiales). Para ello se trabajó en seis fragmentos de bosque maduro cuyas superficies fueron: 2.1; 10.4; 13.6; 26.3; 27.9; y 117.6 ha. En la primera parte del trabajo se describe el área de estudio y cuales fueron las posibles causas de la fragmentación del caldenal. En la segunda parte del trabajo se evaluó la riqueza específica y la abundancia de las aves, en función del tamaño de los fragmentos y de la estructura de la vegetación de los mismos. La estructura gremial de los ensambles cambió entre estaciones, debido a las especies migratorias estivales. Tanto la densidad como la riqueza fueron afectadas por el área. Por otro lado la estructura de la vegetación fue un factor importante en la distribución de las especies en los fragmentos. En la tercera parte se analizaron los diferentes efectos de borde, en primer lugar se analizaron los cambios físicos ocasionados por éste. En este caso las temperaturas del aire, del suelo, la humedad ambiente y de la broza, la radiación fotosintéticamente activa y la lluvia fueron las variables que cambiaron conforme la distancia la borde aumentaba. Posterior a los cambios microambientales, se estudiaron los cambios en los ensambles de aves en función del efecto de borde como así también de la estructura de la vegetación. No hubo evidencia de un efecto de borde, ya que no se encontró ninguna especie rechazadora ni explotadora de borde. Como la estructura de la vegetación fue similar, tanto en el borde y en el interior, esta pudo haber sido la causa de la falta de efecto de borde. Por último en el Capítulo 6 se realizó una evaluación del efecto de borde a partir de un experimento con nidos artificiales. En este caso hubo un efecto de borde significativo, aunque sólo para los nidos ubicados en el suelo, mientras que los colocados en los árboles tuvieron una predación cercana al 100%. Si bien existieron varias especies de potenciales predadores, sólo se pudieron registrar tres mamíferos y tres aves. Los resultados en su conjunto indican que las aves que habitan en el caldenal se verían más afectadas por las variables microambientales, la estructura de la vegetación y la predación de nidos. Sin embargo, los efectos biológicos indirectos causados por las variaciones microambientales, el parasitismo de cría (ausente este estudio), la predación sobre nidos naturales, constituyen evaluar con mayor profundidad.

Esta tesis estudió los efectos directos del fitoestrógeno genisteína en varios modelos de isquemia-reperfusión: de no-flujo/reperfusión (I/R) en corazones enteros de rata y cobayo, y de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R) en corazones enteros de rata. En estos modelos se generó una recuperación contráctil parcial durante la reperfusión, sin infarto, denominado “corazón atontado”. La disfunción contráctil en estos modelos está acompañada por una elevada liberación de calor que conduce a la disminución de la economía muscular total. Los cambios energéticos reflejan alteraciones en la contractilidad, en la regulación de la [Ca2+]i, en los mecanismos activos de remoción y liberación de Ca2+ al citosol, y en la actividad metabólica mitocondrial. Aunque el fitoestrógeno genisteína es considerado protector cardiovascular, sus efectos directos en el miocardio atontado no estaban establecidos. Conocerlos es de importancia para evaluar una posible acción preventiva de este fitofármaco que se emplea en estados post-menopáusicos y como componente dietético principalmente aportado en la soja. La tesis estudió los efectos de perfundir 2 y 20 μM de genisteína previo a la I/R en corazones de rata o cobayo, puesto que ambos difieren en el grado de participación de mecanismos sarcoreticulares y sarcolemales. Además, puesto que la genisteína es considerado un fitoestrógeno, se evaluaron las diferencias de respuesta entre los dos sexos, tanto en I/R como en HIP/R. Se estudiaron los efectos desarrollados por la perfusión de genisteína directamente en los corazones aislados y contenidos en el interior de un calorímetro de flujo. En otras series experimentales, se estudiaron los efectos producidos después de la administración in vivo de 5 mg/Kg vía intraperitoneal un día antes del experimento de I/R en el corazón aislado. Experimentalmente, se midieron simultáneamente la presión intraventricular izquierda (LVP en mmHg) y el flujo de calor total (Ht en mW/g tejido) de corazones enteros de rata y cobayo introducidos en la cámara interna de un calorímetro de flujo, en forma continua tanto durante la perfusión control (6 ml/min) como en isquemia de no-flujo (por corte global de la perfusión) o en hipoperfusión (por reducir el flujo a 1,2 ml/min). En los modelos de “atontamiento”, los períodos de I/R o de HIP/R se eligieron para lograr una recuperación de alrededor del 50% de la contractilidad inicial en condición control. En corazones de rata se estudió también un modelo de “atontamiento severo” en el que el control recuperó alrededor del 15% de la contractilidad inicial. Los corazones estabilizados dentro del calorímetro se expusieron a diversos protocolos de pretratamiento con genisteína (GST) y/o ciertos inhibidores selectivos de transportadores para evaluar su rol en el efecto. Se hallaron los siguientes resultados principales en los diferentes modelos: a) En el modelo de atontamiento por I/R: en corazones aislados de rata expuestos a 20 min I/45 min R a 37 ºC, GST 20 μM no cambió la recuperación contráctil post-isquémica (RCPI), pero aumentó la velocidad de relajación relativa (-dP/dt/P) de las contracciones en R. Además, mejoró la economía muscular total (P/Ht) sólo cuando estuvo presente desde antes de la I al final de la R. La perfusión de menor concentración de GST 2 μM a 37°C (descripta en plasma de pacientes que consumen fitoestrógenos en la dieta) tampoco modificó la RCPI ni la economía, observando similar efecto que a 20 µM aún en la relajación. Sin embargo, a 30 ºC, en los corazones expuestos a 45 min I/45 min R, GST 20 µM redujo la RCPI tanto en corazones de ratas como de cobayos macho (M), sin modificar la RCPI de las hembras (H), con similares comportamientos de la economía. La inhibición de tirosina fosfatasas con orto-vanadato (OVN) durante la perfusión con 20 μM GST previno la disminución de la RCPI en corazones de rata M, sugiriendo que el efecto inotrópico negativo de GST es debido a la inhibición de tirosina-quinasas (TK). Reperfundiendo los corazones isquémicos con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+ se indujo una contractura dependiente del contenido de Ca2+ sarcoreticular, y una liberación de calor que representa el ciclaje de Ca2+ a través de los varios transportadores involucrados. La relajación de la contractura depende principalmente de la recaptación mitocondrial de Ca2+ en estas condiciones, y GST redujo esa velocidad de relajación a 30⁰C. En corazones de cobayo, GST 20 μM mantuvo la protección del precondicionamiento (PC) isquémico previo a los 30 min I/45 min R, pero ambos efectos fueron reducidos (cayó la RCPI) por el bloqueante selectivo de los canales de K+ mitocondriales (KATPm) 5-hidroxidecanoato, sugiriendo la participación de los KATPm en el efecto de GST y del PC. b) En cardiomiocitos aislados de rata y perfundidos en medio aeróbico, GST 20 μM previno el aumento en la fluorescencia de Rhod-2 ([Ca2+]m libre) y demoró la caída de la señal fluorescente de Fluo-4 ([Ca2+]i libre citosólico) ambos provocados por la perfusión de un Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. c) Efectos de GST en el modelo de atontamiento con estimulación simpática: se encontró que 20 μM GST redujo la disfunción provocada por adrenalina en el modelo de atontamiento por I/R, mejorando la RCPI y la economía (P/Ht). Esta interacción sugirió que GST redujo la sobrecarga de Ca2+ inducida por adrenalina. d) En el modelo de atontamiento severo por I/R: en corazones aislados de rata a 37 ºC, GST 5 mg/Kg administrada vía intraperitoneal 24 horas antes del experimento mejoró la RCPI de corazones expuestos a 30 min I seguido de 45 min R, especialmente en corazones de rata macho. Este efecto no estuvo asociado a la inhibición de las tirosina-kinasas (no se modificaron por tratamiento previo con OVN), ni a cambios en el contenido de Ca2+ del RS (no alteró la contractura provocada por Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+). e) En el modelo de hipoperfusión/reperfusión (HIP/R): inicialmente se caracterizó el rol de los transportadores de Ca2+ mitocondriales en este modelo. Se logró mejorar la RCPI y la economía durante la hipoperfusión cuando se pretrataron con clonazepam 10 μM, el cual inhibe al NXCm, sugiriendo el rol cardioprotector de conservar más Ca2+ en las mitocondrias durante la hipoperfusión. Otros transportadores mitocondriales (UCam y KATPm) no ejercieron un rol cardioprotector en la HIP/R. Luego, 20 μM GST generó el mismo patrón de comportamiento que en el atontamiento por I/R a 37°C, es decir que M y H no alteraron la RCPI ni la economía. Pero al combinar la perfusión de GST luego y en simultáneo con la de clonazepam se observó una disfunción muy acentuada: reducción de RCPI y economía, y gran contractura. Esta disfunción fue atenuada por la simultánea perfusión de ciclosporina A, lo cual sugiere que hay una gran alteración en la homeostasis de Ca2+ con apertura del mPTP al interferirse los transportadores mitocondriales UCam y NXCm. Por otro lado, cuando el modelo de HIP/R se realizó 24 horas después de la administración IP de 5 mg/Kg de GST en corazones de rata macho, se obtuvo cardioprotección con aumentos de la RCPI y la economía (P/Ht). Estos resultados sugieren que GST actúa en varios mecanismos que regulan la homeostasis de calcio miocárdica y la energética durante la I/R, los cuales difieren con la temperatura y el género. Entre ellos, hemos caracterizado a los siguientes: a) Una inhibición del influjo de Ca2+ por canales L, más notoria en machos que en hembras y a baja temperatura (30 ºC), que es dependiente de la inhibición de TK. b) un aumento de la velocidad de relajación de las contracciones, posiblemente por aumentar la captación sarcoreticular de Ca2+, el cual fue evidente tanto a 30ºC como a 37ºC pero fue enmascarado por la acción lusitrópica propia de la adrenalina. d) un aumento del leak de Ca2+ del RS dependiente de la temperatura, ya que fue evidenciado por el aumento de la LVEDP durante la R en los corazones tratados con GST a 37 ºC, aun en las condiciones de cardioprotección. e) una disminución de la captación de Ca2+ mitocondrial, evidenciado en cardiomiocitos aislados y en corazones en I/R a 30 ºC, cuando se perfundieron con Krebs-10 mM cafeína-36 mM Na+. e) una acción cardioprotectora cuando se administró in vivo, que podría estar asociada a la interacción agonista competitiva con el estradiol endógeno a nivel de los receptores estrogénicos, puesto que la RCPI y la economía mejoraron mucho mas en el tratamiento in vivo de rata macho que en el de rata hembra. La dosis de 5 mg/Kg evaluada en esta tesis es comparable a la administrada en humanos terapéuticamente (70 mg/día de isoflavonas de soja). En conclusión, esta tesis valida el efecto benéfico de la administración in vivo de GST en un individuo, especialmente si tiene reducido nivel estrogénico, como preventivo del atontamiento miocárdico disparado por la reducción del flujo coronario. Además, establece algunos de los mecanismos determinantes de tal protección a nivel de la homeostasis de Ca2+ y la energética miocárdica.

Tesis para obtener el grado de Magíster Scientiae en Área Recursos Naturales, de la Universidad de Buenos Aires, en 2011

Las poblaciones de especies exóticas invasoras pueden alterar los ambientes donde son introducidas provocando cambios genéticos, morfológicos, demográficos, en el flujo de recursos, el ciclo de nutrientes, el régimen de disturbios. Particularmente, las especies de pináceas con comportamiento invasor son reconocidas como un serio problema en numerosos lugares del mundo, donde tienen un alto impacto tanto ecológico como económico. Comprender los factores que frenan o disparan la invasión de pinos es clave para un control y manejo exitoso de la misma. Uno de los mecanismos sugeridos para frenar la invasión de pináceas es el ramoneo por grandes herbívoros. Sin embargo, en la bibliografía se reportan resultados opuestos, observándose efectos positivos, negativos y neutros. Estos resultados opuestos pueden deberse, probablemente, a la falta de planificación y diseño de experimentos replicados, ya que la evidencia actual es mayormente obtenida a partir de trabajos observacionales. Entre los factores que pueden generar resultados contradictorios se pueden mencionar: la especie y densidad de ungulados, la preferencia entre especies de pinos y su palatabilidad diferencial, el mecanismo de respuesta al daño por herbivoría de diferentes especies, el contexto biótico, la disponibilidad de forraje y la vulnerabilidad diferente entre tipos de comunidades. A lo largo de esta tesis se buscó controlar de manera experimental estos factores mencionados anteriormente, con el objetivo general de evaluar el efecto de la herbivoría por ovejas como factor determinante de la invasión de coníferas exóticas. El objetivo específico del primer capítulo fue evaluar el efecto de la intensidad de herbivoría por ovinos como determinante de la invasión de Pinus contorta. Para esto se trabajó con cuatro cargas ganaderas instantáneas correspondientes a 1, 2, 4 y 8 veces la carga ovina recomendada para el área y se registró el daño por herbivoría sobre plántulas de esta especie. Otro de los factores que determinan el daño por herbivoría es la palatabilidad de la planta y esta puede reducirse por compuestos químicos y físicos que dificultan su digestibilidad, disminuyendo la preferencia del herbívoro. Este aspecto se abordó en el segundo capítulo con el objetivo específico de evaluar el rol de la identidad de la especie de conífera exótica en la modulación de la invasión por la herbivoría ovina. Para esto, se registró la preferencia de consumo de las ovejas entre especies con diferente capacidad invasora: Pinus contorta (invasividad alta), P. ponderosa (invasividad media), P. radiata (invasividad media) y P. jeffreyi (invasividad baja). Por otro lado, en la bibliografía se reporta que el grado de invasión de pináceas en diferentes comunidades es variable, siendo los sitios con dunas y suelo desnudo los más invadidos, luego los pastizales y por último los matorrales y bosques. A partir de esto, el objetivo específico del tercer capítulo fue evaluar la preferencia de la oveja por Pinus contorta en dos comunidades (matorral y pastizal). Por último, la respuesta al daño puede variar en función de su intensidad y del agente que lo produzca. En el capítulo cuatro se abordaron estos aspectos con los siguientes objetivos específicos: evaluar la respuesta en crecimiento y supervivencia de plántulas de pino con comportamiento invasor sometidas a diferentes intensidades de daño por ovinos y evaluar la respuesta en crecimiento y supervivencia de plántulas de pino con comportamiento invasor bajo herbivoría simulada. En términos generales, se observó que la respuesta al incremento de la intensidad de herbivoría no fue lineal sino que presentó un umbral, con daños mayores al 80% a partir de cargas instantáneas medias a altas. Se observó un número relativamente alto de plántulas consumidas de las cuatro especies estudiadas, pero grados de daño diferentes entre ellas, siendo P. contorta y P. Jeffreyi las especies más consumidas. En cuanto a la influencia del ambiente, el número de plántulas ramoneadas fue mayor en pastizal que en matorral. Sin embargo, la intensidad del daño por plántula fue mayor en matorral que en pastizal. Por último, la respuesta de las plántulas fue variable en función del grado de daño, de la especie de pino y del agente que lo produce, observándose que a mayores niveles de daño, 80 a 100% de los individuos no crecieron durante una temporada de crecimiento. De los individuos que crecieron, plántulas de P. contorta con daños bajos y altos crecieron de manera similar al control y plántulas con daño medio crecieron menos que el control. Plántulas de P. ponderosa y P. radiata con daños bajos y medios crecieron de manera similar al control y plántulas con daño alto presentaron crecimiento en altura casi nulo. Por otro lado, se observó en las tres especies compensación o sobrecompensación en el desarrollo de ramas laterales, variando el grado de desarrollo en función de la intensidad de daño. En cuanto a la respuesta al daño por oveja y al daño por herbivoría simulada, se observó que las plántulas con niveles de daño bajo por oveja presentaron mayor crecimiento en altura y mayor desarrollo de ramas que plántulas con misma intensidad de daño por herbivoría simulada. Se puede concluir que la oveja podría estar jugando un rol clave en el proceso de invasión de pináceas. Este herbívoro podría estar afectando el proceso de invasión de Pinus contorta por medio del ramoneo de plántulas tanto en matorral como pastizal. A su vez, se debe considerar que la aplicación de regímenes de pastoreo adecuados y controlados para el sitio puede ser una valiosa herramienta para limitar la expansión de pináceas.