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La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH), una hormona glicoproteica secretada por la hipófisis anterior. En respuesta principalmente a TRH, la TSH madura se libera a la circulación e induce la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), que son las hormonas metabólicamente activas. La secreción de TSH está regulada por TRH y por un ciclo de retroalimentación negativa en el que las hormonas T3 y T4 actúan a nivel pituitario e hipotalámico. Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, para la toma de decisiones clínicas, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. La mayoría de los métodos actuales para la determinación de TSH utilizados en los laboratorios clínicos son inmunoensayos heterogéneos "sandwich" que implican (1) enzimas, (2) sustratos fluorométricos o (3) marcadores quimioluminiscentes. En comparación con los inmunoensayos competitivos tradicionales, como los radioinmunoensayos, los inmunoensayos heterogéneos para cuantificar TSH ofrecen (1) límites de detección más bajos, (2) tiempo de respuesta rápido y (3) un rango de medición lineal más amplio. En virtud de su obvia importancia para el diagnóstico clínico, se ha realizado un esfuerzo constante para desarrollar métodos analíticos con alta sensibilidad para TSH en fluidos corporales humanos. Aunque la sensibilidad y la reproducibilidad de los inmunoensayos de TSH han ido mejorando progresivamente en los últimos 30 años, existen discrepancias analíticas en las determinaciones cuantitativas de TSH entre los sistemas disponibles comercialmente. La mayor variabilidad entre métodos se encuentra a bajas concentraciones de la hormona (por debajo de 0,4 μUI/ml), debido a la menor capacidad de detección y a la sensibilidad analítica de los inmunoensayos en este rango de concentraciones. En 1992, Sano y col. crearon una técnica llamada inmuno-PCR (IPCR), en la que reemplazaron la enzima de detección del ELISA por una sonda de ADN conjugada a biotina. Esta sonda de ADN luego es amplificada mediante PCR para la generación de señal, siendo el número de amplicones producidos proporcionales a la cantidad antígeno detectado. Desde la aparición de esta técnica, diversas aplicaciones y estrategias de IPCR se han desarrollado para la detección de innumerables antígenos. A lo largo de los años, estos estudios han demostrado que un ensayo de IPCR puede mejorar el límite de detección de 10 a 10.000 veces más que el de un ensayo de ELISA homólogo.En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales (MAbs) contra hTSH por tecnología de hibridomas y se seleccionaron racionalmente combinaciones de anticuerpos. Se establecieron las condiciones de ensayo óptimas para la determinación de la hormona por ELISA sandwich y se seleccionaron dos pares de MAbs (B-4 y B-9). Estos prototipos de ELISA se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud (OMS) y en comparación con un kit ELISA comercial. Aunque el límite de detección (LD) fue de 0,1 μUI/ml en todos los casos, el prototipo de ELISA B-9 mostró un rendimiento analítico similar al kit de ELISA comercial. Por lo tanto, seleccionamos B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR sandwich específico, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. La amplificación de la señal se logró a través de la interacción entre el MAb de detección biotinilado y la sonda de ADN mono-biotinilada, previamente autoensamblada con neutravidina. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor LD y un considerable aumento de la sensibilidad (pendiente), proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano. Además, el método de IPCR descripto (universal) demostró ser un formato práctico y versátil, realizado en tubos de PCR estándar. Nuestros resultados respaldan el potencial de la técnica para su aplicación en el diagnóstico de los estados tiroideos y para la medición confiable de niveles bajos clínicamente relevantes. Consideramos que el método propuesto puede posicionarse como alternativa metodológica para el análisis de hormonas.

A pesar de los numerosos estudios sobre probióticos que encontramos en la actualidad, poco se conoce respecto a complejos multicepas. En este trabajo de tesis se propuso: 1- Desarrollar una mezcla microbiana constituida por microorganismos aislados de kefir. 2- Estudiar sus características tecnológicas y potencialmente probióticas. 3- Determinar la capacidad inhibitoria frente a Shigella y Clostridium difficile. 4- Estudiar la capacidad de la mezcla microbiana de proteger contra la infección por Clostridium difficile en un modelo in vivo. 5- Determinar el método de conservación más adecuado para la mezcla microbiana.

Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) constituyen un importante problema de salud a nivel mundial. Las mismas son provocadas por el consumo de agua o alimentos contaminados con microorganismos o parásitos, o bien por las sustancias tóxicas que éstos producen. Durante la última década se realizó un notorio esfuerzo a nivel mundial para el desarrollo de biopreservadores alimentarios, aun así, la emergencia de bacterias patógenas causantes de ETAs evidencia la necesidad urgente de investigar nuevas fuentes de agentes bioactivos para enfrentar y controlar este problema. Numerosos estudios involucran a cepas de Escherichia coli patógenas como responsables de ETAs. Específicamente, en nuestra región resulta especialmente importante controlar la diseminación de cepas de Escherichia coli shigatoxigénicas (STEC), ya que Argentina tiene la mayor tasa mundial de Síndrome Urémico Hemolítico debido a la diseminación de cepas STEC O157:H7 y no-O157, un patógeno emergente que infecta a los humanos a través de la ingestión de carne u otros alimentos contaminados. Varios factores de patogenicidad, además de las toxinas, como la intimina presente en STEC y cepas enteropatógenas (EPEC), son considerados necesarios en el proceso de infección, convirtiendo a estos patógenos en peligrosos con respecto a la inocuidad alimentaria. Por otro lado, los conservantes alimentarios, en las concentraciones autorizadas, en general no matan a los microorganismos, sino que solamente evitan su proliferación, limitando su utilidad a materias primas de muy buena calidad. Lo antes mencionado, sumado al incremento en el número de antibióticos a los cuales son resistentes las bacterias, generan la necesidad de nuevos enfoques tanto para garantizar la calidad como para extender la vida útil de los alimentos. Los bacteriofagos son los enemigos naturales de las bacterias y presentan una alta especificidad para sus células hospedadoras. La naturaleza es una fuente inagotable de fagos que evolucionan constantemente por lo que pueden adaptarse in situ para reinfectar bacterias resistentes. Además, son fáciles de aislar y son consumidos cotidianamente ya que están presentes en los alimentos y el agua por lo que representan una alternativa ecológica. Otra de las características que presentan los bacteriofagos es que se auto-amplifican así como se auto-limitan puesto que en presencia de su bacteria hospedadora se replicarán y posteriormente infectarán otras cepas en crecimiento mostrando un comportamiento de auto-amplificación, por otro lado, en ausencia de células hospedadoras los fagos no se replicarán mostrando una auto-limitación. A pesar de lo antes mencionado, solo recientemente se están realizando un mayor número de investigaciones respecto de su utilidad como agentes de biocontrol para ser empleados en inocuidad alimentaria. En función de lo anteriormente descripto, este trabajo tuvo como objetivo principal desarrollar una metodología novedosa y económica para el biocontrol de cepas patógenas de Escherichia coli mediante bacteriofagos para ser utilizados como aditivos en lácteos y cárnicos o en su proceso de producción. En primera instancia se realizó el aislamiento de bacteriofagos de E. coli desde materia fecal humana, posteriormente se analizó la morfología mediante microscopía electrónica, se evaluó tanto la ausencia de genes de patogenicidad utilizando la técnica de PCR como su estabilidad durante el almacenamiento. En el presente trabajo se aislaron seis bacteriofagos que presentaron un carácter lítico solo frente a cepas patógenas de E. coli. Entre ellos, se seleccionaron 3 fagos, a saber DT1, DT5 (para STEC no-O157 ARG4827, no hospedadora de DT1) y DT6, para evaluar la actividad lítica en cepas patógenas de E. coli frente a distintas condiciones de temperatura, pH y concentración de cloruro de sodio. Respecto de las microscopías electrónicas, los fagos forman parte de la familia Myoviridae, presentando tamaños de cabeza y cola similares. Este dato fue corroborado en un trabajo de tesina, mediante estudios de secuenciación (Migliore, 2011). Los ensayos moleculares de PCR permitieron descartar la presencia de los genes de patogenicidad frecuentemente asociados a cepas de E. coli diarreogénicas como stx1, stx2, eaeA, LT1 y ST1 en los seis bacteriofagos evaluados. En cuanto a la estabilidad durante el almacenamiento a 4°C, los seis fagos presentaron una leve disminución en el título fágico durante el primer mes así como durante el segundo mes, obteniéndose la menor viabilidad para el fago DT1 y siendo ésta del 55% respecto de la inicial, es decir, una reducción en la viabilidad a lo sumo de 0,26 log UFP al segundo mes de almacenamiento. Al evaluar la actividad lítica en distintas condiciones fisicoquímicas se determinó que, tanto frente a concentraciones crecientes de cloruro de sodio como valores bajos de pH y de temperatura, la actividad lítica fue menor para todos los sistemas evaluados, siendo éstos más afectados por el pH bajo, luego por las bajas temperaturas y en menor medida por la mayor concentración de cloruro de sodio ensayada. Con respecto a la interacción de los fagos con sus cepas sensibles, se investigó el rango de hospedador para cada fago así como el tiempo y número de eclosión para los fagos DT1 y DT6. También se determinó la eficiencia de plaqueo (EOP) para los fagos DT1, DT5 y DT6 y, adicionalmente, se estudió la naturaleza de los receptores fágicos presentes en cepas patógenas de E. coli. Los rangos de hospedador más amplios se obtuvieron para los fagos DT3, DT4 y DT6. Estos fueron capaces de lisar 16, 15 y 16 cepas del cepario evaluado, eespectivamente. Por otro lado, los fagos DT1, DT2 y DT5lisaron solo 6, 7 y 7 de las 104 cepas evaluadas, respectivamente, mostrando un rango estrecho de hospedador. Cabe destacar que las cepas no patógenas de E. coli así como las cepas no-E. coli no se vieron afectadas por los fagos evaluados. Los bacteriofagos DT1 y DT6 presentaron el mismo tiempo de eclosión, siendo éste de 33 minutos, por otro lado, los números de eclosión fueron de 76 para DT1 y 59 para DT6. Cuando se determinó la EOP, el fago DT1 mostró valores cercanos y superiores al 20%, mientras que el DT5 presentó los menores valores. Contrariamente, el fago DT6 mostró los mayores valores de EOP, obteniéndose valores de hasta 97,6%, sin embargo, para este fago también se obtuvo uno de los menores valores observados, siendo del 10,7% en el sistema con la cepa enteropatógena. Los estudios realizados para identificar los receptores fágicos para DT1, DT5 y DT6 evidenciaron la naturaleza hidrocarbonada de éstos en todas las cepas patógenas de E. coli evaluadas puesto que solo se observó una disminución significativa en la adsorción luego del tratamiento con peryodato. Posteriormente se realizaron ensayos de challenge in vitro a distintas temperaturas frente a la cepa DH5α y a las cepas patógenas PEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Se evaluaron fagos individuales así como formando parte de un cóctel, además se comparó la eficacia de los tratamientos y se determinó la evolución del recuento fágico a través de los ensayos. Respecto del biocontrol ejercido por los fagos, éstos fueron más eficaces a la mayor temperatura evaluada (37°C), obteniéndose valores de biocontrol de hasta 6,38 log UFC, sin embargo, a la menor temperatura (4°C) en la mayoría de los casos se obtuvieron valores de reducción significativos de hasta 3,79 log UFC. La acción lítica de los fagos frente a la cepa DH5α fue similar respecto de las patógenas, presentando reducciones logarítmicas del mismo orden de magnitud con la excepción del mayor tiempo de muestreo (24 h) donde DH5α fue más afectada. Al comparar los tratamientos a 37°C, el cóctel de fagos resultó ser el más efectivo para reducir el número de células viables, solo en dos casos un fago individual fue significativamente más efectivo que el cóctel, además nunca se obtuvo la menor reducción de células viables en un sistema tratado con la mezcla fágica. Por otro lado, los tratamientos con los fagos individuales presentaron una eficacia variable independientemente del sistema evaluado. La evolución de los títulos fágicos varió a lo sumo en 1 log UFP/ml, en la mayoría de los casos aumentando levemente y permaneciendo siempre en un número elevado. Luego se realizaron ensayos de biocontrol con fagos sobre la matriz alimenticia.Se evaluaron tanto fagos individuales como cócteles sobre productos cárnicos contaminados artificialmente con DH5α y cepas patógenas, a saber EPEC920, STEC no-O157 ARG4827 y STEC464 O157:H7. Además, se evaluó el porcentaje de recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria. En general se observaron reducciones, si bien significativas, relativamente bajas cuando se utilizaron fagos individuales en los ensayos de biocontrol a ambas temperaturas evaluadas (5 y 24°C). Por otro lado, cuando se emplearon cócteles en los ensayos las reducciones significativas observadas fueron mayores. A modo de ejemplo, empleando una MOI del mismo orden de magnitud, la cepa STEC464 O157:H7 sufrió una reducción similar a las 3 h de incubación utilizando un fago individual o el cóctel, mientras que a las 6 h el cóctel produjo una reducción 1,6 log UFC mayor que el fago individual a 24°C evidenciando la utilidad del cóctel para prevenir un posterior recrecimiento bacteriano. Además, durante los experimentos la recuperación bacteriana desde la matriz alimentaria osciló entre el 61,4% y el 85,4%. Durante los ensayos en cárnicos, en algunos casos se observó un recrecimiento bacteriano al mayor tiempo de muestreo (24 h), por lo que se planteó el aislamiento de mutantes insensibles a bacteriofagos (BIMs) desde los experimentos en carnes así como por la metodología de cultivo secundario. Una vez aislados, los BIMs fueron confirmados por el test de sensibilidad en medio líquido y se determinó la frecuencia de aislamiento para cada BIM confirmado. Además, se seleccionaron 9 BIMs confirmados, 5 obtenidos a partir del cultivo secundario y 4 a partir de los ensayos en carnes, y se evaluó la estabilidad y reversión. De los 16 BIMs aislados por la metodología de cultivo secundario se confirmaron como BIMs verdaderos el 75,0%, mientras que de los 30 BIMs aislados desde carnes se evaluaron 14 y solo se confirmaron como verdaderos el 28,5%. Además de presentar frecuencias de aislamiento bajas, oscilando entre 3,7x10-7 y 1,8x10-6, los BIMs presentaron una estabilidad variable y solo uno fue capaz de revertir el fenotipo de resistencia. Otra matriz alimentaria utilizada para los ensayos de biocontrol fueron los lácteos. En los ensayos realizados durante un proceso de fermentación láctica, en el 67% de los casos el tratamiento fágico eliminó completamente la cepa bacteriana inoculada, además, cuando se utilizó el cóctel, este eliminó el patógeno en un menor tiempo respecto de los fagos individuales. Por otro lado, en ensayos realizados durante un proceso de cuajado, si bien se inactivó rápida y completamente el 50% de las cepas evaluadas, no se observó la eficacia obtenida durante la fermentación para la cepa patógena STEC O157:H7 usando el cóctel a una MOI similar, sin embargo, éste pudo eliminar la cepa DH5α. Respecto de la estabilidad fágica, éstos presentaron un alto nivel de estabilidad en este tipo de matrices considerando los bajos valores de pH alcanzados. Por otro lado, tanto los cultivos iniciadores, a saber Streptococcus thermophilus, como la evolución general de los parámetros del proceso de fermentación láctica como del proceso de cuajado, no se vieron afectados por la adición exógena de bacteriofagos. Finalmente, se evaluó la eficacia del tratamiento con cócteles fágicos sobre superficies sólidas, específicamente sobre cubreobjetos de vidrio (CV) y acero inoxidable (AI), emulando superficies inanimadas potencialmente contaminadas que se pueden encontrar tanto en un ambiente industrial como en el hogar. En los ensayos realizados en CV se obtuvo una eliminación completa de los patógenos EPEC920 y STEC464 O157:H7 tanto a 5 como a 37°C, observándose un recrecimiento de ~1,5 log UFC para esta última cepa a alto inóculo bacteriano. Contrariamente, la cepa STEC no-O157 ARG4827, si bien se vio reducida en su número inicialmente, no se logró eliminar a 5°C y presentó un recrecimiento posterior a 37°C. Cuando se evaluaron los resultados obtenidos en la matriz AI, se determinó que el cóctel fue capaz de eliminar completamente todas las cepas evaluadas a 5°C y a STEC no-O157 ARG4827 a 37°C, mientras que STEC464 O157:H7 y EPEC920 presentaron un recrecimiento posterior a alto, y a bajo y alto inóculo bacteriano, respectivamente. Cabe destacar que se ha logrado una gran especificidad de acción sobre cepas patógenas de E. coli y que estudios posteriores permitirán desarrollar cocteles fágicos con mayores eficiencias de reducción bacteriana. Los mejores resultados se obtuvieron en los ensayos de biocontrol sobre superficies sólidas, a saber cubreobjetos de vidrio y acero inoxidable, y durante los procesos de fermentación láctica y cuajado. También se observaron reducciones bacterianas significativas en la matriz cárnica. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis sugieren, en primera instancia, que los bacteriofagos aislados en nuestro laboratorio son útiles para el biocontrol de cepas patógenas de E. coli en alimentos.

La sepsis y el shock séptico son serias causas de muerte. Estas condiciones pueden iniciarse por una liberación masiva de lipopolisacárido (LPS) proveniente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, el cual activa en forma inapropiada el sistema inmune innato. Actualmente, el ensayo enzimático del lisado de amebocitos del Limulus Polyphemus (LAL) se utiliza ampliamente en la detección y cuantificación de endotoxinas en muestras clínicas y no clínicas. Sin embargo, este procedimiento posee varias limitaciones. El LPS está organizado en tres dominios estructurales, un heteropolisacárido que representa la superficie antigénica de la bacteria llamado antígeno O, una porción central constituido por un oligosacárido, denominado núcleo sacárido y una porción lipídica llamada lípido A, responsable de la actividad endotóxica del LPS. Debido a las propiedades químicas del LPS, el estudio de sus rutas metabólicas, su interacción con moléculas de reconocimiento o superficies modificadas, se realiza empleando LPS marcado. Por otra parte, dada su tendencia a formar agregados, su derivatización con técnicas comúnmente utilizadas en polisacáridos rinde resultados pobres y pérdida de su actividad endotóxica. En el presente trabajo de tesis se estudiaron distintas estrategias para la síntesis de conjugados de LPS de Salmonella Minnesota. La derivatización de LPS se llevó a cabo en la región polisacárida lejos del lípido A. Se han sintetizado conjugados con diversas sondas incluyendo, dansilo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y complejos electroactivos. Los conjugados con biotina y HRP se utilizaron en el desarrollo de ensayos competitivos amperométricos para la detección de endotoxinas. La configuración de los ensayos involucra una superficie de oro modificada con un derivado del dextrano y como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente la región del lípido A del LPS. Para estos ensayos se ha estudiado la modificación de la superficie de oro con polímeros hidrofílicos con el objetivo de minimizar la interacción inespecífica de los componentes del ensayo con la superficie. La construcción de los electrodos se evaluó por medidas electroquímicas, elipsometría y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS). Con el sistema utilizando el conjugado de LPS-HRP se alcanzó un límite de detección de 0,06 UE mL-1.

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 (HIV-1) es el agente causal del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). El genoma de ARN del HIV-1 presenta variaciones genéticas significativas como resultado de mutaciones constantes, recombinaciones entre cadenas de ARN y presión evolutiva. La variación de las secuencias del virus distribuidas en la naturaleza permitió su clasificación en grupos (M, N y O), subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J y K) y variantes recombinantes. Al demostrarse que algunas cepas recombinantes con patrones idénticos de mosaicismo se han establecido y diseminado en ciertas poblaciones, se determinó clasificarlas separadamente como Formas Recombinantes Circulantes (CRF). En Sudamérica, los subtipos B y F y las recombinantes BF son los predominantes. En Argentina circulan principalmente un 30% de subtipo B y un 65% de recombinantes BF con un predominio de la CRF12_BF. La transmisión de infecciones por el HIV-1 en período de ventana serológico (PVS) es una complicación transfusional de gran importancia. La Tecnología de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAT) permite la detección del agente viral en ausencia de anticuerpos y su implementación en países desarrollados redujo el riesgo de transmisión de la infección por vía transfusional. En países en desarrollo, los costos de los ensayos comerciales de origen importado y la ausencia de desarrollos biotecnológicos regionales impidieron su aplicación. En nuestro país la mayoría de los donantes son de reposición, o sea que están presionados a efectuar la donación, y generalmente son de primera vez, por lo que la prevalencia de marcadores para enfermedades transmitidas por vía transfusional es mayor que en los países desarrollados, en los cuales la mayoría de los donantes son voluntarios y de repetición. Está demostrado que la prevalencia de infecciones transmisibles es mayor en donantes de primera vez que en los de repetición. La mayoría de los laboratorios que realizan el diagnóstico molecular de la infección del HIV-1 en Argentina utilizan ensayos o reactivos que han sido optimizados utilizando el subtipo B como cepa de referencia. Teniendo en cuenta el aumento de la diversidad del HIV-1 observada en los últimos años, en este trabajo de tesis se desarrolló una herramienta diagnóstica que permita la detección de los subtipos y formas recombinantes del HIV-1 circulantes en Argentina. Debido a que las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (PCR y RT-PCR) son un proceso enzimático con sensibilidad extrema, la calidad del ensayo molecular, en particular con fines diagnósticos, debe ser evaluada continuamente. Para asegurar la calidad del resultado, es necesario incluir en cada reacción de amplificación controles adecuados, siendo de gran importancia la utilización de un Control Interno (CI) a fin de poder verificar la eficiencia en el procesamiento de la muestra y su idoneidad para la amplificación y detección. La producción de un CI para ensayos que amplifiquen virus con genoma de ARN, como el HIV-1, ha sido particularmente difícil debido a la labilidad intrínseca de esta molécula. Un CI apropiado para ensayos moleculares con finesdiagnósticos debe ser homogéneo, estable, seguro para el personal de laboratorio que lo manipula y capaz de verificar tanto la eficiencia en el procesamiento de la muestra como en los procesos de amplificación y detección. En base a estas consideraciones, en este trabajo de tesis se optimizó una RT-PCR para la amplificación de un fragmento de la región gag de los distintos subtipos e inter-subtipos del HIV-1, hibridación líquida de los amplicones resultantes con sondas para cada región génica y detección en microplaca (RTPCR/ SUD). Este ensayo incorpora un CI competitivo (CICSUD) que consiste en un fago Q recombinante en el cual se han reemplazado secuencias fágicas por las del par de cebadores usados para la detección del ARN del HIV-1. El CICSUD es añadido a la muestra de plasma, procesado conjuntamente con el ARN viral y amplificado con el mismo par de cebadores que el HIV-1 por RT-PCR. Los amplicones resultantes son discriminados mediante hibridación líquida con sondas específicas para cada target y detección colorimétrica en formato de enzimoinmunoanálisis. El CICSUD demostró ser estable al menos por 24 meses a 4°C. El sistema RT-PCR/SUD/CICSUD puede detectar todos los subtipos del HIV-1 y factible de ser validado como sistema NAT para la detección sensible y específica de las cepas del HIV-1 circulantes en Argentina en los individuos que se encuentren en PVS. La complejidad de la infección por el HIV-1 requiere de esfuerzos continuos que permitan conocer las cepas virales circulantes y su dinámica, de modo de asegurar una eficiente vigilancia genómica en cada región geográfica. Debido a esto, en este trabajo de tesis se presenta una nueva estrategia para identificar subtipos y cepas recombinantes a través de la temperatura de fusión (Tm) obtenida mediante qPCR y análisis de curvas de disociación. La nueva estrategia fue validada con una prueba de referencia basada en filogenia y podría ser de utilidad para monitorear la evolución de la infección por HIV-1 en nuestra región. Por medio de la selección de regiones genómicas con diferencias en las secuencias nucleotídicas (longitud o contenido GC) entre los subtipos B y F del HIV-1, se pudieron discriminar estos subtipos en dos regiones virales (gag y vif) a través de las Tm obtenidas. Su aplicación en muestras clínicas derivadas de individuos infectados de la región permitió identificar una cepa como intersubtipo F1 en la región gag y como subtipo B en la vif, patrón que no corresponde a ninguna de las CRFs descriptas y que podría ser una posible recombinante con origen evolutivo en cepas circulantes en San Pablo (Brasil). La aplicación de estas herramientas permitirá evaluar la introducción del tamizaje molecular de donantes en el ámbito público de la provincia de Santa Fe y facilitar de manera fehaciente la identificación de las cepas circulantes en nuestra región para posicionarse de manera más efectiva en el control epidemiológico de las infecciones causadas por el HIV-1.

La epilepsia es un trastorno neurológico que afecta al 1-2% de la población mundial. Cerca del 80% de los pacientes con epilepsia viven en países subdesarrollados o en vías de desarrollo y, según la OMS, las ¾ partes no reciben el tratamiento que necesitan. El tratamiento de primera elección es el farmacológico, pero presenta una importante limitación: el 30% de los pacientes con epilepsia no responden satisfactoriamente a la medicación. Es por este motivo que se han buscado otras alternativas para el control de la enfermedad, así como el desarrollo de nuevos fármacos que superen esta limitación. El Laboratorio de Investigaciones y Desarrollo de Bioactivos (LIDeB), se ha dedicado desde su inicio a la búsqueda de nuevos compuestos con actividad anticonvulsivante. En los últimos años, esa búsqueda fue dirigida a mejorar la eficacia del tratamiento farmacológico teniendo en cuenta el alto porcentaje de refractariedad. Una limitación determinante en el descubrimiento de fármacos es la disponibilidad de modelos in vivo que permitan la evaluación rápida y económica de los nuevos compuestos y que representen de la mejor manera posible el escenario clínico. Los modelos de epilepsia existentes son útiles en las etapas avanzadas de la evaluación de fármacos, pero resultan inadecuados para las etapas iniciales, donde la diversidad de compuestos candidatos es muy amplia. En esta tesis hemos desarrollado un modelo de convulsiones fármacorresistentes asociadas a la sobreexpresión de glicoproteína P en ratones, de manera de aportar una herramienta útil a la búsqueda de nuevos compuestos con potencial acción en la epilepsia refractaria.

La emisión de sonidos por larvas de Ceratophrys ornata constituyó un novedoso hallazgo en el cual se presenta la primera evidencia para larvas de anfibios anuros. Tal hallazgo condujo al desarrollo de una nueva línea de investigación, siendo el fundamento de este trabajo de tesis doctoral, habiéndose dividido la investigación en dos partes consecutivas y concatenadas. La primera parte consistió en generar las bases para poder desarrollar un modelo experimental con larvas de esta especie. Para ello, se propuso un protocolo de cría ex-situ de individuos de C. ornata, el cual permitió obtener individuos sanos a lo largo de todo el ciclo vital (desde huevo hasta adulto). Esto último fue posible gracias a la utilización del método de inducción artificial de la reproducción denominado AMPHIPLEX. Dicho método, permitió obtener huevos en distintas épocas del año, no todas coincidentes con el periodo reproductivo de la especie (verano), y recolectar datos su biología, dos logros que de otro modo hubiera resultado dificultoso dado el hábito de vida de la especie. En tal sentido, el presente trabajo de tesis aporta datos de la biología de C. ornata relativos a su reproducción (actividad reproductiva, cantidad de huevos depositados por puesta, porcentaje de eclosión de los huevos), crecimiento (curvas de crecimiento desde la etapa larval hasta la adultez), desarrollo (tiempo promedio en alcanzar determinados estadios), enfermedades (diagnóstico y tratamiento), comportamiento (llamada agonística, llamada de anuncio y reciprocidad y movimiento pedal) y biología general. Al mismo tiempo, la aplicación del protocolo en especies filogenéticamente relacionadas con C. ornata y de hábitos similares (C. cranwelli, C. aurita y Lepidobatrachus llanensis), permitió su validación. La cría ex-situ es una estrategia que evita la continua extracción de animales de su hábitat natural y sienta las bases para el desarrollo de investigaciones en aquellos casos que los estudios in-situ resultan imposibles o complejos de realizar. Una vez desarrollado el protocolo de cría en cautiverio de individuos de C. ornata, y mediante la obtención de larvas de distintos estadios del desarrollo, se describió la variabilidad de los sonidos producidos tanto en un medio acuático como aéreo. Previamente, se realizó una consulta interdisciplinaria con especialistas en sonidos, a partir de la cual se descubrieron algunos aspectos a mejorar en el sistema de grabación. Se realizó un procedimiento de calibrado y compensado del sistema de grabación que permitió obtener grabaciones de alta confiabilidad. Además, se implementó un método de mejoramiento de la relación señal-ruido, el cual permitió obtener grabaciones con espectros más nítidos y fáciles de analizar. Se realizaron además mediciones del sonido emitido por individuos de C. ornata en el medio aéreo mediante un sistema de medición adecuado (sonómetro), el cual permitió caracterizar el sonido tanto cuali como cuantitativamente mediante variables acústicas. Se concluye que para caracterizar adecuadamente un sonido de las características aquí presentadas (bajo nivel de presión sonora), resulta necesario utilizar instrumentos de medición calibrados con sistemas de referencia acústica. La variables analizadas fueron a) bioacústicas: duración del sonido (Ds), expresada en segundos (s), número de pulsos (Np), número de interpulsos (Nip), frecuencia dominante (Fd) expresada en Hertz (Hz); b) acústicas: nivel sonoro continuo equivalente (LAeq) expresado en decibeles (dB), nivel sonoro máximo (LAFmax, dB) y nivel sonoro que se ha igualado o superado durante el 90% del tiempo de medición (cercano al ruido de fondo; LAF90, dB). Se registró la emisión de sonidos desde el estadio 25 al 41, estadios luego de los cuales las larvas no emiten sonidos hasta completar el proceso metamórfico, momento en el cual los juveniles vuelven a producir sonidos manteniéndose esta situación durante todo el ciclo vital. Por último, la aplicación del protocolo de cría en otras especies de anuros filogenéticamente relacionados con C. ornata, permitió evaluar y describir la emisión de sonidos por otras larvas de anuros de la familia Ceratophryidae. Consecuentemente, se constató y registró el sonido emitido por larvas de C. cranwelli y C. aurita y la no emisión de sonidos por larvas de Lepidobatrachus llanensis dentro del rango de frecuencias evaluado. Por lo tanto, la hipótesis original que plantea que la emisión de sonidos está presente en todas las larvas de anuros macrófagas y carnívoras debe ser rechazada. Luego de describir los sonidos, se evaluó el contexto de emisión por parte de larvas de C. ornata, pudiéndose concluir que las mismas emiten sonidos en diferentes contextos (interacción intraespecífica o con un objeto), habiéndose incluido a los sonidos en la categoría de llamada agonística (distress call). Hasta el momento, no existían estudios que analicen la variación de estos sonidos desde fases tempranas del desarrollo larval y a lo largo de todo el ciclo vital. Respecto a la evaluación del mecanismo de emisión de sonidos, a partir de una serie de pruebas morfo-funcionales realizadas, se hipotetizó que el aire empleado en la producción de sonidos durante estadios larvales proviene del estómago, pasa por la glotis (donde existiría una estructura resonante) y luego por la cavidad bucofaríngea (sin salir de la misma). Además, se evaluaron interacciones predador-presa intra e interespecíficas, entre larvas de C. ornata y entre éstas y larvas que forman parte de su dieta habitual, en distintos estadios del desarrollo y bajo diferentes condiciones experimentales (densidad y proporciones predador-presa). Se concluye que C. ornata posee un mecanismo antipredatorio que disminuye la frecuencia de predación entre organismos conespecíficos ante la presencia de presas heteroespecíficas. Se evaluaron también interacciones intra e interespecíficas para larvas de C. cranwelli y L. llanensis con el objetivo de determinar similitudes y diferencias con el mecanismo antipredatorio de C. ornata. En tal sentido, se concluye que el mecanismo de Ceratophrys está compuesto por un rápido movimiento de la cola, más la emisión de sonidos y la consiguiente huida (escape) de la presa del predador. En cambio, si bien para L. llanensis también se describió un rápido movimiento de la cola seguido del escape de la presa del predador, no se registró la emisión de sonidos asociada. Más allá de las diferencias metodológicas, si se comparan los tres mecanismos se concluye que los mismos presentan el siguiente grado de eficiencia de mayor a menor: C. ornata, C. cranwelli, L. llanensis. A partir de los estudios anteriormente detallados se planteó una segunda parte con el objetivo de evaluar los efectos del clorpirifós (CPF), un plaguicida organofosforado de uso frecuente en la región Pampeana, sobre larvas de C. ornata y aplicar el modelo desarrollado en la primera parte. El primer objetivo fue evaluar efectos letales y subletales sobre las larvas expuestas a este plaguicida. Teniendo en cuenta que los plaguicidas organofosforados poseen acción neurotóxica por inhibición de la acetilcolinesterasa, los mismos pueden alterar al aparato de emisión de sonidos y al sonido en sí mismo. En tal sentido, se evaluaron no solo los parámetros ecotoxicológicos convencionales sino también el efecto sobre los parámetros normales del sonido. Los puntos finales ecotoxicológicos analizados fueron: mortalidad, alteraciones en la natación, presencia de anormalidades e inhibición del crecimiento. Además, se evaluaron las mismas variables bioacústicas antes detalladas (Ds, Np, Nip, Fd). La sensibilidad de la especie al CPF se encuentra cercana al percentil 26, teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CL-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. En relación con los efectos subletales, la especie se encuentra cercana al percentil 5 (alteraciones en la natación) y 33 (presencia de anormalidades), teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CE-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. El diseño experimental propuesto (larvas expuestas de forma individual), permitió demostrar que los efectos negativos del CPF, en el intervalo de concentraciones ensayadas, no revierten sino que se mantienen constantes. Se concluye que existe una progresión de efectos negativos del CPF, desde alteraciones en la natación seguidas por la presencia de anormalidades leves y luego severas hasta la muerte. Por último, se puso a prueba el modelo mediante la evaluación del sonido como punto final de efectos producidos por el CPF sobre larvas de esta especie. Se concluye que el sonido constituye un buen biomarcador de efectos subletales. A partir del resumen e integración de la información toxicológica existente sobre efectos del CPF en anfibios y exposición del CPF en el ambiente, mediante la herramienta de evaluación del riesgo ecológico, y la contextualización de los resultados obtenidos, se concluye que el CPF implica un riesgo muy bajo para las distintas especies de anuros evaluadas, al menos al considerar la exposición ante concentraciones esperadas en el ambiente (ecosistemas acuáticos pampeanos). El presente constituye el primer bioensayo de exposición de larvas de C. ornata a un agroquímico de uso frecuente en la región Pampeana y la primera evidencia de efectos sobre el sonido emitido por larvas de esta especie. Consecuentemente, constituye el primer estudio sobre dicha temática (efectos del CPF sobre el sonido) realizado con larvas de vertebrados acuáticos. Por sus características biológicas y su manejo en laboratorio (facilidad para criarlas en condiciones controladas), la especie resulta de gran interés como modelo de estudio en Ecotoxicología. El estudio se encuentra en un marco general de investigación de impacto de plaguicidas en agroecosistemas de la región Pampeana, junto al desarrollo y aplicación de estrategias de monitoreo, para la evaluación de efectos biológicos de plaguicidas sobre anuros autóctonos. El modelo probado resultará una herramienta útil para el desarrollo futuro de más experimentos, generando así un modelo completo de evaluación de efectos.

Las alergias alimentarias se han convertido en uno de los problemas sanitarios prioritarios en muchos países, debido a la severidad con la que pueden presentarse (la anafilaxia es la principal causa de visitas en la sala de emergencias) y al dramático aumento en su incidencia en las últimas décadas. Se estima que en la población general aproximadamente entre el 4 y el 8% de los niños, y entre el 1 al 3 % de los adultos, tienen alergia alimentaria. Actualmente el único tratamiento efectivo consiste en la erradicación de la dieta de el/los alergenos perjudiciales, siendo bastante frecuentes las reacciones ocasionadas por la ingestión accidental de los mismos. Con el fin de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares de esta patología y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, los modelos animales de alergia alimentaria constituyen una herramienta biológica de gran relevancia. Siendo la alergia a leche de vaca la causa más común de alergia alimentaria en lactantes y niños, y debido a la existencia de pacientes que presentan intolerancia a los sustitutos lácteos empleados (hidrolizados extensivos de proteínas de leche de vaca o fórmulas a base de proteínas de leche de soja o sus derivados), es que nos planteamos, en el presente trabajo de tesis estudiar las condiciones que permitan obtener un modelo murino de alergia alimentaria para este alimento, que represente de manera satisfactoria la patología observada en humanos. El mismo nos permitirá en un futuro ahondar en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de esta patología, en la evaluación de nuevos alimentos hipoalergénicos, o en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

A lo largo de los años la industria avícola en Argentina ha evolucionado y crecido marcadamente, lo cual ha traído nuevo desafíos en pos de sostener el ritmo de producción intensivo. El uso indiscriminado de antibióticos utilizados como promotores de crecimiento (APC) para sostener la producción ha favorecido la diseminación de resistencias bacterianas, lo cual conlleva a buscar alternativas a los APC. Una de ellas son los probióticos. Por lo que, el objetivo principal de esta tesis fue aislar diferentes bacterias del tracto gastrointestinal de una de las razas de pollos de mayor comercialización en el país (Cobb) para formular un producto probiótico de origen nacional. Se debe mencionar que este trabajo de tesis doctoral fue realizado en el marco de un Proyecto de Investigación y Desarrollo (PID 2014-0049), denominado “Producción de probióticos aviares para la República Argentina”. Inicialmente, se aislaron un total de 62 bacterias lácticas de buche, yeyuno - íleon y ciegos, a partir de las cuales se estudiaron algunas características probióticas in vitro, como resistencia a la acidez, resistencia a la bilis y resistencia al pasaje por el tracto gastrointestinal, donde la mayoría de los aislados fueron capaces de sobrevivir (en mayor o menor medida) a las condiciones mencionadas. También se evaluó el crecimiento en diferentes medios de cultivo alternativos al MRS comercial, donde los aislados demostraron ser capaces de crecer en permeado de suero y permeado de suero adicionado con extracto de levadura, en concentraciones comparables a las obtenidas utilizando MRS. Finalmente, en base a estas características, se seleccionaron 13 de total de los aislados (diez Lactobacillus sp. y tres Enterococcus sp.) Otra característica probiótica evaluada fue la capacidad de ejercer acción antagónica frente a Salmonella enterica. A través de diferentes ensayos, se evaluó el efecto de los aislados en el crecimiento y en la acción patógena frente a diferentes serovares de Salmonella, y se pudo comprobar el fuerte efecto inhibitorio de los metabolitos presentes en el sobrenadante libre de células (SLC) obtenido a partir de los medios de cultivo de los microorganismos probióticos, el cual se conserva aún al ser diluido. La composición de los sobrenadantes mediante HPLC arrojó como resultado que todos los aislados producían ácidos orgánicos débiles (ácido láctico y ácido acético), tanto en caldo MRS, como en el medio constituido por permeado de suero suplementado con extracto de levadura. Los estudios de la fracción microbiana del cultivo de los microorganismos probióticos en la inhibición de Salmonella, permitieron determinar que sólo algunos de éstos inhibieron su crecimiento en coincubación a tiempos cortos. Por otro lado, ningún aislado fue capaz de inhibir el proceso de formación de biofilm (en coincubación) ni de disminuir significativamente los fenómenos de asociación e invasión de este patógeno a la línea celular Caco-2/TC-7 in vitro. Por último, se realizó la selección final de los aislados con las mejores características probióticas para formular el producto probiótico y se evaluó su efecto durante la crianza de los pollos. Se seleccionaron L. salivarius 1234C, L. agilis 1235C y Enterococcus sp. 2 para constituir el producto probiótico tricepa; a partir del cual, se realizaron dos ensayos in vivo, de tipo exploratorio, para evaluar el efecto de su administración en los pollos. La administración del probiótico tricepa y la cepa L. plantarum CIDCA 83114 no produjo efectos adversos sobre el estado de salud general de los animales. Adicionalmente, la ausencia de translocación a los órganos del medio interno, sugieren que las cepas utilizadas no son patogénicas y son seguras para ser aplicadas como aditivo alimentario en la dieta de pollos parrilleros.

El biodiesel producido por transesterificación de aceites vegetales tiene un importante problema de calidad debido a la presencia de precipitados insolubles, compuestos en su mayoría por esteril glucósidos (EG). Recientemente nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un método enzimático para la eliminación eficiente de los EG del biodiesel, basado en la actividad de una β-glucosidasa de la bacteria Thermococcus litoralis. A partir de estos resultados, el presente trabajo, se basa en la optimización de un sistema de expresión en E. coli de la enzima EGasa1, enzima que hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. Se describe el correspondiente proceso de fermentación a alta densidad celular, de un método de recuperación de la enzima EGasa1 y finalmente el tratamiento enzimático de biodiesel. La enzima hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. En el primer capítulo se describe la ingenieria de E. coli para obtener una elevada producion específica de la enzima EGasa1. Inicialmente se optimizó el uso de codones del gen sintético egasa1 mediante el software Optimizer y se evaluó la expresión de dicho gen a partir de una biblioteca de promotores con distinta actividad. Los resutados obtenidos permitieron seleccionar al promotor pBAD, a partir del cual se evidenció un aumento del 40% de la actividad obtenida con respeto a la actividad inicial generada desde el promotor T7, a expensas de un inductor económico como la L-arabinosa. Dado que, gran parte de la proteína permanecía en la fracción insoluble, se evaluaron diferentes combinaciones de chaperonas moleculares con la finalidad de mejorar el plegamiento. Entre ellos se seleccionó el sistema GroES-GroEL, el cual permitió incrementar tres veces la actividad final de la enzima en la fracción soluble obtenida en cultivos en lote. El paso siguiente fue optimizar las condiciones de crecimiento. Con este fin se analizaron variaciones en la temperatura y DO600 de inducción y en la concentración de L-Arabinosa. Así, se determinó que los mejores niveles de actividad se obtuvieron cuando la cepa con los plásmidos pGro7 y pKCN-BAD-EGasa1 se indujeron en la fase exponencial de crecimiento con 0,5 g/L de L-arabinosa, a 37ºC. El Capítulo 2 tiene como punto de partida a una cepa capaz de expresar de manera soluble y eficiente la EGasa1, pero con una productividad específica (mg de EGasa1/g PS células) que aún puede ser mejorada. Con lo cual el paso siguiente fue el desarrollo del crecimiento en lote alimentado, el cual permite obtener cultivos de altas densidades celulares (HCDC, high cell density culture). Este proceso permitió incrementar el título del producto (U de EGasa1/ml) y la productividad específica (mg de EGasa1/g PS). Inicialmente se ensayó la construcción de operones que incluyan los genes que codifican para EGasa1, el sistema de chaperonas seleccionado previamente, GroES/EL, junto a genes accesorios (un transportador de glicerol (GlpF) y una enzima clave para la biosíntesis de ácidos nucleídos y aminoácidos (PrsA). La incorporación de estos genes accesorios no contribuyó significativamente a aumentar la actividad EGasa1/ml de cultivo en los ensayos realizados con respecto a la cepa que expresa a las chaperonas desde otro plásmido. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la mejor cepa para la producción de EGasa1 a gran escala es la variante que expresa la proteína EGasa1 a partir del plásmido pKCN-BAD-EGasa1, y el sistema de chaperonas GroES-GroEL a partir del plásmido pGro7, los cuales poseen orígenes de replicación compatibles e inducibles por agregado de L-arabinosa. El siguiente objetivo fue seleccionar la fuente de carbono que optimice el rendimiento de los lotes alimentados y disminuya los costos de producción. Los sustratos seleccionados fueron: glucosa, la fuente de carbono preferida para las fermentaciones industriales de E. coli, sacarosa, una materia prima económica proveniente de la caña de azúcar y glicerol, el subproducto más importante de la industria del biodiesel. Para poder utilizar la sacarosa como fuente de carbono, previamente se incorporó el operón metabólico cscAKB a la cepa E. coli BL21 AI. Se obtuvo así la cepa NK5 que crece eficientemente a expensas de sacarosa. Si bien los resultados de las diferentes fermentaciones muestran mayores rendimientos al utilizar glucosa; si se analiza la relación costo/rendimiento, resulta conveniente el uso de glicerol como fuente de carbono para obtener el menor costo de manufactura. El paso siguiente fue modificar el medio salino HM, con la finalidad de obtener un medio más simple y reducir los costos de producción. Para ello se eliminó el extracto de levadura y se reformuló el medio con el fin de minimizar la cantidad de componentes responsables de aportar fosfato, potasio, sodio y nitrógeno, resultando como formulación final: KH2PO4 y NaOH (27,8g/L y 1,32g/L respectivamente). El nitrógeno es aportado por el NH4OH utilizado para mantener en pH 7 el medio a lo largo del proceso de fermentación. En la siguiente etapa del proyecto se buscó determinar las condiciones de post-inducción que permitan obtener la máxima productividad volumétrica (U de EGasa1/ml/h). En primer lugar se analizaron perfiles de post-inducción típicamente utilizados en procesos industriales de producción de enzimas recombinantes: flujo constante 8 g/L/h y 12 g/L/h, flujo lineal (inicial 10 g/L/h, pendiente 0,7 g/L/h2), y un flujo proporcional a la densidad óptica (10 g/L/h para DO=100). Se determinó que el flujo de alimentación más adecuado para producir la enzima EGasa1 a partir de un lote alimentado de E. coli BL21 AI es el constante de 12 g/L/h. Utilizando este flujo se obtiene la mayor productividad (13,7 U/ml/h) luego de 6 horas de inducción a 37ºC. Finalmente se determinó que la relación molar carbono-nitrógeno (C:N) óptima en la solución de alimentación es 5. Con la misma se obtuvo el mayor valor de actividad EGasa1, 466 U/ml. Todos los resultados obtenidos sugieren que las condiciones de fermentación: medio de cultivo, fuente de carbono, método de alimentación post-inducción y relación carbono nitrógeno post inducción son factores importantes que afectan la producción de EGasa1 de E. coli. En en el último capítulo de este trabajo se escaló exitosamente la fermentación a 1000L. También se diseñó el procesamiento de los cultivos y posterior purificación de EGasa1. Para esto se tuvieron en cuenta las características de la enzima: proteína termofílica y asociada a membrana. De esta manera se establecieron las condiciones óptimas de lisis: calentamiento a 80ºC durante 20 minutos, con el agregado de 1% de alcohol láurico etoxilado (7 moles). Finalmente, se determinaron las condiciones de hidrólisis enzimática de EG en biodiesel. Los datos obtenidos permitieron determinar que la temperatura y pH óptimos de hidrólisis fueron 6,75 y 65ºC respectivamente. Se redujo la cantidad de enzima necesaria a 7μg por gramo de biodiesel para la eliminación completa de los EG, y la cantidad de agua utilizada en la hidrólisis al 4,5% del volumen de biodiesel tratado, lo que disminuyó la cantidad de agua residual que se genera. Además, la concentración de iones presentes en el buffer de hidrólisis se redujo, disminuyendo la concentración del buffer fosfato a 10 mM y la del NaCl a 20 mM. El proceso de tratamiento se escaló exitosamente hasta 20 toneladas usando un reactor agitado, en el cual 7g de EGasa1 por tonelada de biodiesel eliminaron por completo las 75 ppm de EG presentes en la muestra en aproximadamente 2 h. Las pruebas de calidad internacionales TC, CSFT, FBT y CSFBT realizadas con el biodiesel tratado con EGasa1 indicaron que la calidad de este biodiesel es comparable a la del biodiesel destilado.