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La sepsis y el shock séptico son serias causas de muerte. Estas condiciones pueden iniciarse por una liberación masiva de lipopolisacárido (LPS) proveniente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas, el cual activa en forma inapropiada el sistema inmune innato. Actualmente, el ensayo enzimático del lisado de amebocitos del Limulus Polyphemus (LAL) se utiliza ampliamente en la detección y cuantificación de endotoxinas en muestras clínicas y no clínicas. Sin embargo, este procedimiento posee varias limitaciones. El LPS está organizado en tres dominios estructurales, un heteropolisacárido que representa la superficie antigénica de la bacteria llamado antígeno O, una porción central constituido por un oligosacárido, denominado núcleo sacárido y una porción lipídica llamada lípido A, responsable de la actividad endotóxica del LPS. Debido a las propiedades químicas del LPS, el estudio de sus rutas metabólicas, su interacción con moléculas de reconocimiento o superficies modificadas, se realiza empleando LPS marcado. Por otra parte, dada su tendencia a formar agregados, su derivatización con técnicas comúnmente utilizadas en polisacáridos rinde resultados pobres y pérdida de su actividad endotóxica. En el presente trabajo de tesis se estudiaron distintas estrategias para la síntesis de conjugados de LPS de Salmonella Minnesota. La derivatización de LPS se llevó a cabo en la región polisacárida lejos del lípido A. Se han sintetizado conjugados con diversas sondas incluyendo, dansilo, biotina, peroxidasa de rábano picante (HRP) y complejos electroactivos. Los conjugados con biotina y HRP se utilizaron en el desarrollo de ensayos competitivos amperométricos para la detección de endotoxinas. La configuración de los ensayos involucra una superficie de oro modificada con un derivado del dextrano y como elemento de reconocimiento una proteína recombinante, Endotoxin Neutralizing Protein (ENP), que reconoce específicamente la región del lípido A del LPS. Para estos ensayos se ha estudiado la modificación de la superficie de oro con polímeros hidrofílicos con el objetivo de minimizar la interacción inespecífica de los componentes del ensayo con la superficie. La construcción de los electrodos se evaluó por medidas electroquímicas, elipsometría y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS). Con el sistema utilizando el conjugado de LPS-HRP se alcanzó un límite de detección de 0,06 UE mL-1.

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 (HIV-1) es el agente causal del Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). El genoma de ARN del HIV-1 presenta variaciones genéticas significativas como resultado de mutaciones constantes, recombinaciones entre cadenas de ARN y presión evolutiva. La variación de las secuencias del virus distribuidas en la naturaleza permitió su clasificación en grupos (M, N y O), subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J y K) y variantes recombinantes. Al demostrarse que algunas cepas recombinantes con patrones idénticos de mosaicismo se han establecido y diseminado en ciertas poblaciones, se determinó clasificarlas separadamente como Formas Recombinantes Circulantes (CRF). En Sudamérica, los subtipos B y F y las recombinantes BF son los predominantes. En Argentina circulan principalmente un 30% de subtipo B y un 65% de recombinantes BF con un predominio de la CRF12_BF. La transmisión de infecciones por el HIV-1 en período de ventana serológico (PVS) es una complicación transfusional de gran importancia. La Tecnología de Amplificación de Ácidos Nucleicos (NAT) permite la detección del agente viral en ausencia de anticuerpos y su implementación en países desarrollados redujo el riesgo de transmisión de la infección por vía transfusional. En países en desarrollo, los costos de los ensayos comerciales de origen importado y la ausencia de desarrollos biotecnológicos regionales impidieron su aplicación. En nuestro país la mayoría de los donantes son de reposición, o sea que están presionados a efectuar la donación, y generalmente son de primera vez, por lo que la prevalencia de marcadores para enfermedades transmitidas por vía transfusional es mayor que en los países desarrollados, en los cuales la mayoría de los donantes son voluntarios y de repetición. Está demostrado que la prevalencia de infecciones transmisibles es mayor en donantes de primera vez que en los de repetición. La mayoría de los laboratorios que realizan el diagnóstico molecular de la infección del HIV-1 en Argentina utilizan ensayos o reactivos que han sido optimizados utilizando el subtipo B como cepa de referencia. Teniendo en cuenta el aumento de la diversidad del HIV-1 observada en los últimos años, en este trabajo de tesis se desarrolló una herramienta diagnóstica que permita la detección de los subtipos y formas recombinantes del HIV-1 circulantes en Argentina. Debido a que las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos (PCR y RT-PCR) son un proceso enzimático con sensibilidad extrema, la calidad del ensayo molecular, en particular con fines diagnósticos, debe ser evaluada continuamente. Para asegurar la calidad del resultado, es necesario incluir en cada reacción de amplificación controles adecuados, siendo de gran importancia la utilización de un Control Interno (CI) a fin de poder verificar la eficiencia en el procesamiento de la muestra y su idoneidad para la amplificación y detección. La producción de un CI para ensayos que amplifiquen virus con genoma de ARN, como el HIV-1, ha sido particularmente difícil debido a la labilidad intrínseca de esta molécula. Un CI apropiado para ensayos moleculares con finesdiagnósticos debe ser homogéneo, estable, seguro para el personal de laboratorio que lo manipula y capaz de verificar tanto la eficiencia en el procesamiento de la muestra como en los procesos de amplificación y detección. En base a estas consideraciones, en este trabajo de tesis se optimizó una RT-PCR para la amplificación de un fragmento de la región gag de los distintos subtipos e inter-subtipos del HIV-1, hibridación líquida de los amplicones resultantes con sondas para cada región génica y detección en microplaca (RTPCR/ SUD). Este ensayo incorpora un CI competitivo (CICSUD) que consiste en un fago Q recombinante en el cual se han reemplazado secuencias fágicas por las del par de cebadores usados para la detección del ARN del HIV-1. El CICSUD es añadido a la muestra de plasma, procesado conjuntamente con el ARN viral y amplificado con el mismo par de cebadores que el HIV-1 por RT-PCR. Los amplicones resultantes son discriminados mediante hibridación líquida con sondas específicas para cada target y detección colorimétrica en formato de enzimoinmunoanálisis. El CICSUD demostró ser estable al menos por 24 meses a 4°C. El sistema RT-PCR/SUD/CICSUD puede detectar todos los subtipos del HIV-1 y factible de ser validado como sistema NAT para la detección sensible y específica de las cepas del HIV-1 circulantes en Argentina en los individuos que se encuentren en PVS. La complejidad de la infección por el HIV-1 requiere de esfuerzos continuos que permitan conocer las cepas virales circulantes y su dinámica, de modo de asegurar una eficiente vigilancia genómica en cada región geográfica. Debido a esto, en este trabajo de tesis se presenta una nueva estrategia para identificar subtipos y cepas recombinantes a través de la temperatura de fusión (Tm) obtenida mediante qPCR y análisis de curvas de disociación. La nueva estrategia fue validada con una prueba de referencia basada en filogenia y podría ser de utilidad para monitorear la evolución de la infección por HIV-1 en nuestra región. Por medio de la selección de regiones genómicas con diferencias en las secuencias nucleotídicas (longitud o contenido GC) entre los subtipos B y F del HIV-1, se pudieron discriminar estos subtipos en dos regiones virales (gag y vif) a través de las Tm obtenidas. Su aplicación en muestras clínicas derivadas de individuos infectados de la región permitió identificar una cepa como intersubtipo F1 en la región gag y como subtipo B en la vif, patrón que no corresponde a ninguna de las CRFs descriptas y que podría ser una posible recombinante con origen evolutivo en cepas circulantes en San Pablo (Brasil). La aplicación de estas herramientas permitirá evaluar la introducción del tamizaje molecular de donantes en el ámbito público de la provincia de Santa Fe y facilitar de manera fehaciente la identificación de las cepas circulantes en nuestra región para posicionarse de manera más efectiva en el control epidemiológico de las infecciones causadas por el HIV-1.

La epilepsia es un trastorno neurológico que afecta al 1-2% de la población mundial. Cerca del 80% de los pacientes con epilepsia viven en países subdesarrollados o en vías de desarrollo y, según la OMS, las ¾ partes no reciben el tratamiento que necesitan. El tratamiento de primera elección es el farmacológico, pero presenta una importante limitación: el 30% de los pacientes con epilepsia no responden satisfactoriamente a la medicación. Es por este motivo que se han buscado otras alternativas para el control de la enfermedad, así como el desarrollo de nuevos fármacos que superen esta limitación. El Laboratorio de Investigaciones y Desarrollo de Bioactivos (LIDeB), se ha dedicado desde su inicio a la búsqueda de nuevos compuestos con actividad anticonvulsivante. En los últimos años, esa búsqueda fue dirigida a mejorar la eficacia del tratamiento farmacológico teniendo en cuenta el alto porcentaje de refractariedad. Una limitación determinante en el descubrimiento de fármacos es la disponibilidad de modelos in vivo que permitan la evaluación rápida y económica de los nuevos compuestos y que representen de la mejor manera posible el escenario clínico. Los modelos de epilepsia existentes son útiles en las etapas avanzadas de la evaluación de fármacos, pero resultan inadecuados para las etapas iniciales, donde la diversidad de compuestos candidatos es muy amplia. En esta tesis hemos desarrollado un modelo de convulsiones fármacorresistentes asociadas a la sobreexpresión de glicoproteína P en ratones, de manera de aportar una herramienta útil a la búsqueda de nuevos compuestos con potencial acción en la epilepsia refractaria.

La emisión de sonidos por larvas de Ceratophrys ornata constituyó un novedoso hallazgo en el cual se presenta la primera evidencia para larvas de anfibios anuros. Tal hallazgo condujo al desarrollo de una nueva línea de investigación, siendo el fundamento de este trabajo de tesis doctoral, habiéndose dividido la investigación en dos partes consecutivas y concatenadas. La primera parte consistió en generar las bases para poder desarrollar un modelo experimental con larvas de esta especie. Para ello, se propuso un protocolo de cría ex-situ de individuos de C. ornata, el cual permitió obtener individuos sanos a lo largo de todo el ciclo vital (desde huevo hasta adulto). Esto último fue posible gracias a la utilización del método de inducción artificial de la reproducción denominado AMPHIPLEX. Dicho método, permitió obtener huevos en distintas épocas del año, no todas coincidentes con el periodo reproductivo de la especie (verano), y recolectar datos su biología, dos logros que de otro modo hubiera resultado dificultoso dado el hábito de vida de la especie. En tal sentido, el presente trabajo de tesis aporta datos de la biología de C. ornata relativos a su reproducción (actividad reproductiva, cantidad de huevos depositados por puesta, porcentaje de eclosión de los huevos), crecimiento (curvas de crecimiento desde la etapa larval hasta la adultez), desarrollo (tiempo promedio en alcanzar determinados estadios), enfermedades (diagnóstico y tratamiento), comportamiento (llamada agonística, llamada de anuncio y reciprocidad y movimiento pedal) y biología general. Al mismo tiempo, la aplicación del protocolo en especies filogenéticamente relacionadas con C. ornata y de hábitos similares (C. cranwelli, C. aurita y Lepidobatrachus llanensis), permitió su validación. La cría ex-situ es una estrategia que evita la continua extracción de animales de su hábitat natural y sienta las bases para el desarrollo de investigaciones en aquellos casos que los estudios in-situ resultan imposibles o complejos de realizar. Una vez desarrollado el protocolo de cría en cautiverio de individuos de C. ornata, y mediante la obtención de larvas de distintos estadios del desarrollo, se describió la variabilidad de los sonidos producidos tanto en un medio acuático como aéreo. Previamente, se realizó una consulta interdisciplinaria con especialistas en sonidos, a partir de la cual se descubrieron algunos aspectos a mejorar en el sistema de grabación. Se realizó un procedimiento de calibrado y compensado del sistema de grabación que permitió obtener grabaciones de alta confiabilidad. Además, se implementó un método de mejoramiento de la relación señal-ruido, el cual permitió obtener grabaciones con espectros más nítidos y fáciles de analizar. Se realizaron además mediciones del sonido emitido por individuos de C. ornata en el medio aéreo mediante un sistema de medición adecuado (sonómetro), el cual permitió caracterizar el sonido tanto cuali como cuantitativamente mediante variables acústicas. Se concluye que para caracterizar adecuadamente un sonido de las características aquí presentadas (bajo nivel de presión sonora), resulta necesario utilizar instrumentos de medición calibrados con sistemas de referencia acústica. La variables analizadas fueron a) bioacústicas: duración del sonido (Ds), expresada en segundos (s), número de pulsos (Np), número de interpulsos (Nip), frecuencia dominante (Fd) expresada en Hertz (Hz); b) acústicas: nivel sonoro continuo equivalente (LAeq) expresado en decibeles (dB), nivel sonoro máximo (LAFmax, dB) y nivel sonoro que se ha igualado o superado durante el 90% del tiempo de medición (cercano al ruido de fondo; LAF90, dB). Se registró la emisión de sonidos desde el estadio 25 al 41, estadios luego de los cuales las larvas no emiten sonidos hasta completar el proceso metamórfico, momento en el cual los juveniles vuelven a producir sonidos manteniéndose esta situación durante todo el ciclo vital. Por último, la aplicación del protocolo de cría en otras especies de anuros filogenéticamente relacionados con C. ornata, permitió evaluar y describir la emisión de sonidos por otras larvas de anuros de la familia Ceratophryidae. Consecuentemente, se constató y registró el sonido emitido por larvas de C. cranwelli y C. aurita y la no emisión de sonidos por larvas de Lepidobatrachus llanensis dentro del rango de frecuencias evaluado. Por lo tanto, la hipótesis original que plantea que la emisión de sonidos está presente en todas las larvas de anuros macrófagas y carnívoras debe ser rechazada. Luego de describir los sonidos, se evaluó el contexto de emisión por parte de larvas de C. ornata, pudiéndose concluir que las mismas emiten sonidos en diferentes contextos (interacción intraespecífica o con un objeto), habiéndose incluido a los sonidos en la categoría de llamada agonística (distress call). Hasta el momento, no existían estudios que analicen la variación de estos sonidos desde fases tempranas del desarrollo larval y a lo largo de todo el ciclo vital. Respecto a la evaluación del mecanismo de emisión de sonidos, a partir de una serie de pruebas morfo-funcionales realizadas, se hipotetizó que el aire empleado en la producción de sonidos durante estadios larvales proviene del estómago, pasa por la glotis (donde existiría una estructura resonante) y luego por la cavidad bucofaríngea (sin salir de la misma). Además, se evaluaron interacciones predador-presa intra e interespecíficas, entre larvas de C. ornata y entre éstas y larvas que forman parte de su dieta habitual, en distintos estadios del desarrollo y bajo diferentes condiciones experimentales (densidad y proporciones predador-presa). Se concluye que C. ornata posee un mecanismo antipredatorio que disminuye la frecuencia de predación entre organismos conespecíficos ante la presencia de presas heteroespecíficas. Se evaluaron también interacciones intra e interespecíficas para larvas de C. cranwelli y L. llanensis con el objetivo de determinar similitudes y diferencias con el mecanismo antipredatorio de C. ornata. En tal sentido, se concluye que el mecanismo de Ceratophrys está compuesto por un rápido movimiento de la cola, más la emisión de sonidos y la consiguiente huida (escape) de la presa del predador. En cambio, si bien para L. llanensis también se describió un rápido movimiento de la cola seguido del escape de la presa del predador, no se registró la emisión de sonidos asociada. Más allá de las diferencias metodológicas, si se comparan los tres mecanismos se concluye que los mismos presentan el siguiente grado de eficiencia de mayor a menor: C. ornata, C. cranwelli, L. llanensis. A partir de los estudios anteriormente detallados se planteó una segunda parte con el objetivo de evaluar los efectos del clorpirifós (CPF), un plaguicida organofosforado de uso frecuente en la región Pampeana, sobre larvas de C. ornata y aplicar el modelo desarrollado en la primera parte. El primer objetivo fue evaluar efectos letales y subletales sobre las larvas expuestas a este plaguicida. Teniendo en cuenta que los plaguicidas organofosforados poseen acción neurotóxica por inhibición de la acetilcolinesterasa, los mismos pueden alterar al aparato de emisión de sonidos y al sonido en sí mismo. En tal sentido, se evaluaron no solo los parámetros ecotoxicológicos convencionales sino también el efecto sobre los parámetros normales del sonido. Los puntos finales ecotoxicológicos analizados fueron: mortalidad, alteraciones en la natación, presencia de anormalidades e inhibición del crecimiento. Además, se evaluaron las mismas variables bioacústicas antes detalladas (Ds, Np, Nip, Fd). La sensibilidad de la especie al CPF se encuentra cercana al percentil 26, teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CL-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. En relación con los efectos subletales, la especie se encuentra cercana al percentil 5 (alteraciones en la natación) y 33 (presencia de anormalidades), teniendo en cuenta la curva de sensibilidades construida con datos de CE-50 a 96 h publicados para otras especies de anfibios anuros. El diseño experimental propuesto (larvas expuestas de forma individual), permitió demostrar que los efectos negativos del CPF, en el intervalo de concentraciones ensayadas, no revierten sino que se mantienen constantes. Se concluye que existe una progresión de efectos negativos del CPF, desde alteraciones en la natación seguidas por la presencia de anormalidades leves y luego severas hasta la muerte. Por último, se puso a prueba el modelo mediante la evaluación del sonido como punto final de efectos producidos por el CPF sobre larvas de esta especie. Se concluye que el sonido constituye un buen biomarcador de efectos subletales. A partir del resumen e integración de la información toxicológica existente sobre efectos del CPF en anfibios y exposición del CPF en el ambiente, mediante la herramienta de evaluación del riesgo ecológico, y la contextualización de los resultados obtenidos, se concluye que el CPF implica un riesgo muy bajo para las distintas especies de anuros evaluadas, al menos al considerar la exposición ante concentraciones esperadas en el ambiente (ecosistemas acuáticos pampeanos). El presente constituye el primer bioensayo de exposición de larvas de C. ornata a un agroquímico de uso frecuente en la región Pampeana y la primera evidencia de efectos sobre el sonido emitido por larvas de esta especie. Consecuentemente, constituye el primer estudio sobre dicha temática (efectos del CPF sobre el sonido) realizado con larvas de vertebrados acuáticos. Por sus características biológicas y su manejo en laboratorio (facilidad para criarlas en condiciones controladas), la especie resulta de gran interés como modelo de estudio en Ecotoxicología. El estudio se encuentra en un marco general de investigación de impacto de plaguicidas en agroecosistemas de la región Pampeana, junto al desarrollo y aplicación de estrategias de monitoreo, para la evaluación de efectos biológicos de plaguicidas sobre anuros autóctonos. El modelo probado resultará una herramienta útil para el desarrollo futuro de más experimentos, generando así un modelo completo de evaluación de efectos.

Las alergias alimentarias se han convertido en uno de los problemas sanitarios prioritarios en muchos países, debido a la severidad con la que pueden presentarse (la anafilaxia es la principal causa de visitas en la sala de emergencias) y al dramático aumento en su incidencia en las últimas décadas. Se estima que en la población general aproximadamente entre el 4 y el 8% de los niños, y entre el 1 al 3 % de los adultos, tienen alergia alimentaria. Actualmente el único tratamiento efectivo consiste en la erradicación de la dieta de el/los alergenos perjudiciales, siendo bastante frecuentes las reacciones ocasionadas por la ingestión accidental de los mismos. Con el fin de profundizar en la comprensión de los mecanismos moleculares de esta patología y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, los modelos animales de alergia alimentaria constituyen una herramienta biológica de gran relevancia. Siendo la alergia a leche de vaca la causa más común de alergia alimentaria en lactantes y niños, y debido a la existencia de pacientes que presentan intolerancia a los sustitutos lácteos empleados (hidrolizados extensivos de proteínas de leche de vaca o fórmulas a base de proteínas de leche de soja o sus derivados), es que nos planteamos, en el presente trabajo de tesis estudiar las condiciones que permitan obtener un modelo murino de alergia alimentaria para este alimento, que represente de manera satisfactoria la patología observada en humanos. El mismo nos permitirá en un futuro ahondar en el estudio de los mecanismos celulares y moleculares de esta patología, en la evaluación de nuevos alimentos hipoalergénicos, o en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

A lo largo de los años la industria avícola en Argentina ha evolucionado y crecido marcadamente, lo cual ha traído nuevo desafíos en pos de sostener el ritmo de producción intensivo. El uso indiscriminado de antibióticos utilizados como promotores de crecimiento (APC) para sostener la producción ha favorecido la diseminación de resistencias bacterianas, lo cual conlleva a buscar alternativas a los APC. Una de ellas son los probióticos. Por lo que, el objetivo principal de esta tesis fue aislar diferentes bacterias del tracto gastrointestinal de una de las razas de pollos de mayor comercialización en el país (Cobb) para formular un producto probiótico de origen nacional. Se debe mencionar que este trabajo de tesis doctoral fue realizado en el marco de un Proyecto de Investigación y Desarrollo (PID 2014-0049), denominado “Producción de probióticos aviares para la República Argentina”. Inicialmente, se aislaron un total de 62 bacterias lácticas de buche, yeyuno - íleon y ciegos, a partir de las cuales se estudiaron algunas características probióticas in vitro, como resistencia a la acidez, resistencia a la bilis y resistencia al pasaje por el tracto gastrointestinal, donde la mayoría de los aislados fueron capaces de sobrevivir (en mayor o menor medida) a las condiciones mencionadas. También se evaluó el crecimiento en diferentes medios de cultivo alternativos al MRS comercial, donde los aislados demostraron ser capaces de crecer en permeado de suero y permeado de suero adicionado con extracto de levadura, en concentraciones comparables a las obtenidas utilizando MRS. Finalmente, en base a estas características, se seleccionaron 13 de total de los aislados (diez Lactobacillus sp. y tres Enterococcus sp.) Otra característica probiótica evaluada fue la capacidad de ejercer acción antagónica frente a Salmonella enterica. A través de diferentes ensayos, se evaluó el efecto de los aislados en el crecimiento y en la acción patógena frente a diferentes serovares de Salmonella, y se pudo comprobar el fuerte efecto inhibitorio de los metabolitos presentes en el sobrenadante libre de células (SLC) obtenido a partir de los medios de cultivo de los microorganismos probióticos, el cual se conserva aún al ser diluido. La composición de los sobrenadantes mediante HPLC arrojó como resultado que todos los aislados producían ácidos orgánicos débiles (ácido láctico y ácido acético), tanto en caldo MRS, como en el medio constituido por permeado de suero suplementado con extracto de levadura. Los estudios de la fracción microbiana del cultivo de los microorganismos probióticos en la inhibición de Salmonella, permitieron determinar que sólo algunos de éstos inhibieron su crecimiento en coincubación a tiempos cortos. Por otro lado, ningún aislado fue capaz de inhibir el proceso de formación de biofilm (en coincubación) ni de disminuir significativamente los fenómenos de asociación e invasión de este patógeno a la línea celular Caco-2/TC-7 in vitro. Por último, se realizó la selección final de los aislados con las mejores características probióticas para formular el producto probiótico y se evaluó su efecto durante la crianza de los pollos. Se seleccionaron L. salivarius 1234C, L. agilis 1235C y Enterococcus sp. 2 para constituir el producto probiótico tricepa; a partir del cual, se realizaron dos ensayos in vivo, de tipo exploratorio, para evaluar el efecto de su administración en los pollos. La administración del probiótico tricepa y la cepa L. plantarum CIDCA 83114 no produjo efectos adversos sobre el estado de salud general de los animales. Adicionalmente, la ausencia de translocación a los órganos del medio interno, sugieren que las cepas utilizadas no son patogénicas y son seguras para ser aplicadas como aditivo alimentario en la dieta de pollos parrilleros.

El biodiesel producido por transesterificación de aceites vegetales tiene un importante problema de calidad debido a la presencia de precipitados insolubles, compuestos en su mayoría por esteril glucósidos (EG). Recientemente nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un método enzimático para la eliminación eficiente de los EG del biodiesel, basado en la actividad de una β-glucosidasa de la bacteria Thermococcus litoralis. A partir de estos resultados, el presente trabajo, se basa en la optimización de un sistema de expresión en E. coli de la enzima EGasa1, enzima que hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. Se describe el correspondiente proceso de fermentación a alta densidad celular, de un método de recuperación de la enzima EGasa1 y finalmente el tratamiento enzimático de biodiesel. La enzima hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. En el primer capítulo se describe la ingenieria de E. coli para obtener una elevada producion específica de la enzima EGasa1. Inicialmente se optimizó el uso de codones del gen sintético egasa1 mediante el software Optimizer y se evaluó la expresión de dicho gen a partir de una biblioteca de promotores con distinta actividad. Los resutados obtenidos permitieron seleccionar al promotor pBAD, a partir del cual se evidenció un aumento del 40% de la actividad obtenida con respeto a la actividad inicial generada desde el promotor T7, a expensas de un inductor económico como la L-arabinosa. Dado que, gran parte de la proteína permanecía en la fracción insoluble, se evaluaron diferentes combinaciones de chaperonas moleculares con la finalidad de mejorar el plegamiento. Entre ellos se seleccionó el sistema GroES-GroEL, el cual permitió incrementar tres veces la actividad final de la enzima en la fracción soluble obtenida en cultivos en lote. El paso siguiente fue optimizar las condiciones de crecimiento. Con este fin se analizaron variaciones en la temperatura y DO600 de inducción y en la concentración de L-Arabinosa. Así, se determinó que los mejores niveles de actividad se obtuvieron cuando la cepa con los plásmidos pGro7 y pKCN-BAD-EGasa1 se indujeron en la fase exponencial de crecimiento con 0,5 g/L de L-arabinosa, a 37ºC. El Capítulo 2 tiene como punto de partida a una cepa capaz de expresar de manera soluble y eficiente la EGasa1, pero con una productividad específica (mg de EGasa1/g PS células) que aún puede ser mejorada. Con lo cual el paso siguiente fue el desarrollo del crecimiento en lote alimentado, el cual permite obtener cultivos de altas densidades celulares (HCDC, high cell density culture). Este proceso permitió incrementar el título del producto (U de EGasa1/ml) y la productividad específica (mg de EGasa1/g PS). Inicialmente se ensayó la construcción de operones que incluyan los genes que codifican para EGasa1, el sistema de chaperonas seleccionado previamente, GroES/EL, junto a genes accesorios (un transportador de glicerol (GlpF) y una enzima clave para la biosíntesis de ácidos nucleídos y aminoácidos (PrsA). La incorporación de estos genes accesorios no contribuyó significativamente a aumentar la actividad EGasa1/ml de cultivo en los ensayos realizados con respecto a la cepa que expresa a las chaperonas desde otro plásmido. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la mejor cepa para la producción de EGasa1 a gran escala es la variante que expresa la proteína EGasa1 a partir del plásmido pKCN-BAD-EGasa1, y el sistema de chaperonas GroES-GroEL a partir del plásmido pGro7, los cuales poseen orígenes de replicación compatibles e inducibles por agregado de L-arabinosa. El siguiente objetivo fue seleccionar la fuente de carbono que optimice el rendimiento de los lotes alimentados y disminuya los costos de producción. Los sustratos seleccionados fueron: glucosa, la fuente de carbono preferida para las fermentaciones industriales de E. coli, sacarosa, una materia prima económica proveniente de la caña de azúcar y glicerol, el subproducto más importante de la industria del biodiesel. Para poder utilizar la sacarosa como fuente de carbono, previamente se incorporó el operón metabólico cscAKB a la cepa E. coli BL21 AI. Se obtuvo así la cepa NK5 que crece eficientemente a expensas de sacarosa. Si bien los resultados de las diferentes fermentaciones muestran mayores rendimientos al utilizar glucosa; si se analiza la relación costo/rendimiento, resulta conveniente el uso de glicerol como fuente de carbono para obtener el menor costo de manufactura. El paso siguiente fue modificar el medio salino HM, con la finalidad de obtener un medio más simple y reducir los costos de producción. Para ello se eliminó el extracto de levadura y se reformuló el medio con el fin de minimizar la cantidad de componentes responsables de aportar fosfato, potasio, sodio y nitrógeno, resultando como formulación final: KH2PO4 y NaOH (27,8g/L y 1,32g/L respectivamente). El nitrógeno es aportado por el NH4OH utilizado para mantener en pH 7 el medio a lo largo del proceso de fermentación. En la siguiente etapa del proyecto se buscó determinar las condiciones de post-inducción que permitan obtener la máxima productividad volumétrica (U de EGasa1/ml/h). En primer lugar se analizaron perfiles de post-inducción típicamente utilizados en procesos industriales de producción de enzimas recombinantes: flujo constante 8 g/L/h y 12 g/L/h, flujo lineal (inicial 10 g/L/h, pendiente 0,7 g/L/h2), y un flujo proporcional a la densidad óptica (10 g/L/h para DO=100). Se determinó que el flujo de alimentación más adecuado para producir la enzima EGasa1 a partir de un lote alimentado de E. coli BL21 AI es el constante de 12 g/L/h. Utilizando este flujo se obtiene la mayor productividad (13,7 U/ml/h) luego de 6 horas de inducción a 37ºC. Finalmente se determinó que la relación molar carbono-nitrógeno (C:N) óptima en la solución de alimentación es 5. Con la misma se obtuvo el mayor valor de actividad EGasa1, 466 U/ml. Todos los resultados obtenidos sugieren que las condiciones de fermentación: medio de cultivo, fuente de carbono, método de alimentación post-inducción y relación carbono nitrógeno post inducción son factores importantes que afectan la producción de EGasa1 de E. coli. En en el último capítulo de este trabajo se escaló exitosamente la fermentación a 1000L. También se diseñó el procesamiento de los cultivos y posterior purificación de EGasa1. Para esto se tuvieron en cuenta las características de la enzima: proteína termofílica y asociada a membrana. De esta manera se establecieron las condiciones óptimas de lisis: calentamiento a 80ºC durante 20 minutos, con el agregado de 1% de alcohol láurico etoxilado (7 moles). Finalmente, se determinaron las condiciones de hidrólisis enzimática de EG en biodiesel. Los datos obtenidos permitieron determinar que la temperatura y pH óptimos de hidrólisis fueron 6,75 y 65ºC respectivamente. Se redujo la cantidad de enzima necesaria a 7μg por gramo de biodiesel para la eliminación completa de los EG, y la cantidad de agua utilizada en la hidrólisis al 4,5% del volumen de biodiesel tratado, lo que disminuyó la cantidad de agua residual que se genera. Además, la concentración de iones presentes en el buffer de hidrólisis se redujo, disminuyendo la concentración del buffer fosfato a 10 mM y la del NaCl a 20 mM. El proceso de tratamiento se escaló exitosamente hasta 20 toneladas usando un reactor agitado, en el cual 7g de EGasa1 por tonelada de biodiesel eliminaron por completo las 75 ppm de EG presentes en la muestra en aproximadamente 2 h. Las pruebas de calidad internacionales TC, CSFT, FBT y CSFBT realizadas con el biodiesel tratado con EGasa1 indicaron que la calidad de este biodiesel es comparable a la del biodiesel destilado.

La “mojarra” Cheirodon interruptus (Ostariophysi: Characidae) es una especie autóctona que presenta una amplia distribución en Argentina, especialmente en la región pampeana, abarcando tanto ambientes lóticos como lénticos. Su talla máxima promedia los 55 mm para los machos y 65 mm en las hembras. Por ser una especie abundante, eurioica y muy resistente, C. interruptus es la especie más utilizada como carnada por la mayoría de los pescadores aficionados a la pesca del pejerrey con caña. La extracción de ejemplares salvajes, para abastecer este vasto mercado, se realiza con redes de arrastre de malla fina, produciendo un impacto sobre las comunidades de peces y un deterioro de los ambientes someros de arroyos, bañados o lagunas. Estas áreas constituyen hábitats de cría para muchas especies de peces y otros organismos que no sólo son capturados y descartados durante la extracción de mojarras, sino que también ven reducidas sus posibilidades de supervivencia debido a que su ambiente es perturbado y desestructurado. Los vendedores de carnada en su mayoría compran mojarras provenientes de zonas distantes siendo las más lejanas Tres Arroyos, Buenos Aires y Tanti, Córdoba, observándose dificultades en el traslado y el mantenimiento de los ejemplares. Las grandes distancias y las pobres condiciones de traslado y mantenimiento representan un riesgo en la propagación de hongos y parásitos de importancia en acuicultura. El objetivo general de esta tesis fue generar el conocimiento biotecnológico necesario para desarrollar sistemas de producción para el carácido autóctono, C. interruptus, que permitan ofrecer una alternativa a la pesca de poblaciones naturales para su utilización como carnada y posibilite el acceso a un stock permanente y estandarizado de individuos para realizar evaluaciones de toxicidad mediante ensayos de laboratorio. A estos efectos se realizaron una serie de pruebas y experimentos orientados a resolver la problemática planteada. En primer lugar se realizaron experiencias tendientes a evaluar el rendimiento de diferentes tipos de sistemas para la obtención de desoves y larvas, a diferentes escalas de volumen y condiciones ambientales a fin de identificar las posibilidades y limitaciones de cada uno. El sistema de acuarios fue el que mostró mejores resultados en cuanto a la cantidad de huevos embrionados y juveniles de un mes de vida obtenidos por pareja reproductora y el sistema de estanques es el que permitió obtener la mayor cantidad de juveniles por evento reproductivo. C. interruptus se reprodujo exitosamente en todos los sistemas ensayados y en un amplio rango de parámetros fisicoquímicos (pH, conductividad y temperatura) lo que evidencia la potencialidad de la especie para la acuicultura. En segunda instancia se realizaron experimentos destinados a profundizar el conocimiento de la biología reproductiva de C. interruptus. Se desarrolló un sistema de recirculación de agua con capacidad de controlar el fotoperíodo y la temperatura en 12 acuarios para la realización de 4 tratamientos por triplicado. Se realizó un primer experimento para evaluar la influencia de diferentes regímenes de fotoperíodo artificial sobre la maduración ovárica en C. interruptus. Considerando los resultados obtenidos se realizó un segundo experimento combinando el fotoperíodo y la temperatura. Los resultados en el primer experimento no sólo indicaron que los tratamientos fotoperiódicos pueden afectar el desarrollo de los ovarios sino también evidenciaron diferentes respuestas en los parámetros reproductivos evaluados. Los resultados del tratamiento de fotoperíodo progresivo en el cual se comprimió la función del incremento de horas de luz diaria observado en la transición invierno-primavera, afirman la idea de que el control del fotoperíodo puede promover la maduración ovárica en C. interruptus debido a que en este tratamiento se registraron los valores significativamente superiores en los parámetros reproductivos evaluados. La exposición a iluminación permanente, evidenció una disminución generalizada de los valores del índice gonadosomático, alcanzando los valores más bajos con la menor dispersión de todo el experimento. En cambio, el tratamiento 12 horas luz-día no indujo ningún cambio en el tejido gonadal. Los resultados del segundo experimento fueron consistentes con lo observado anteriormente. El tratamiento de fotoperíodo y temperatura progresiva alcanzó el valor máximo de IGS representando un avance en el desarrollo gonadal cercano al 20% con respecto al alcanzado en el tratamiento de fotoperíodo progresivo sin incremento de temperatura del experimento anterior. Esto sugiere que la temperatura tiene una influencia en el desarrollo ovárico en C. interruptus acelerando los procesos de cambio generados por el fotoperíodo, ya que se obtuvo una mayor maduración en el mismo intervalo de tiempo. De acuerdo a los resultados de este estudio, el fotoperíodo y la temperatura deberían ser considerados como herramientas de manejo relevantes en el desarrollo de técnicas de cultivo para la especie. En una tercera etapa se trató el crecimiento individual de C. interruptus que es uno de los aspectos más relevantes para la comprensión de la ecología y el cultivo de esta especie. Se calcularon los principales estimadores de crecimiento instantáneos en diferentes sistemas de cultivo a partir de experimentos en que se realizó la cría de ejemplares de pocos días hasta su adultez en acuarios y estanques. Se evaluaron diferentes modelos matemáticos para describir la dinámica del crecimiento individual de la especie. Además se analizó el rol del fotoperíodo y la temperatura en el crecimiento. Se obtuvieron resultados semejantes de crecimiento a lo largo de todo el periodo de cultivo en los sistemas evaluados. Se propone la utilización del modelo Logístico para la descripción del crecimiento en C. interruptus en función del tiempo, especialmente si se incluyen la primeras etapas de la ontogenia, debido a que mostró el mejor ajuste a los datos provenientes de los sistemas de cultivo según criterios elegidos. El modelo seleccionado indica que el tiempo requerido para llegar al primer tamaño de venta es de 83 a 100 días dependiendo del sistema utilizado, posibilitando la obtención de 3 o 4 ciclos productivos al año utilizando las mismas instalaciones. También se corroboró el crecimiento diferencial por sexo en C. interruptus donde se observa una mayor longitud final alcanzada en hembras y una tasa de crecimiento mayor en machos. En los experimentos en los que se manipuló el fotoperíodo y la temperatura, se observó que la longitud final alcanzada por los peces en el tratamiento de iluminación permanente fue máxima. Fotoperíodos artificiales largos sumado al incremento de temperatura estimulan el crecimiento somático en C. interruptus por lo que deben ser considerados como herramientas para aumentar la eficiencia de la producción. Finalmente se evaluó el uso de la especie como modelo para la realización de bioensayos de toxicidad. Se calcularon concentraciones letal cincuenta (CL50) promedio para plaguicidas de amplia utilización en cultivos de soja (lambdacialotrina, clorpirifos y cipermetrina). C. interruptus mostró una alta sensibilidad a lambdacialotrina situándose en el 10 % de las especies más sensibles a este compuesto para los ensayos con recambio de medio. Para clorpirifos y cipermetrina se observó una sensibilidad media. El desarrollo de estudios con especies autóctonas permite comprender de una mejor manera la estructura y la dinámica de los sistemas. Teniendo en cuenta la resistencia a la manipulación, su amplia distribución, la representatividad que tiene en diferentes ambientes pampeanos y la sensibilidad observada a lambdacialotrina, es una especie adecuada para ser utilizada como un organismo centinela para la evaluación del riesgo ambiental. La tolerancia a la manipulación y la rápida adaptación a distintas condiciones de mantenimiento en adición a la factibilidad de su reproducción en distintos sistemas de cultivo señalan a C. interruptus como un candidato adecuado para desarrollar emprendimientos acuícolas a gran escala en distintas zonas de la región pampeana. De esta manera es factible ofrecer una alternativa a la explotación de poblaciones naturales y disponer de un stock estandarizado para su utilización en bioensayos de toxicidad.

El pejerrey, Odontesthes bonariensis, es la especie nativa de mayor importancia socioeconómica que habita las aguas interiores de la Argentina. Históricamente, el manejo del recurso “pejerrey” ha estado limitado a siembras de larvas obtenidas a partir de desoves artificiales para reforzar las poblaciones naturales. El manejo está así planteado porque la producción, de individuos de mayor talla para realizar siembras más efectivas o incluso para el consumo, en sistemas semi-intensivos o intensivos, aun implica costos que son superiores a los posibles beneficios. Desde hace varios años se encuentra en desarrollo la tecnología de cría de pejerrey en jaulas flotantes adaptadas a las lagunas pampásicas. Esta técnica, ha arrojado resultados productivos muy promisorios y permitiría obtener juveniles de pejerrey (6 a 10 cm), a densidades de 50 a 100 ind/m2, a costos menores que los del sistema tradicional. Experiencias previas de cultivo extensivo en jaulas flotantes comprobaron que la producción de pejerrey en este sistema sin otro suministro de alimento que el natural, se encuentra fuertemente condicionada por la disponibilidad de zooplancton. Esta situación determina que la cría en jaulas, apelando únicamente a la producción de los cuerpos de agua, resulte eficiente como herramienta para la producción de juveniles pero presenta limitaciones para obtener ejemplares de más de un año, cuando las condiciones limnológicas de los ambientes de cría son limitantes. El objetivo general de esta tesis fue desarrollar un paquete tecnológico y de pautas de manejo, que permita criar pejerreyes en un sistema de cría semi-intensivo en jaulas flotantes dentro de lagunas pampásicas. A estos efectos se realizaron una serie de experimentos orientados a resolver la problemática planteada. El primer experimento evaluó si los peces cultivados en jaulas dentro de lagunas aceptaban el alimento balanceado y si el complemento alimentario artificial extra era capaz de mejorar el crecimiento y la supervivencia de los pejerreyes durante el período invernal, considerado critico para el cultivo extensivo en jaulas. Los resultados mostraron que todas las tasas obtenidas como la producción fueron mejores en las jaulas subsidiadas con alimento, donde se obtuvieron los peces de mayor tamaño y las mejores producciones conocidas hasta el momento en la literatura. De este modo, se pudo establecer que si durante el periodo crítico para el crecimiento de los pejerreyes bajo condiciones extensivas se provee alimento balanceado, aún a bajas temperaturas, el pejerrey puede crecer por encima de los parámetros conocidos para la cría en jaulas sin provisión de alimento. El segundo experimento buscó maximizar el crecimiento mediante el manejo de las raciones otorgadas, tratando de establecer raciones máximas y mínimas para poder obtener altas tasas de crecimiento y producción. Para este experimento se testearon dos raciones de alimento balanceado, una equivalente al 5% de la biomasa bajo cultivo y otra equivalente al 7%, tratamientos 5% y 7% respectivamente y un tratamiento control que consistió en mantener a los peces bajo cultivo extensivo. Tempranamente los peces de los tratamientos 5% y 7% mostraron mejores tallas y pesos con respecto al tratamiento control, demostrando nuevamente que el cultivo semi-intensivo mejora las condiciones de cría y los rendimientos. A lo largo del invierno los peces de los tratamientos 5% y 7% crecieron de manera similar donde se deduce que el crecimiento encontró en este periodo un límite superior donde por el agregado de alimento no mejoró las tasas evaluadas. Esto puede deberse a la temperatura o al zooplancton en defecto, ya que cuando las condiciones mejoraron a finales del invierno y principios de primavera los peces alimentados a 7% presentaron mejores crecimientos y producciones con respecto a los peces del tratamiento 5%. De este experimento se concluye que durante condiciones de baja temperatura y baja producción en la laguna, la tasa de alimentación balanceada no debe superar el 5%, pero cuando las condiciones mejoran esta debe ser superior o igual al 7% para maximizar el crecimiento y optimizar las capacidades de la técnica de cultivo y de la especie. Considerando los resultados previos se planteo el tercer experimento en el cual se evaluaron bajo un sistema de cría semi-intensivo diferentes densidades de siembra y como estas influencian en el crecimiento de los peces y la producción del sistema de cultivo. Tres densidades fueron testeadas, 300, 600 y 900 individuos por jaula (25, 50 y 75 ind./m3). Los resultados mostraron que existieron diferencias tanto en el crecimiento de los peces como en la producción del sistema a las diferentes densidades. A menor densidad se observaron mayores crecimientos y a mayor densidad mejores producciones. Por otro lado, no se evidenciaron grupos dominantes ni una gran variación de los coeficientes de variación ni en largo ni en peso, donde se deduce que el pejerrey presenta un comportamiento de cardumen. Por último, se encontró una relación positiva entre la supervivencia y la densidad. Esto evidencia que el pejerrey es un pez que soporta muy bien el hacinamiento del sistema de cultivo a las densidades testeadas, por lo que se concluye que la especie podría cultivarse en jaulas a densidades mayores que la máxima testeada y obtenerse así mejores rendimientos. Con la totalidad de los datos colectados durante los experimentos y la información disponible sobre crecimiento de pejerrey bajo diferentes sistemas de cultivo, se ajustaron modelos con los cuales se realizaron simulaciones de crecimiento a partir de los 80 hasta los 330 días de vida partiendo de un ejemplar hipotético que ha dicha edad presenta un peso promedio de 1,5g y de 6,5 cm . El resultado de la simulación indicó que aplicando la técnica de cultivo semi-intensivo en jaulas flotantes se podrían obtener peces de 128,7 g en menos de un año. Si bien este peso se encuentra por encima de los que se alcanzó mediante cualquier método de cría, debería practicarse un experimento de cultivo por el término de un año para validar al modelo. Finalmente teniendo en cuenta la información generada a lo largo del trabajo se sugieren pautas para monitorear stocks bajo cultivo así como también normas para obtener los mayores beneficios productivos cuando se aplica la técnica.

Durante este trabajo se obtuvieron distintas líneas de plantas de tabaco transplantómicas para el antígeno viral E7 del virus del papiloma humano (VPH). La capacidad del sistema plastídico para producir el antígeno viral fue verificada. Asimismo se comprobó que la proteólisis del péptido es el factor determinante de la expresión y principal limitante de los niveles de acumulación de la proteína recombinante. La modificación de las características intrínsecas del polipéptido mediante la fusión traduccional a otras proteínas como la cápside viral de PVX o la enzima β-glucuronidasa mostró ser una estrategia válida para reducir la tasa de degradación de E7. De esta forma se alcanzó un incremento de la expresión entre 5 y 10 veces superior a lo observado con E7 por masa de tejido. Sin embargo los mejores resultados se obtuvieron al reorientar la acumulación del antígeno viral hacia un entorno con características bioquímicas diferentes como es el lumen tilacoide. Por primera vez se logró translocar una proteína codificada por el plastoma a través de la membrana tilacoide utilizando una secuencia específica de la misma especie, la señal bipartita amino-terminal del gen OEC23 de tabaco. Los niveles de acumulación del antígeno en el tilacoide resultaron ser dos órdenes de magnitud superiores a los observados en el estroma. Los resultados de este trabajo muestran distintos abordajes basados en la utilización de plantas de tabaco transplastómicas como biorreactores para la producción de proteínas de interés inestables como E7 del VPH.