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El objetivo general de este trabajo de tesis fue desarrollar diferentes metodologías que permitan explicar las bases moleculares de las alergias alimentarias a proteínas de leche de vaca y a soja e identificar potenciales proteínas de reactividad cruzada entre ambos sistemas, con el fin último de aplicar estos nuevos conocimientos para el desarrollo de técnicas de inmunointervención destinadas a establecer tolerancia oral a leche de vaca. Los objetivos particulares fueron:  Empleando técnicas de inmunoproteómica, identificar los epitopes reconocidos por los anticuerpos monoclonales contra caseínas bovinas utilizados para la detección de proteínas de soja de reactividad cruzada.  Obtener de forma recombinante y caracterizar in vitro mediante distintas herramientas inmunológicas los dos alergenos mayoritarios de la soja Gly m Bd 30K (P34) y Gly m Bd 28K (P28).  Estudiar la relevancia clínica de las proteínas de soja caracterizadas en un modelo animal de alergia alimentaria a leche de vaca.  Aplicar la información obtenida en el diseño de una terapia tolerogénica en un modelo animal de alergia alimentaria.  Evaluar las características secuenciales y estructurales de los alergenos de soja estudiados y elaborar un modelo o estrategia computacional que permita predecir epitopes de reactividad cruzada con leche bovina.  Obtener un péptido candidato para el potencial desarrollo de una terapia tolerogénica para el tratamiento de alergias alimentarias.

Los mosquitos Aedes aegypti, vector de fiebre amarilla, dengue, Zika y chikungunya, y Anopheles pseudopunctipennis, uno de los principales vectores de malaria en América, se crían en ambientes muy distintos. Ae. aegypti se cría en recipientes artificiales cercanos al domicilio y peridomicilio mientras que An. pseudopunctipennis se cría en márgenes de arroyos de montaña. Estas diferencias pueden tener implicancias importantes en las metodologías de control de estos mosquitos. Además, la información sobre An. pseudopunctipennis es muy escasa debido a la dificultad de criarlo en laboratorio. Por lo tanto, el objetivo general de este trabajo de tesis consistió en caracterizar el comportamiento de An. pseudopunctipennis y Ae. aegypti frente a estímulos naturales y sintéticos, con el fin de generar resultados aplicables a un plan de manejo integrado de vectores. Para ello se realizaron tres abordajes: se estudió el efecto de moduladores del comportamiento y agentes ecológicos en larvas de Ae. aegypti y An. pseudopunctipennis (Capítulo 2). Se caracterizó la respuesta toxicológica y comportamental de larvas de ambas especies frente a cuatro clases de larvicidas (Capítulo 3). Y se evaluó el efecto repelente del aceite esencial de E. nitens en adultos de las especies mencionadas (Capítulo 4). Con respecto al primer abordaje, se determinó una gran riqueza de predadores en los sitios de cría de An. pseudopunctipennis, y los principales candidatos a evaluar en futuros trabajos fueron las larvas de Tropisternus noa, las larvas de Libellulidae, los adultos de Liodessus sp., Microvelia sp. y las larvas de Toxorhynchites sp. También se observó que los compuestos repelentes (DEET e IR3535) aumentaron la actividad de nado de larvas de ambas especies estudiadas pero los cebos atractantes (prolina y levadura) solo disminuyeron la actividad de nado en larvas de Ae. aegypti. Además, se determinaron por primera vez los parámetros toxicológicos de los larvicidas temefós, permetrina, Bti y el aceite esencial de E. nitens en larvas de An. pseudopunctipennis, que resultaron más tolerantes a estos larvicidas que Ae. aegypti. En ambas especies se registró una disminución en la actividad de nado en las larvas expuestas a temefós y permetrina. En cambio, esta disminución solo se observó en las larvas de Ae. aegypti expuestas al formulado de Bti y al aceite esencial de E. nitens, pero no en las larvas de An. pseudopunctipennis. Finalmente, se registró el efecto repelente de la DEET y el aceite esencial de E. nitens en hembras de Ae. aegypti y An. pseudopunctipennis utilizando el método de repelencia en placa. Además, el aceite de E. nitens generó un aumento de la actividad locomotora en hembras de Ae. aegypti. Finalmente, el aceite esencial de E. nitens presentó un alto tiempo de protección total, comparable con el de la DEET, frente a hembras de Ae. aegypti. Los resultados de esta tesis aportan información valiosa para ser utilizada en los programas de control de los mosquitos estudiados, y es el primer estudio detallado sobre los comportamientos de las larvas y adultos de An. pseudopunctipennis.

Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Lugar de Trabajo: Instituto de Histología y Embriología de Mendoza, "Dr. Mario Burgod". CONICET. Universidad Nacional de Córdoba. 2014 - 144 h. + CD con Plan de Tesis. tabls.; figus.; grafs. Contiene Referencia Bibliográfica + Publicaciones Derivadas de la Tesis. Abstract en español e inglés.

La habilidad de un patógeno para interaccionar con su hospedador determina en gran medida su persistencia o éxito evolutivo. Dado que ni la inmunización ni la infección natural proveen inmunidad a largo plazo contra B. pertussis, y que la vacunación no evita la circulación de este patógeno, resulta evidente que B. pertussis es extraordinariamente exitosa en cuanto a su capacidad de supervivencia en el ambiente hostil del hospedador. Los datos epidemiológicos ponen de manifiesto que las vacunas en uso deben ser optimizadas con el fin de controlar la circulación de este patógeno en la población. Para lograr esto es fundamental comprender los mecanismos de patogénesis, definir los factores de virulencia involucrados en la colonización y, en particular, identificar nuevos antígenos protectores, no incluidos aún en las formulaciones vacunales, que impliquen una mejora sustancial en la protección brindada por la vacunación. El trabajo que se presenta a continuación intenta avanzar en el estudio del fenotipo infectante de B. pertussis. En resumen, los estudios realizados para definir la relevancia de los factores de virulencia regulados por el sistema Bvg en la interacción patógenocélulas epiteliales respiratorias del hospedador se presentan en el Capítulo 2. En el Capítulo 3 se evaluó la interacción entre factores de virulencia con distinto patrón de expresión durante la modulación de fase y su importancia en la interacción patógenocélulas epiteliales respiratorias. En el Capítulo 4 se evaluó el rol de la adaptación fenotípica de B. pertussis a las condiciones fisiológicas de limitación de hierro en la interacción con células epiteliales respiratorias. En el Capítulo 5 se aborda la caracterización del fenotipo inducido por limitación de hierro y su inmunogenicidad, mediante el análisis comparativo del proteoma de B. pertussis y el análisis serológico de las proteínas presentes exclusivamente en este fenotipo con el fin de seleccionar inmunógenos expresados in vivo con potencialidad para constituirse en componentes vacunales. En el Capítulo 6 se resumen las conclusiones generales de este trabajo.

La tos convulsa, causada por la bacteria Bordetella pertussis, constituye una problemática de salud a nivel mundial a pesar de la elevada cobertura de vacunación. Las mejoras en las estrategias preventivas contra B. pertussis dependen en gran medida del esclarecimiento de los mecanismos que contribuyen a la persistencia de la bacteria en el huésped. Entre ellos, se ha propuesto como un mecanismo relevante el establecimiento de un nicho de sobrevida intracelular de B. pertussis en células del hospedador. El objetivo de la presente Tesis fue estudiar esta interacción e identificar factores bacterianos involucrados en dicho proceso. En primer lugar, se analizaron los cambios que ocurren en el proteoma de B. pertussis durante su adaptación al ambiente encontrado dentro de las células del hospedador. Posteriormente, se seleccionó un grupo de factores bacterianos identificados en el estudio proteómico, potencialmente involucrados en el establecimiento de nichos intracelulares, para continuar su caracterización. Estos factores fueron seleccionados por su posible rol en la captura de nutrientes y/o su eventual relevancia en la adaptación a las condiciones de estrés encontradas por B. pertussis en el estadio intracelular.

Los objetivos del presente trabajo han sido delineados para avanzar en el conocimiento de base de los plásmidos presentes en aislamientos recuperados de un biofiltro enriquecido con pesticidas, para conocer la relación de los mismos con los presentes en otras bacterias y otros ambientes, y para obtener nueva evidencia molecular que ayude a comprender de modo más acabado el peso de la transferencia horizontal de plásmidos en la dinámica de transferencia de ADN y en la adaptación/tolerancia de las bacterias presentes en dicho ambiente. Asimismo esperamos contribuir en el desarrollo de herramientas que permitan avanzar en la captura de plásmidos y estudio. Objetivo general Caracterización molecular y funcional de plásmidos aislados de un biofiltro utilizado para la decontaminación de pesticidas. Objetivos específicos En el marco del objetivo general expuesto, en la presente Tesis Doctoral se establecen los siguientes objetivos específicos: - Obtención de una colección de bacterias portadoras de plásmidos de alto peso molecular. Caracterización de dichos aislamientos. - Purificación y secuenciamiento del conjunto de plásmidos de la colección bacteriana. Análisis bioinformático del contenido plasmídico. - Búsqueda, identificación, clonado, expresión y caracterización de actividades con potencial interés industrial. - Diseño, construcción y validación de una nueva herramienta para la captura de plásmidos de muestras ambientales y cultivos puros.

Se han estudiado en detalle, por primera vez, los eventos moleculares más importantes responsables de la histolisis de tejidos larvales durante la transición larva-adulto de dípteros. Se han descrípto, por primera vez en los insectos, proteinasas lisosomales específicas de la histolisis y se ha correlacionado su actividad con la de otras enzimas degradativas y con las imágenes de cambios anatómicos degenerativos en músculos y cuerpo graso. Los principales resultados obtenidos son: l. Se aisló una nueva aspartil-proteínasa de 43.000 daltons, específica de la histolisis, denominada EMAP (Early metamorphosis aspartyl proteinase), con características bioquímicas similares al grupo de las Catepsinas tipo D y cuya secuencia amino terminal no presentó homología con este grupo. Usando la secuencia correspondiente al N- terminal se obtuvo un transcripto que fue clonado y secuenciado. La secuencia obtenida mostró homología del 59% con catepsina D de porcino, 51% con una proteinasa aspártica de mosquito y 60% con una proteinasa aspártica de arroz. 2. Se aislaron dos nuevas cisteín proteínasas lisosomales denominadas MCP I y MCPII (metamorphosis cystein proteinase), de 32.000 y 67.000 daltons respectivamente. Ambas enzimas fueron caracterizadas bioquímicamente y sus extremos amino terminales secuenciados. MCP I mostró características bioquímicas similares y alta homología N-terminal con las Catepsinas B de mamíferos (55.5%) y con una cisteín proteinasa de la mosca Sarcophaga (44%). MCP II es una endoproteinasa de nuevo tipo, cuyo N-terminal no presentó homología con ninguna cisteín proteinasa conocida en invenebrados, ni tampoco en vertebrados. 3. El perfil de actividad de las nuevas endopeptidasas coincidió con el de fosfatasa ácida, β-glucosidasa y β-galactosidasa lisosomales y correlacionó estrechamente con un marcado descenso en el contenido de proteínas registrado durante las etapas tempranas de la metamorfosis. El incremento en la actividad de enzimas lisosomales coincidió temporalmente (entre 20³º y 48 h desde la inmovilización definitiva de la larva) con la aparición de los primeros signos de muerte celular en los músculos y el cuerpo graso. 4. Es la primera vez que se describe en insectos el progreso temporal de la histolisis del cuerpo graso larval. Se determinó que la degradación de éste es un proceso gradual, que se inicia a las 20³ºh cuando las células que forman una red se separan unas de otras y finaliza alrededor de las 120 h cuando gran parte de las mismas se han fragmentado. Se determinó que los músculos esqueléticos correspondientes a los segmentos anteriores (l a 5) se fragmentan a partir de las 22 h, mientras que los correspondientes a la región abdominal, lo hacen recién a partir de las 72 h. 5. Se encontró una estrecha correlación entre la degradación del cuerpo graso larval y la depleción en el contenido de las principales moléculas de reserva. Cortes histológicos de cuerpo graso teñidos por PAS demostraron la completa desaparición del glucógeno en horarios posteriores a las 20³º h. El glucógeno fue consumido principalmente durante la etapa de salto y dispersión de la larva, mientras que el remanente (14% del contenido original, de acuerdo a dosaje directo) se consumió durante las primeras 20³ºh después de iniciada la metamorfosis. Los lípidos se consumieron principalmente a partir del estadio pupal (40 h), confirmando las imagenes histológicas obtenidas, donde se registró la disminución en el número y tamaño de las vesículas de grasa a partir de este horario Los resultados alcanzados han permitido obtener un panorama integral de la progresión de eventos degradativos durante la transición larva-adulto y mostraron por primera vez, que con muy pequeñas variantes, los eventos de la metamorfosis tienen idéntica duración relativa y representan etapas equivalentes del ciclo de vida en todos los insectos dípteros.

Dado que la transcripción en Tripanosomátidos es policistrónica, la regulación de la expresión génica en estos organismos se da principalmente a nivel post-transcripcional mediante proteínas de unión a ARN. Nuestra proteína de estudio, TbRRM1, presenta tres dominios RRM de unión a ARN y forma parte del grupo de proteínas SR-relacionadas. Previamente, se ha demostrado en nuestro laboratorio que TbRRM1 es esencial para la sobrevida en el estadio procíclico de Trypanosoma brucei ya que su silenciamiento por ARNi afecta la curva de crecimiento y produce morfologías aberrantes. En este trabajo, se propuso caracterizar a la proteína de unión a ARN TbRRM1 y estudiarla como posible blanco terapéutico para el tratamiento de las Tripanosomiasis. Para ello, se generó un sistema estable para el silenciamiento inducible de TbRRM1 en el estadio sanguíneo de T. brucei. Los resultados demostraron que, al igual que en el estadio procíclico, TbRRM1 resultaesencial en el estadio del mamífero ya que su silenciamiento produce unadisminución en la curva de crecimiento. Además, se demostró que la muerte de los parásitos se produce por un mecanismo compatible con apoptosis en ambos estadios de T. brucei. Los estudios de la cuantificación de núcleos y kinetoplastos en ambos estadios junto con el análisis del ciclo celular por marcación con ioduro de propidio y citometría de flujo demostraron queTbRRM1 es necesaria para la progresión normal del ciclo celular. Además, el silenciamiento de TbRRM1 en el estadio sanguíneo produjo la aparición de parásitos con flagelo desprendido y de células conectadas por su extremo posterior, lo que indica que TbRRM1 es necesaria para la correcta citoquinesis. Por otra parte, se evaluaron los efectos de la sobreexpresión de TbRRM1 en el estadio procíclico y se determinó que la elevada sobreexpresión de la proteína produce un fenotipo letal similar al observado luego del silenciamiento de TbRRM1.Mediante los ensayos llevados a cabo en esta Tesis Doctoral, se caracterizó a la proteína de unión a ARN TbRRM1 demostrando que es esencial para la sobrevida en ambos estadios de T. brucei. Además, dado que TbRRM1 es esencial para el parásito y que no posee ortólogos en humanos, puede ser considerada un blanco potencial para el desarrollo de drogas que permitan mejorar la calidad de vida de pacientes que padecen enfermedades causadas por Tripanosomátidos

α-sinucleína (AS) es una proteína expresada mayormente en cerebro y su función está asociada a la dinámica de vesículas sinápticas en neuronas dopaminérgicas. Su agregación anómala amiloide está vinculada con numerosas patologías neurodegenerativas como por ejemplo la enfermedad de Parkinson. A pesar de los grandes avances realizados, aún se desconocen cuáles son los mecanismos patogénicos asociados a estas enfermedades. Los oligómeros amiloides pre-fibrilares son señalados como las especies más neurotóxicas. Al respecto, la hipótesis mayormente aceptada sugiere una ganancia de toxicidad de AS cuando se encuentra en estado oligomérico. Sin embargo, una pérdida de la función de la proteína al autoensamblarse en estos agregados podría también contribuir a la disfunción celular. En esta tesis se dirigieron los esfuerzos en estos dos sentidos, por un lado, aportando información estructural de las especies oligoméricas para comprender las bases moleculares de su toxicidad y por el otro, evaluando el impacto de la oligomerización en las propiedades de unión a membranas lipídicas, claves para la función de la proteína. Utilizando técnicas espectroscópicas se logró obtener información sobre el arreglo supramolecular de una población de especies oligoméricas de AS. Este ensamble resultó estar formado por agregados estructurados, ricos en estructura hoja-β antiparalela que poseen un patrón bien definido de interacciones intermoleculares. Se demostró que esta estructura distintiva también está presente en especies que se pueblan a lo largo del proceso de agregación amiloide, evidenciando además que este proceso involucra un marcado rearreglo conformacional de la proteína. A su vez, se midió cuantitativamente la unión de AS en su estado monomérico y oligomérico a membranas de distinta composición y curvatura. Se evidenció que la oligomerización de la proteína influye marcadamente en su interacción con membranas, cambiando su sensibilidad a curvatura y alterando su afinidad, llegando en algunos casos a abolir su asociación completamente. La información estructural obtenida en este trabajo, junto con el estudio de unión a biomembranas, constituyen un avance clave para la comprensión de la toxicidad y pérdida de la función de AS asociada a las patologías neurodegenerativas.

El antígeno B (EgAgB) es una lipoproteína presente en la larva del parásito cestodo Echinococcus granulosus, agente causante de la zoonosis conocida como hidatidosis, enfermedad endémica en nuestra región. Esta proteína pertenece a una familia de proteínas exclusivas de cestodos que unen ligandos hidrofóbicos, conocidas como HLBPs. A nivel proteico, el EgAgB está formado por subunidades de ~8 kDa codificadas por genes polimórficos pertenecientes a 5 subfamilias distintas (EgAgB8/1 a EgAgB8/5); mientras que su componente lipídico está formado por una amplia variedad de lípidos, incluyendo lípidos neutros y polares. El hecho de que muchos de estos lípidos no pueden ser sintetizados de novo por el parásito hace suponer que el EgAgB podría estar involucrado en la adquisición de estos compuestos desde el hospedador, como ha sido propuesto para otras HLBPs. Esto implicaría que el EgAgB interactué con componentes del hospedador para adquirir estos ligandos. En este sentido, existe evidencia de que el EgAgB es capaz de interactuar con células del sistema inmune, modulando su respuesta, lo que a su vez favorecería el establecimiento y permanencia del parásito. Sin embargo, para poder comprender los mecanismos asociados a esta modulación a nivel molecular y determinar si la proteína es capaz de transportar e intercambiar los lípidos, es imprescindible avanzar en el conocimiento estructural y funcional de esta partícula compleja. Con este fin, durante el desarrollo de este trabajo se purificaron las subunidades recombinantes EgAgB8/1, EgAgB8/2 y EgAgB8/3, logrando obtenerlas de forma libre de lípidos. Se logró determinar que estas subunidades son capaces de interaccionar consigo mismas aún en ausencia de lípidos, formando oligómeros de entre 40 y 60 kDa, distintos a los que se han reportado previamente en la literatura en presencia de los ligandos. Por otro lado, se analizó la capacidad de distintos ligandos lipídicos de unirse a estas subunidades y se pudieron determinar constantes de disociación en el orden submicromolar empleando antroiloxi-derivados de ácidos grasos. Más aún, se evaluó la capacidad de las subunidades EgAgB8/2 y EgAgB8/3 de transferir estos derivados hacia membranas fosfolipídicas modelo. Utilizando distintos tipos de vesículas se pudo establecer que ambas subunidades son potencialmente capaces de transferir los ácidos grasos. En el caso de las subunidad EgAgB8/2, la transferencia ocurriría por un mecanismo que involucra un contacto directo con la membrana, mientras que en el caso de EgAgB8/3 la cinética de la transferencia estaría determinada por la disociación del complejo proteína-ligando. Asimismo, para ambas proteínas se pudo determinar que las interacciones electroestáticas tienen importancia en el mecanismo, dado que la transferencia se ve favorecida en el caso de vesículas con mayor carga neta negativa, como ocurre en el caso de vesículas ricas en cardiolipina. Por otro lado, con el fin de evaluar la capacidad de las subunidades libres de lípidos de interactuar con células del sistema inmune, particularmente con monocitos y macrófagos, se encontró que las subunidades EgAgB8/1 y EgAgB8/3 libres de lípidos son reconocidas por estas células, mientras que la subunidad EgAgB8/2 no presenta unión a los monocitos y es pobremente reconocida por los macrófagos. Asimismo, se pudo determinar que la fosfatidilcolina que estaría expuesta en la partícula nativa de EgAgB participaría en la unión, posiblemente modificando la forma en que se exponen las subunidades de EgAgB para que sean reconocidas por las células. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la partícula de EgAgB puede ser reconocida por células del sistema inmune a través de algunas de sus subunidades y el hecho de que en proximidad de una membrana fosfolipídica algunas subunidades pueden ser capaces de transferir sus ligandos, apoya la idea de que EgAgB pueda intercambiar lípidos interaccionando con células del hospedador.