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La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasa autocatalítica descripta inicialmente en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.). Se había propuesto que la UPTG era capaz de iniciar la síntesis de α-glucanos unidos a proteína in vitro y que tendría una función de proteína iniciadora de la biosíntesis del almidón. La UPTG de tubérculo de papa se purificó hasta aparente homogeneidad, se desarrollaron anticuerpos policlonales específicos contra la misma y se clonaron cADNs correspondientes a la UPTG por screening de genotecas de expresión de papa. Ensayos de Northern blot y Western blot mostraron que tanto el ARN mensajero como la proteína UPTG están presentes en un nivel semejante en todos los tejidos de la planta. Algunas de las secuencias clonadas se expresaron en E. coli obteniéndose UPTG recombinante enzimáticamente activa. Se encontró que tanto las proteínas recombinantes como la purificada de tubérculo pueden ser glicosiladas a partir de UDP-Glc, UDP-Xil o UDP-Gal y que la glicosilación es reversible. Dos cADNs obtenidos fueron secuenciados totalmente, esto permitió detectar un muy alto grado de identidad (~ 90%) entre la secuencia de la UPTG y varias secuencias de proteínas vegetales de función aún no determinada que localizan específicamente en la región trans del aparato de Golgi. La secuencia de la UPTG no presenta zonas hidrofóbicas que puedan corresponder a regiones transmembrana ni un posible péptido señal que permita su entrada a plástidos o al sistema de endomembranas de la célula. Estos resultados sugieren que la enzima localizaría en el lado citoplásmico del aparato de Golgi y no en los plástidos en donde ocurre la síntesis del almidón, por lo tanto están en contra de un posible rol de la UPTG en la síntesis de este polisacárido. En ningún organismo que no sea vegetal se encontró una proteína que pueda considerarse homóloga a la UPTG. Esta característica, sumada a su localización indicarían una posible función relacionada con la síntesis de los polisacáridos complejos de la pared, función exclusiva del aparato de Golgi de las células vegetales. La especificidad de la UPTG por distintos nucleótidos azúcares y la reversibilidad de la reacción de glicosilación hacen pensar que la UPTG podría estar formando parte de un sistema complejo que acople el transporte de nucleótidos azúcares con la síntesis de polisacáridos estructurales.

El presente trabajo tuvo como objetivo estudiar el rol de la proteina espermática humana proacrosina/acrosina como molécula de adhesión a las glicoproteínas de la zona pellucída (ZP). En una primera etapa, se llevó a cabo un análisis bioinformático sobre la secuencia aminoacídica de proacrosina con el propósito de identificar sitios potenciales de unión a glicoproteínas de la ZP. El resultado de este análisis reveló que los residuos Lys74. Lys169, Arg172, Arg199, Arg249, Lys251, Arg252 y la secuencia KRLQQKLIE, localizada entre los residuos 367-374, conformarían sitios potenciales de unión a la ZP. A continuación se realizaron experimentos para evaluar la interacción entre proacrosina/acrosina con glicoproteínas de la ZP. Para ello se desarrolló una estrategia de subclonado del ADNc de proacrosina humana en vectores de expresión procariotas (pET-22b, pGEX-3X) para la expresión de proacrosina recombinante. Utilizando el sistema de expresión en forma directa (pET-22b) se obtuvo un producto de expresión recombinante correspondiente a la proenzima (Rec-40), y productos truncados del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, Rec-20, Rec-10). Estas proteinas fueron caracterizadas mediante la utilización de anticuerpos especificos y análisis de secuenciación de aminoácidos, determinándose que Rec-30 correspondería a los residuos 1-300, Rec-20 a 1-190 y Rec-10 a 1-160 de proacrosina humana. Utilizando el mismo sistema de expresión se sintetizó un producto de expresión correspondiente a los residuos 1-59 de proacrosina (Rec-6). Los productos de expresión, obtenidos como cuerpos de inclusión, fueron solubilizados y aislados mediante electroforesis preparativa. El estudio de la interacción entre proacrosina/acrosina recombinante y las glicoproteínas de la ZP se llevó a cabo utilizando ensayos de unión en fase sólida ("Ligand blot", "Dot blot", ensayo en placa de poliestireno). Se utilizaron glicoproteínas obtenidas de ovocitos humanos de descarte de programas de fecundación in vitro, así como glicoproteínas obtenidas por expresión en células CHO a partir del ADNc (rec-hZPA, rec-hZPB, rec-hZPC). El resultado de estos estudios indicó que proacrosina recombinante (Rec-40) y fragmentos del extremo N-terminal de la proteína (Rec-30, 20 y 10) tienen capacidad de unión a glicoproteínas de la ZP y a azúcares. Las glicoproteínas de la ZP mostraron diferente capacidad de unión a proacrosina/acrosina, siendo hZPA el ligando principal. El mecanismo de unión involucraría interacciones electrostáticas entre aminoácidos cargados positivamente en proacrosina/acrosina, y oligosacáridos sulfatados en la ZP, así como el reconocimiento de residuos de fucosa y manosa presentes en los oligosacáridos de la ZP. El resultado del mapeo de los sitios de unión en la molécula de proacrosina permite proponer que éstos estarían localizados en dos regiones de la proteína. Una región estaría comprendida entre los residuos 59-160 (Dominio II), y otra entre los residuos 300-402 (Dominio III). Los sitios de unión localizados en el Dominio II de la proteina estarían estabilizados por uniones no covalentes y puentes disulfuro, mientras que los sitios localizados en el Domino II estarían estabilizados por interacciones no covalentes, y tendrían una contribución principal a la afinidad de la interacción. En dichas regiones, los residuos Lys74, Lys108, Lys114 y el motivo KRLQQKLIE (residuos 367-374), identificados mediante el análisis de secuencias, participarían en la interacción con glicoproteinas de la ZP y azúcares. En resumen, este trabajo muestra que proacrosina/acrosina humana presenta La capacidad de reconocer glicoproteinas de la ZP. de manera independiente de la actividad de proteasa. Esto permite proponer que proacrosina/acrosina participaría como molécula de adhesión en la unión secundaria del espermatozoide a la ZP en el humano.

La capacidad de respuesta de una planta ante los cambios ambientales circundantes asegura su supervivencia. Los mecanismos de respuesta a estres biótico y abiótico están regulados por vías que dependen de la activación de genes en la cual una red de transducción de señales abarca desde la percepción de las señales hasta la expresión de genes de respuesta permitiendo la adaptación de la planta a su entorno, debiendo para ello integrar las señales externas e internas. Las nucleosido di fosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que transfieren el fosfato γ de nucleósidos tri fosfatos (NTPs) a nucleósidos di fosfatos (NDPs) a través de un intermediario fosforilado en una histidina conservada, participando de la red de comunicación energética intracelular y pudiendo alterar el pool de NTPs. En plantas se han visto recientemente involucradas en varias cascadas de señalización. El objetivo general del trabajo es caracterizar las isoformas de NDPK en plantas de papa (S. tuberosum, var. Spunta) y estudiar su participación en la percepción de señales ambientales, analizando su expresión en respuesta a señales de estrés biótico y abiótico. La hipótesis planteada es que, dado que en toda situación de estrés subyace un compromiso energético y considerando que las NDPKs poseen actividad de fosfo-transferasa, éstas podrían estar involucradas en las respuestas a estímulos ambientales. A partir de los EST correspondientes a isoformas de NDPKs (STMED71, STMHY37) detectados en los microarreglos TIGR 10K de ARNm de brotes de papa cultivados en luz/oscuridad, se clonó de la secuencia codificante completa de StNDPK1 (GB FJ743686) a partir de brotes de papa y se sub-clonó un fragmento de la secuencia codificante de StNDPK2 (GB JF832386) a partir de una biblioteca de estolones. Se comparó la expresión de ambas en los distintos tejidos vegetativos y reproductivos de la planta y en tres estadios de tuberización por RT-PCR semi cuantitativa. StNDPK1 se expresa con distintos niveles de ARNm tanto en los tejidos como en los estadios de tuberización, mientras que StNDPK2 se expresaría en algún estadio de estolón tuberizante que no se pudo determinar. El análisis in silico de la secuencia aminoacidica de StNDPK1 muestra que tiene 238 amino ácidos de longitud, un peso molecular aproximado de 26 kDa y un punto isoeléctrico de 9.24. Codificaría para una proteína mitocondrial, el péptido señal comprendería los primeros 56 aa y el PM de la proteína madura sería de aprox. 20 kDa. La proteína recombinante StNDPK1 marcada con seis histidinas (6xHis) en su N-terminal producida se analizó por Western blot. Un anticuerpo anti-His detectó una banda de 26 kDa, mientras que un anticuerpo anti-NDPK1 dirigido contra el extremo Cterminal de la proteína reveló la banda de 26 kDa y una banda de 18kDa que podría corresponder a la proteína madura. Se detectó actividad de NDPK en extractos crudos y fracciones mitocondriales de brotación tubérculos, pero no en fracciones de cloroplastos. Además, los ensayos de Western blot realizados con el anticuerpo específico antiNDPK1 detectó la enzima en la fracción mitocondrial. El análisis filogenético de la proteína muestra que StNDPK1 está directamente emparentada con NDPK de Spinacia olaracea (que localiza en cloroplastos) y que posee un ancestro común con las otras isoformas de NDPKs de localización mitocondrial (AtNDPK3, BrNDPKIII y PsNDPK3). Además se pudo clonar la secuencia genómica completa de Stndpk1 (GB GU144806) de 3358 nts, posee 7 exones y 6 intrones. El Southern Blot usando como sonda la secuencia codificante de StNDPK1 sugiere que este gen pertenece a una familia multigénica. Por otro lado, se obtuvo el promotor de éste gen de 2385 pb cuyo análisis in silico revela la presencia de elementos regulados por luz, frío, daño mecánico, respuesta a defensa y dos sitios reguladores de los niveles transcripcionales (CAATbox y 5UTR Py-rich stretch). Dado que se disponía de mayor información respecto de la estructura del gen y de los elementos regulatorios que contiene la isoforma 1 de StNDPK y considerando que ésta tenía un perfil de expresión menos complejo que la isoforma 2, se realizaron los estudios de expresión en condiciones de estrés abiótico y biótico sólo para la isoforma 1. Los resultados de las RT-PCR semi-cuantitativas muestran que el nivel de ARNm de StNDPK1 aumenta en la exposición de plantas a oscuridad por tiempos cortos, mientras que en la exposición a bajas temperaturas se produce una disminución inicial de la expresión para luego recuperar los niveles normales. Se observó que tanto en el tratamiento con daño mecánico como el agregado de AJ (10μM) producen un aumento del mensajero de StNDPK1. Por otro lado, se midió actividad de NDPK en extractos de proteínas nativas de fracciones mitocondriales y de cloroplastos; tanto el extracto crudo, como la fracción mitocondrial presentan actividad de NDPK, sin embargo en la fracción de cloroplastos no se detectó actividad alguna. El análisis bio-informático sugiere que las dos isoformas, son de localización sub-celular. Pero en particular, StNDPK1 fue detectada por Western blot en la fracción mitocondrial donde también se midió la actividad enzimática; por lo que StNDPK1 sería una isoforma que localiza en la mitocondria. Al menos dos isoformas de NDPK en plantas de papa muestran un patrón muy diferente de expresión, StNDPK1 tiene diferentes niveles de expresión en tejidos, pero su expresión es ubicua, mientras StNDPK2 muestra un patrón más restringido y sólo se expresa en ciertas etapas de estolones, lo que sugiere que posiblemente su expresión esté asociada a ciertas etapas del desarrollo del tubérculo. Nuestros resultados sugieren fuertemente que StNDPK1 está dirigida a la mitocondria. El análisis de los datos de Stndpk1 promotor es consistente con los resultados de la expresión, lo que sugiere que StNDPK1 podrían estar involucrados en las respuestas ambientales a la disponibilidad de luz, temperaturas bajas o ataque herbívoro.

La tesis se enmarca en la Etnobotánica urbana y fue desarrollada en un contexto pluricultural urbano, focalizando sobre un grupo de plantas y productos denominados adaptógenos El término adaptógeno, se comienza a utilizar a mediados del siglo XX cuando un grupo de científicos encontraron que ciertas especies vegetales ayudaban al hombre a sentirse bien, a combatir el estrés sin tener un efecto posterior de decaimiento y permitirle adaptarse a las condiciones ambientales adversas. Los mismos se usan para tratar desórdenes psiquiátricos, neurosis y depresión. Los objetivos que nos hemos propuesto realizar son: 1. Relevar los productos de origen vegetal comercializados como adaptógenos, presentes en la zona de estudio. 2. Relevar el conocimiento vigente entre los consumidores acerca de los productos y las plantas que intervienen en su composición. 3. Identificar las plantas que entran en la composición de dichos productos a través de las técnicas botánicas clásicas de identificación, o a través de la búsqueda de caracteres anátomo-sistemáticos diagnósticos. 4. Caracterizar las especies encontradas mediante la búsqueda e identificación de caracteres morfológicos de diagnóstico. 5. Recopilar información sobre plantas tradicionalmente usadas por determinadas comunidades en distintas zonas de Argentina como recursos terapéuticos con fines similares a los de los productos comercializados y relevados según los puntos anteriores. 6. Analizar la posible correlación existente entre la acción terapéutica popularmente atribuida a las plantas objeto de estudio y las propiedades biológicas reconocidas según la información científica provista por la bibliografía. 7. Aportar, como derivación de este estudio, conocimiento que pueda ser aplicado al control de calidad y al uso racional de las plantas medicinales en nuestro. Para cumplir con ellos, se aplicó la metodología etnobotánica, a través de la aplicación de entrevistas abiertas, semiestructuradas y encuestas efectuadas a una población (N= 226) conformada por personas de ambos sexos y amplio rango de edad, y a informantes clave (N= 40), orientadas a relevar el conocimiento botánico de las especies que dicha población consume para “sentirse bien”. El área de muestreo abarcó el Área Metropolitana de Buenos Aires (AMBA), que incluye dos conglomerados urbanos contiguos, el Gran Buenos Aires y el Gran La Plata; y es la más grande en población de la Argentina. Entre los resultados encontrados se identificaron 11 especies consideradas adaptógenas; se analizaron 35 productos y 16 materiales de referencia; se relevaron 56 categorías entre plantas y productos que usan y también fue posible caracterizar el conocimiento botánico que tiene la población en estudio acerca de las plantas para “sentirse bien”. Las especies adaptogénicas estudiadas pertenecen a las familias Amaranthaceae, Araliaceae, Asteraceae (Compositae), Brassicaceae, Leguminosae (Fabaceae), Passifloraceae, Phytolaccaceae, Rubiaceae, Sapindaceae y Schisandraceae. Asimismo, se halló que entre los 35 productos analizados, los rótulos declaran especies vegetales que luego no se hallan presentes en el material analizado. También se identificaron nuevos caracteres diagnósticos que no habían sido descriptos anteriormente en la bibliografía consultada. Finalmente, se propone una nueva definición del concepto adaptógeno. Las conclusiones muestran que la gente elige variados productos naturales o hierbas medicinales. Entre esa extensa gama de productos, opta por aquellos para “sentirse bien”, ya sea por una costumbre familiar o por recibir la información proveniente de los medios de difusión, sin embargo desconoce el término adaptógeno.

El trigo es considerado actualmente el principal cultivo a escala mundial. Es una de las especies vegetales más consumidas del mundo junto con el arroz, el maíz y la papa. Una de las enfermedades que afecta a este cultivo es producida por Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechs. se la conoce como “mancha amarilla” considerada internacionalmente como la enfermedad del trigo que más se relaciona con las prácticas de laboreo que dejan los restos culturales en la superficie del suelo.El objetivo de este trabajo fue aportar información acerca del patosistema Triticum aestivum - P. tritici-repentis, en cuanto a conocer la composición de aislamientos del patógeno asociados a cultivos de trigo locales, su caracterización morfobiométrica y bioquímica, su variabilidad patogénica y la respuesta de cultivares frente a la infección del hongo. En este estudio se generó una colección de 155 aislamientos nativos de Pyrenophora triticirepentis, los cuales fueron caracterizados morfoculturalmente en 44 morfotipos los que se agruparon en ocho grupos a una distancia de similitud del 50%. Para evaluar el espectro de virulencia del total de los aislamientos se realizaron dos pruebas de patogenicidad una en el año 2003 y una en el 2004 sobre cultivares nacionales y extranjeros, determinándose especialización fisiológica para 19 y 33 aislamientos respectivamente. Por otra parte se llevaron a cabo estudios con marcadores de tipo isoenzimáticos, se revelaron el total de los aislamientos bajo el sistema de estearasas, fosfatasas y peroxidasas. Para el primero de ellos se observaron dos alelos con cinco variantes cada uno y para los otros dos un alelo con cinco y cuatro variantes respectivamente. Del análisis de los genotipos se obtuvieron 12 grupos para una distancia genética del 50%. En ninguno de los estudios se observó correlación entre el comportamiento propio de cada aislamiento y el origen geográfico o de cultivar. Tampoco se observó asociación entre los diferentes caracteres evaluados. Si se observó que 31 grupos de aislamientos a pesar de ser de origen diferente se comportaron de manera similar independientemente del estudio realizado.

La Fusariosis de la espiga de trigo o Fusarium Head Blight en trigo es una enfermedad severa a nivel mundial, en Argentina al menos 20 epidemias de variable intensidad se han registrado en los últimos 50 años. Fusarium graminearum sensu stricto es el principal agente etiológico de la enfermedad para esta región. Como resultado de la infección, los granos de trigo ven modificada tanto su composición química como sus propiedades físicas con la consiguiente alteración de características de calidad en los productos de panificación. Los daños ocasionados por la infección se agravan por la presencia de micotoxinas, las cuales son perjudiciales tanto para la salud humana como animal. La constitución física de los granos se relaciona con su textura y dureza, y su composición química, define el valor nutricional y las propiedades tecnológicas de las harinas. Los mercados son cada vez más exigentes y se interesan por el contenido de proteínas, aminoácidos, almidón, aceites, lípidos y demás componentes, y paulatinamente se reduce la tolerancia a sustancias contaminantes y/o micotoxinas. Dentro de los principales criterios para la determinación de la calidad de los granos se encuentran: el contenido y constitución de las proteínas, variables de rendimiento como ser la pérdida de peso en los granos por espiga y el peso de mil granos, y presencia de micotoxinas. La calidad el gluten de las harinas de trigo depende de la constitución genética de la planta así como de diversos factores ambientales e interacciones con microorganismos. La variación alélica en las fracciones de gluteninas de alto peso molecular (HMW-GS) está directamente relacionada con las propiedades físicas de la masa elaborada a partir de estas harinas. La micotoxina deoxinivalenol (DON) es la que se relaciona en primer término con la enfermedad, por lo cual se la considera una toxina indicadora de infección. Esta Tesis Doctoral aporta conocimientos relacionados con la diversidad genética de la especie Fusarium graminearum y el daño producido en granos de trigo, en cuanto a cambios composicionales y presencia de toxinas, en relación a cambios de calidad.

La presencia de Mn en aguas subterráneas para consumo humano causa problemas de orden estético y de aceptabilidad, organolépticos, operativos y sanitarios. Los métodos empleados para la remoción de Mn en el agua subterránea se pueden clasificar en: fisico-químicos y biológicos. En estos últimos, el Mn contenido en el agua es oxidado y precipitado con la ayuda de bacterias ambientales que suelen aparecer en forma natural en las aguas subterráneas que contienen Mn. Sin embargo, en estos procesos se alcanza una óptima remoción de Mn únicamente cuando los sistemas contienen comunidades bacteriana apropiadas, es decir, bacterias oxidantes de Mn y formadoras de biofilm.En este trabajo, se evaluaron los microbiomas de dos plantas de tratamiento biológico de aguas subterráneas que actualmente eliminan Mn(II) con alta eficiencia. Por otro lado, se cultivó un gran número de MOB conocidos y varios aislamientos que nunca antes se habían informado como MOB. La cepa MOB-181 del género Pseudomonas, se destacó de las demás por mostrar características de interés. La misma estuvo presente en el sistema de filtración de LT representando alrededor del 4 % del total de las Pseudomonas y pudo cultivarse con facilidad en el laboratorio. Asimismo, demostró buena capacidad de oxidación de Mn(II) en diferentes medios de crecimiento analizados; a diferentes temperaturas; y en presencia de metales inhibidores como el Fe y el propio Mn en altas concentraciones. Resultó ser una excelente formadora de biofilms y pudo oxidar Mn(II) presente en agua cruda mientras estuvo inmovilizada sobre arena. El estudio del rendimiento de la oxidación de Mn(II) de diferentes MOB aisladas en este trabajo permitió postular a MOB-181 como el mejor candidato con potencial para el desarrollo de un inóculo bacteriano aplicable para mejorar el proceso de eliminación de Mn(II) de aguas subterráneas.La oxidación de Mn y la formación de biofilms son dos características deseables para la elección de cepas con potencial uso en los procesos de remoción de Mn de aguas. A fin de determinar si estos dos procesos están relacionados en las MOB, se aplicaron ensayos de morfología de macrocolonia en agar y crioseccionamiento/microscopía para tratar de comprender la oxidación de Mn y la producción de EPS in situ en el modelo de biofilm de macrocolonia. Mediante el simple modelo de biofilm de macrocolonia, se pudo visualizar a los biofilms como sistemas biológicos complejos, donde los distintos grupos celulares están influenciados por un montón de factores, resultando en grupos de células diferentes dependiendo del entorno en el cual se encuentran.Finalmente, se construyó un sistema de filtros a escala laboratorio donde se evaluó la funcionalidad de la inoculación de filtros con MOB-181 en la remoción de Mn del agua. Se demostró que un ensayo de bioaumentación con esta bacteria fue capaz de acelerar el inicio de la remoción de Mn en aguas naturales. Asimismo, se observó que los tiempos requeridos para alcanzar la fase estacionaria de la remocion estaban fuertemente influenciados por las temperaturas, alcanzando más rapido la mayor eficiencia a temperaturas más altas. Estos resultados se utilizarán para optimizar los procesos de remoción de Mn de aguas y para el diseño de mejores tecnologías.

La exposición a contaminantes ambientales conocidos como perturbadores endocrinos altera el desarrollo y función del sistema endocrino afectando a diversas especies. Ciertos perturbadores endocrinos imitan las acciones de estrógenos y se denominan xenoestrógenos. En nuestro trabajo estudiamos los xenoestrógenos, bisfenol A, endosulfán y atrazina. Para el monitoreo de la contaminación ambiental y la evaluación de los efectos de los contaminantes, es importante una adecuada selección de especies centinelas y biomarcadores. El Caiman latirostris (yacaré overo) se encuentra ampliamente distribuido en el noroeste argentino y se utiliza en programas de rancheo. El yacaré posee características ecológicas y fisiológicas que lo convierten en potencial organismo centinela de exposición a xenoestrógenos. Dichas características permiten identificar y seleccionar posibles biomarcadores de exposición a contaminantes con actividad estrogénica. Los xenoestrógenos pueden alterar el desarrollo e histoarquitectura de gónadas, y los perfiles hormonales, aportando potenciales biomarcadores para evaluar en los yacarés. La vitelogenina es una proteína precursora sintetizada en hígado de vertebrados no mamíferos e inducida por acción de estrógenos. La detección de vitelogenina en plasma de yacarés macho podría se utilizada como una herramienta muy importante para el monitoreo de exposición a xenoestrógenos ambientales. Los biomarcadores evaluados en esta tesis resultaron herramientas útiles para determinar actividad estrogénica in vivo. Los estudios realizados permiten mejorar el conocimiento de la biología reproductiva del yacaré y caracterizar biomarcadores para monitorear exposición a xenoestrógenos en diferentes momentos de la vida de los caimanes. Las evidencias obtenidas apoyan la utilidad de Caiman latirostris como centinela de contaminación por xenoestrógenos.

La lignocelulosa es el componente mayoritario de la biomasa vegetal. Está formada por celulosa embebida en una matriz de hemicelulosa y lignina. Los microorganismos celulolíticos aerobios secretan un conjunto de enzimas que les permiten degradar los polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosas) para utilizarlos como fuente de carbono. Estas enzimas son ampliamente estudiadas y tienen gran importancia, particularmente por su potencial aplicación en el aprovechamiento de biomasa noalimenticia, como residuos agro-foresto industriales, principalmente para obtener biocombustibles o alimento animal. El aislamiento bacteriano Cellulomonas sp. B6, obtenido a partir de un consorcio celulolítico de suelo forestal, fue capaz de crecer en numerosos sustratos celulósicos, incluyendo biomasa. Los sobrenadantes de cultivo presentaron principalmente actividades endo y exoglucanasa y xilanasa y en los extractos intracelulares se detectaron actividades β-glucosidasa y β-xilosidasa. El crecimiento en biomasa lignocelulósica (residuo de cosecha de caña de azúcar, RAC) resultó en la mayor actividad enzimática en el sobrenadante (0,2 y 0,6 UI/ml para las actividades endoglucanasa y xilanasa, respectivamente). Estas actividades se mantuvieron en un rango de pH de 5 a 8 y de temperatura de 40 a 55°C, indicando la potencialidad del extracto para aplicaciones de degradación de biomasa en esas condiciones. Por zimografía, estas actividades se correlacionaron con proteínas presentes en el sobrenadante de cultivo. El genoma de Cellulomonas sp. B6 fue secuenciado por Illumina MiSeq y ensamblado en 279 contigs, resultando en una cobertura de 83X. El tamaño total del genoma se estimó en 4 Mb y el contenido de GC fue de 75,1%, similar a lo reportado para cepas de referencia del género. Por análisis filogénetico a partir de la secuencia de la subunidad 16S de ARN ribosomal, Cellulomonas sp. B6 se encuentra relacionado con las especies Cellulomonas flavigena y Cellulomonas persica, aunque presenta características genotípicas y metabólicas distintivas, lo que sugiere que podría tratarse de una nueva especie. Mediante anotación del genoma Cellulomonas sp. B6 por las plataformas NCBI y RAST, seguido de análisis por la plataforma dbCAN, se identificaron 3443 secuencias codificantes para proteínas, de las cuales 205 corresponden a enzimas activas sobre carbohidratos (CAZimas). De las CAZimas predichas, 91 son glicosil hidrolasas (GH), de las cuales 32 poseen secuencia codificante para péptido señal, lo que indica que podrían ser extra-celulares. Para identificar las proteínas responsables de la actividad enzimática previamente observada, se analizó por espectrometría de masas el secretoma completo (conjunto de proteínas extracelulares) en sobrenadantes de cultivo en celulosa (carboximetilcelulosa, CMC), residuo agrícola de caña de azúcar molido (RAC) o paja de trigo pretratada por extrusión (PTE), como únicas fuente de carbono. En el sobrenadante de cultivo en CMC se identificaron 2 exoglucanasas (GH6 and GH48) y tres xilanasas GH10, mientras que el crecimiento en biomasa (RAC o PTE) resultó en la identificación de 22 CAZimas, incluyendo endo- y exoglucanasas (2 GH6, 2 GH9 y 1 GH48), xilanasas (7 GH10 y 1 GH11), una xiloglucanasa (GH74), una arabinofuranosidasa/ β-xilosidasa (GH43), una β-glucosidasa (GH3) y una αglucuronidasa (GH62), entre otras. Adicionalmente, se identificó una oxígenasa lítica de polisacáridos (LPMO) AA10, potencialmente involucrada en la deconstrucción de celulosa cristalina por un mecanismo oxidativo. La diversidad de GH10 secretadas (todas las extracelulares codificadas en el genoma) remarca la importancia de estas enzimas en la deconstrucción de biomasa. Para comenzar a evaluar la contribución individual de las xilanasas de la familia GH10 a la actividad del extracto, una GH10 con un módulo de unión a sustrato CBM2, a la que denominamos GH10XynC, fue expresada de manera recombinante en Escherichia coli y purificada en forma soluble. La enzima recombinante presentó actividad endoxilanasa (EC 3.2.8.1) en el rango de 300 UI/mg, sobre xilano de abedul y sobre arabinoxilano. No presentó actividad sobre celulosa, confirmando que es una xilanasa libre de actividad celulolítica. Los productos de hidrólisis de xilano fueron xilobiosa (X2) y xilosa (X1) en menor proporción y la actividad fue óptima a 50ºC, en un rango de pH de 5 a 7,5. Ensayos de hidrólisis con GH10XynC de paja de cebada y de trigo y el marlo de maíz dulce (MMD) (pre-tratados por extrusión) resultaron en la conversión a xilooligosacáridos, X2 y X1, demostrando la habilidad de la enzima de actuar sobre el xilano contenido en la biomasa. En conjunto, estos resultados demuestran que Cellulomonas sp. B6 constituye una fuente de enzimas con potencial aplicación agro-industrial en el aprovechamiento de biomasa lignocelulósica. Es más, la enzima GH10XynC podría ser aplicada en la utilización de xilanos para las indutrias de biocombustibles, prebióticos y alimento animal.

Tesis presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencias Naturales