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Las partes verdes de la espiga (e.g. brácteas, aristas) son fuente de asimilados en cereales C₃. Sin embargo, la contribución de la fotosíntesis de la espiga en trigo pan (Triticum aestivum L.) es menos conocida que el resto de las fuentes de asimilados (v.g. fotosíntesis de la hoja bandera, retranslocados del tallo). En trigo es ampliamente aceptado que la limitación por fuente no está presente en cultivares antiguos (Kruk et al. 1997; Borrás et al. 2004). Sin embargo, en germoplasma moderno, la limitación por fuente podría estar emergiendo (e.g. Álvaro 2008a). En este contexto los asimilados fijados por los órganos verdes de la espiga (v.g. glumas y aristas) podrían ser más relevante para sostener el llenado de granos. Capítulo 2: El principal objetivo de este capítulo fue evaluar la contribución de la espiga mediante tres aproximaciones experimentales diferentes: (1) reduciendo la fotosíntesis de la espiga por remoción de las aristas o sombreo de las espigas (combinados con un tratamiento de desfoliado) y (2) comparando el peso de granos por espiga, en cultivos completamente sombreados versus plantas donde únicamente se les sombreó la parte vegetativa (‘espigas emergiendo’) y (3) reduciendo la fotosíntesis de la espiga con DCMU (3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea) un inhibidor específico del foositema II. En experimentos a campo en La Plata (Argentina), los cultivares Klein Escudo and BioInta 3000, fueron sujetos a los tratamientos de remoción de las aristas, sombreado de espigas, con y sin desfoliación, y a los tratamientos de ‘sombreo total’ vs. el de ‘espigas emergiendo’. Aunque la estimación de la contribución de la fotosíntesis de la espiga difirió, dependiendo de la aproximación experimental usada (desde 12 a 42%), el cv. Escudo (con mayor proporción de aristas) mostró una mayor contribución en la fotosíntesis de la espiga. En ambos cultivares la mayor contribución de la espiga se encontró en plantas desfoliadas. La magnitud de esta contribución se relacionó positivamente con el largo de las aristas de cada cultivar. La remoción de las aristas no tuvo un efecto significativo (p≤ 0.05) sobre el peso de grano en el cultivar de aristas cortas (BioInta 3000). El efecto del desaristado fue mayor en el cv. Escudo, alcanzando valores de reducción del peso de granos por espiga de ca. 15 y 19% en plantas no desfoliadas y desfoliadas respectivamente. En los dos cultivares, la posición de granos más afectada por la disminución de la fuente fotosintética fue la de los granos distales dentro de la espiguilla. La tasa fotosintética de la espiga (medida por IRGA) fue mayor en el cv Escudo que en el cv. BioInta 3000. También se analizó la contribución de la remobilización de los asimilados acumulados en pre-antesis (tallo + vainas). Comparando ambos cultivares, la materia seca translocada desde los tallos mostró el patrón opuesto a la contribución de la fotosíntesis de la espiga, i.e. fue mayor en el cv. BioInta 3000 que en el cv. Escudo. En Bordenave, Argentina, el sombreo de las espigas reveló una importante contribución de la fotosíntesis de la espiga al llenado de granos en el cv. Huenpan (un genotipo de aristas largas, y tolerante al déficit hídrico), tanto bajo condiciones de riego como de secano, mientras que en el cv. Baguette Premiun 11 (de aristas cortas) aparentemente no hubo efecto de la fotosíntesis de la espiga sobre el peso de granos. Por último, la reducción de la fotosíntesis de la espiga con DCMU redujo el peso de granos por espiga en proporción similar al sombreo de las espigas por ‘encapuchado’. Capítulo 3: El principal objetivo de este capítulo fue: (1) analizar si la mejora empírica ha cambiado la contribución de la fotosíntesis de la espiga al llenado de granos, a través de un estudio retrospectivo con cultivares de trigo pan liberados en Argentina entre 1920 y 2008, y (2) estudiar si la introgresión de los alelos de enanismo han cambiado la contribución de la fotosíntesis de la espiga al llenado de granos, usando líneas isogénicas de un cultivar de trigo pan difiriendo en la presencia/ausencia en los alelos Rht. En los dos experimentos se sombrearon espigas con papel aluminio para reducir la fotosíntesis, tanto en plantas intactas como desfoliadas. La contribución de la fotosíntesis de la espiga se incrementó en los cultivares modernos, y esta contribución fue mayor en las plantas desfoliadas que en las intactas. La contribución de la espiga se correlacionó negativamente con la altura de planta (r2= 0.62 y 0.71 en plantas intactas y desfoliadas respectivamente) y especialmente con el peso de tallo (r2= 0.75 y 0.80 en plantas intactas y desfoliadas respectivamente). La eficiencia de materia seca retranslocada (es decir, la relación entre la materia seca retranslocada y el peso de tallo en antesis; DMTe) no se modificó considerablemente con el año de liberación de los cultivares. La contribución de asimilados pre-antesis al granos (CPA, i.e. la relación de reservas del tallo movilizadas y el peso de granos por espiga) claramente disminuyó en los cultivares más modernos. La correlación entre la contribución de la espiga y el tamaño de aristas fue despreciable en este estudio. En las líneas isogénicas diferenciadas en los alelos de enanismo Rht, la contribución de la espiga fue mayor cuando los alelos estuvieron presentes, principalmente en plantas no desfoliadas. Sin embargo, no hubo una relación consistente entre el peso de tallo y las respectivas contribuciones de las espigas, sugiriendo que otros factores (además de los alelos de enanismo) están involucrados en el incremento de la contribución de la espiga en el estudio retrospectivo. Capítulo 4: Los objetivos de este capítulo fueron: (1) estudiar la actividad fotosintética (tasa de transporte de electrones o ETR, indirectamente por fluorescencia de la clorofila) durante el llenado de granos, de la hoja bandera, el cuerpo de la espiga y de las aristas en dos cultivares con diferente contribución de la espiga al llenado de granos; (2) analizar la respuesta diferencial de la hoja bandera vs. las aristas al déficit hídrico mediante la medición de variables de estado hídrico (contenido relativo de agua, potencial hídrico) y actividad fotosintética (tasa de transporte de electrones o ETR); (3) estimar la influencia de la presencia/ausencia de aristas en la temperatura del cuerpo de la espiga; (4) analizar si existe correlación entre el tamaño de las aristas vs. la contribución de las aristas/espiga al llenado de granos en seis variedades modernas de cultivares argentinos con distinto tamaño de aristas; (5) explorar si el tamaño de aristas han cambiado durante la última centuria (estudio retrospectivo). En este capítulo hemos reportado que (1) durante el final del llenado de los granos, las partes de la espiga (aristas y particularmente el cuerpo de la espiga, es decir glumas y lemmas) podrían tener mayor actividad fotosintética que la hoja bandera; (2) la presencia de aristas podría tener un efecto levemente favorable (i.e. enfriando) sobre la temperatura de la espiga durante la mañana, pero deletéreo (i.e. aumentando la temperatura de la espiga) después del mediodía; (3) una característica positiva de las aristas es una cierta “tolerancia” al déficit hídrico, manteniendo un contenido relativo de agua y una ETR mayor que la hoja bandera bajo sequía; (4) encontramos una correlación positiva (moderada bajo condiciones de secano) entre el tamaño de las aristas y la contribución de la espiga durante el llenado de granos y (5) en el análisis retrospectivo de los cultivares de trigo pan de Argentina no encontramos una clara tendencia a lo largo de la mejora del tamaño de las aristas ni de la contribución de las aristas durante el llenado de granos.

Los cardiomiocitos poseen en la membrana diferentes transportadores iónicos encargados de regular el pH intracelular (pHi). Cuando el pHi es ácido existen dos mecanismos alcalinizantes responsables de dicha regulación: el intercambiador Na+/H+ (NHE) y el co-transportador Na+/HCO3- (NBC). Estudios previos describen la isoforma 1 de un NBC electrogénico (NBCe1) que en miocardio presenta una estequiometría 1 : 2 (Na+ : HCO3-) y que, además, posee dos bucles extracelulares con propiedades regulatorias (bucles 3 y 4). Experimentos realizados en miocitos aislados demuestran que el bloqueo del bucle 3 inhibe la actividad del NBCe1 y que el bloqueo del bucle 4 la aumenta. Las anhidrasas carbónicas (AC) son una familia de metaloenzimas que catalizan la hidratación reversible del dióxido de carbono (CO2) para producir ácido carbónico (H2CO3) que espontáneamente se hidroliza en HCO3- y H+. Resultados previos demuestran que las AC interaccionan con NHE y NBC formando lo que se conoce como metabolón de transporte iónico. De esta manera, las AC proveen de los iones necesarios para el funcionamiento de dichos transportadores, favoreciendo así la actividad de los mismos. Durante la isquemia-reperfusión (I/R) se producen cambios de pHi, que llevan a la activación de NHE y NBC, a la acumulación intracelular de Na+ y secundariamente a la de Ca2+, por activación del modo reverso del intercambiador Na+/Ca2+. La sobrecarga de Ca2+ es uno de los factores responsables de las alteraciones por I/R. Por lo tanto, las ¨intervenciones cardioprotectoras¨ han sido asociadas a una disminución de la concentración intracelular de este ion. Una de ellas es la llamada ¨reperfusión ácida (RA)¨. En la RA se perfunde al corazón con una solución de pH ácido, lo que reduce la actividad de los mecanismos alcalinizantes como consecuencia de la reducción del gradiente de H+ entre el citoplasma y el exterior celular. Esta menor actividad lleva a una menor sobrecarga de Na+ y por lo tanto, a una menor sobrecarga de Ca2+. El exceso de Ca2+ citosólico determina el aumento de la concentración de este ion en la mitocondria, que conduce a la formación y/o apertura de un poro de alta conductancia denominada poro de permeabilidad transitoria mitocondrial (PPTM). Este evento está ligado a las alteraciones mitocondriales por I/R y a la liberación de factores involucrados en la muerte celular. Distintos mediadores impactan sobre la membrana de los cardiomiocitos y producen la activación de cascadas de señalización que culminan en la mitocondria. Estas cascadas involucran a diferentes proteínas quinasas, entre ellas a las activadas por mitógenos (MAPK), perteneciendo la p38 a una de sus subfamilias. Con respecto a esta proteína quinasa, existen estudios que muestran su papel cardioprotector, mientras que otros señalan su participación en la injuria generada por la I/R. Por todo lo expuesto, el objetivo general de este trabajo de tesis fue examinar la contribución del NBCe1 y de la AC a las alteraciones miocárdicas y mitocondriales producidas por I/R, analizando las vías de señalización involucradas. Específicamente, nuestro estudio se abocó a determinar los efectos de bloqueantes de NBCe1 y AC sobre el tamaño de infarto, la función miocárdica post-isquémica, la capacidad de retención de Ca2+ mitocondrial, la sensibilidad del PPTM al Ca2+ y el potencial de la membrana mitocondrial (Δψm). Otro de los objetivos de esta investigación fue analizar la participación de la p38MAPK en los efectos observados en las distintas intervenciones. Para cumplir con estos objetivos corazones aislados de rata Wistar de 4 a 5 meses de edad, perfundidos por el sistema de Langendorff, fueron sometidos a una isquemia global normotérmica de 30 minutos y luego reperfundidos durante 1 hora. Otros corazones fueron tratados durante los primeros 10 minutos de la reperfusión con un anticuerpo contra el bucle 3 del NBCe1 (a-L3) o con benzolamida (BZ, inhibidor de AC). En otro grupo experimental los corazones fueron tratados durante los 10 minutos previos a la isquemia y los primeros 10 minutos de la reperfusión con 6-etoxozolamida (ETX, inhibidor de AC). Para el protocolo de RA, los corazones fueron perfundidos durante los primeros 3 minutos de la reperfusión con una solución de pH = 6.4. En este grupo la reperfusión se completó hasta alcanzar los 60 min con la solución de pH = 7.4. La aplicación de 30 minutos de isquemia global y 60 minutos de reperfusión produjo un tamaño de infarto de aproximadamente 32 %. Este valor disminuyó significativamente con los tratamientos aplicados, llegando a aproximadamente 10, 6, 11 y 9 % en los grupos a-L3, BZ, ETX y RA, respectivamente. La función sistólica miocárdica disminuyó aproximadamente un 80 % al final del período de reperfusión. El tratamiento con a-L3, BZ, ETX y RA mejoró la recuperación post-isquémica del miocardio y los parámetros evaluados alcanzaron valores mayores a los obtenidos en el CI y S (62, 71, 62 y 55 % respectivamente vs. 20 %). La función diastólica también mejoró con todos los tratamientos. El aumento de la presión diastólica final observado durante la reperfusión fue significativamente menor en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Las alteraciones mitocondriales detectadas en la reperfusión fueron significativamente atenuadas por los tratamientos. Así, la despolarización mitocondrial (Δψm aproximadamente -95 mV) observada en el grupo no tratado fue revertida totalmente, adquiriendo en los grupos tratados con a-L3, BZ, ETX y RA valores aproximados a -140 mV, que fueron similares a los obtenidos en corazones no isquémicos. Las muestras mitocondriales procedentes de los corazones tratados también mostraron una recuperación de la capacidad de retención de Ca2+ y de la respuesta a dicho ion asociada a una menor apertura del PPTM. Con respecto a la p38MAPK, su expresión disminuyó a 41 % en los corazones sometidos a I/R pero aumentó significativamente en presencia de a-L3, BZ, ETX y RA, adquiriendo valores de alrededor de un 135 %. Con el objeto de determinar una posible vía de activación de p38MAPK y un posible blanco de dicha quinasa, evaluamos la expresión de calcineurina (fosfatasa dependiente de Ca2+) y la proteína de choque térmico 27 (en inglés Heat Shock Protein 27, HSP27) en todos los grupos experimentales. Nuestros datos muestran que la expresión de calcineurina aumentó mientras que la de HSP27 disminuyó en los corazones no tratados. El bloqueo del NBCe1, la inhibición de AC y la RA disminuyeron el contenido de calcineurina y aumentaron el de HSP27. Los datos de este trabajo de tesis también muestran que la administración de SB202190, inhibidor de p38MAPK, anula todos los efectos beneficiosos observados en los corazones tratados con a-L3, BZ, ETX y RA. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo de tesis muestran que el bloqueo del bucle extracelular 3 del NBCe1 con a-L3, la inhibición de AC con BZ o ETX y la RA: 1- Disminuyen el tamaño del infarto y aumentan la recuperación post-isquémica de la función sistólica y diastólica miocárdicas. 2- Mejoran el estado mitocondrial, atenuando la despolarización y recuperando la capacidad de retención y de respuesta al Ca2+. 3- Promueven una disminución de la expresión de calcineurina Aβ y un aumento del contenido de P-p38MAPK y P-HSP27. Estos datos indican que una reducción en la sobrecarga de Ca2+, consecuente a una actividad reducida de los mecanismos alcalinizantes, podría producir una menor activación de calcineurina y una activación de la vía p38MAPK-HSP27 que llevaría a la mejora mitocondrial, blanco final de la cardioprotección. Además, estos resultados sugieren que los tratamientos aquí ensayados podrían servir como posibles herramientas terapéuticas para atenuar los daños miocárdicos y mitocondriales producidos por la I/R.

Frente a las consecuencias indeseables del control químico, la demanda pública de alimentos más sanos y el cambio actual de los paradigmas productivos, la tendencia es sustituir total o parcialmente los fungicidas sintéticos por métodos alternativos no contaminantes, en el marco del Manejo Integrado. El trigo es el cereal de mayor distribución geográfica en el mundo y su demanda irá en aumento debido al incremento de la población mundial. La región triguera en la Argentina abarca una zona muy amplia con condiciones favorables para la aparición de diversas enfermedades. Una de ellas, de origen fúngico, es la Septoriosis ó Mancha de la hoja del trigo (Septoria tritici Roberge in Desmaz. anamorfo; Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J. Schroeter, in Cohn teleomorfo). A nivel mundial, ocasiona daños que oscilan entre 31 y 54% de reducción en el rendimiento y en Argentina entre 17 y 50% dependiendo del estado fenológico en el que ocurre la infección. El método utilizado tradicionalmente para el control de la enfermedad es la aplicación de productos químicos sintéticos. El uso masivo de estos productos favoreció la aparición de patógenos resistentes además de las graves consecuencias la contaminación del ambiente. Utilizando microorganismos antagonista, el control biológico, ha tomado relevancia en estos últimos años. Las especies del género Trichoderma son los antagonistas más utilizados para el control de enfermedades de plantas, producidas por hongos, debido a su ubicuidad, a su facilidad para ser aisladas y cultivadas, a su crecimiento rápido en un gran número de sustratos y a que no atacan a plantas superiores. Estas especies basan sus propiedades antagónicas en la activación de mecanismos muy diversos. Uno de ellos es que pueden ejercer el biocontrol de hongos fitopatógenos indirectamente, compitiendo por el espacio y los nutrientes, modificando las condiciones ambientales, estimulando el crecimiento de las plantas y sus mecanismos de defensa. Otra medida, es mediante el micoparasitismo, por la penetración directa de las hifas al hospedador y/o por producción de enzimas extracelulares. El objetivo de este trabajo es presentar un estudio integrado, que combine propiedades: morfológicas, fisiológicas y moleculares de los aislamientos nativos de T. harzianum, para ser utilizarlos como eficientes agentes de control biológico. En este estudio se evaluaron 240 aislamientos de Trichoderma obtenidas de muestras de suelo de diferentes localidades de la región triguera argentina. La capacidad antagónica se ensayó en plántulas de trigo, en invernaculo. Para seleccionar las cepas de Trichoderma harzianum se tuvo en cuenta la capacidad de reducir en un 50 % tanto la superficie necrosada como la cobertura picnidial generada por M. graminicola. Se obtuvieron de esta manera 37 cepas del antagonista. Los resultados presentados hasta el momento evidencian la importancia de resistencia sistémica inducida (RSI) actuando en la defensa de la planta contra M.graminicola. Para la identificación de los aislamientos de Trichoderma se utilizó la técnica de PCR con los cebadores forward THITS-F2 y reverse THITS-R3 los cuales permiten identificar específicamente a T. harzianum. Para la caracterización genética intraespecífica se utilizaron marcadores ISSR. Con los resultados obtenidos se agruparon las cepas, en tres grupos de similitud. Estos grupos no presentaron correspondencia con el origen geográfico, ni con el año de aislamiento y ni con los distintos niveles de antagonismos. Los resultados de la caracterización morfocultural, el crecimiento radial y el color de las colonias, la coloración del medio de cultivo y el tamaño y la forma de los conidios no presentaron diferencias con las descripta en la taxonomía clásica para la especie T. harzianum. La presencia de las clamidosporas y su ubicación en el micelio, fue la característica que demostró mayor variación en el presente estudio. El 27% de las 37 cepas estudiadas no formaron clamidosporas durante el tiempo de duración del ensayo. De aquellas cepas que si las formaron, el 59% se ubicaron de manera intercalar y el 26% tanto terminales como intercalares. Sólo el 15% de las cepas formaron clamidosporas terminales. Los aislamientos se caracterizaron fisiológicamente en base a los siguientes parámetros: crecimiento de las colonias en diferentes fuentes carbonadas y nitrogenadas, crecimiento de las mismas bajo condiciones extremas de temperatura y pH. Los resultados presentaron escasa variabilidad por sí solos y no generaron una discriminación entre las cepas. La caracterización de la actividad enzimática destacó a dos cepas (2 y 8) como capaces de producir altos niveles de β-1-3 glucanasa, quitinasa y proteasa. Es importante resaltar en este estudio la relación encontrada entre las cepas cuando se integraron los atributos morfológicos, fisiológicos y moleculares. Con esta combinación se pudo observar una clara correspondencia entre ellas y su origen geográfico. Como ejemplo de ello, las cepas que integran el grupo I se encuentran divididas en dos ramas bien diferenciadas. Así las cepa 1, 5, 8 y 12 pertenecen a la localidad de Los Hornos y las cepas 160, 162, 165, 170 y 177 a la de Lobería. Con los resultados obtenidos en este trabajo se reconocieron una serie de propiedades (morfológicas, fisiológicas y moleculares) que sumadas a la identificación tradicional de T. harzianum, servirán para ampliar la caracterización de las cepas de esta especie como agentes de biocontrol y seguir su evolución en el tiempo y en medio ambiente cuando éstas se apliquen con fines biotecnológicos.