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Carboxiquinasa fosfoenolpirúvica de levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae): Aislamiento, purificación y propiedades
Joaquín J.B. Cannata A. O. M. Stoppani
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Se ha estudiado la obtención a partir de la levadura de panaderia (Saccharomyces cerevisiae) de la enzima responsable de la fijación de anhídrido carbónico por dicho microorganismo y cuyas propiedades permiten clasificarla, de acuerdo a la nomenclatura adoptada por Utter, como una carboxiquinasa fosfoenolpirúvica que cataliza la carboxilación reversible del fosfoenolpiruvato de acuerdo a la ecuación: *Ver ecuación en tesis* Se ha desarrollado un método de obtención y purificación de la enzima a partir de polvo acetónico de levadura que comprende las siguientes etapas: A) Extracción de la enzima con buffer borato 0.05 M B) Adsorción negativa con gel de fosfato preparado "in Situ". C) Precipitación con sulfato de amonio entre 42 y 55% de saturación final. Diálisis alcalina. para eliminar el sulfato de amonioy la cocarboxilasa. D) Eliminación de nucleatos por precipitación con sulfato de protamina. E) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Ca^++ recogiendo la fracción que cae entre 8.5 y 17% de concentración alcohólica (v/v). P) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. G) Fraccionamiento alcohólico en presencia de iones Zn^++. H) Precipitación con sulfato de amonio. Diálisis. I) Cromatografía en columna de dietil amino etil celulosa (DEAE)(O alternativamente en columna de hidroxilapatita) J) Electroforesis de zona en columna de celulosa. La preparación final se comporta en los experimentos de electroforesis libre y ultracentrifugación analítica como un sistema aparentemente homogeneo. La enzima cataliza el intercambio de C^14 O2 con el carboxilo β del oxalacetato a un pH óptimo cercano a 6.1 siendo la reacción dependiente de la presencia de ATP e iones Mn^++. En esas condiciones se pudo aislar oxalacetato radioactivo como 2-4 dinitrofenilhidrazona, la cual se identificó por cromatografía en papel y radioautografía. La acción activadora que el ADP y el fosfoenolpiruvato ejercían sobre la reacción de intercambio sugirió que ambos compuestos podrian estar involucrados en la reacción de fijación, pero los primeros ensayos de carboxilación directa del fosfoenolpiruvato realizados con extractos poco purificados y en diversas condiciones experimentales fueron negativos. Ello recién fué posible llevando a cabo la reacción de carboxilación en presencia de la transaminasa aspártico-glutámica y glutamato o de la málico dehidrogenass y DPNH. En el primer caso utilizando C^14 O2 se pudo aislar y caracterizar por cromatografía en papel y radioautografia, aspartato radioactivo y en el segundo caso se pudo seguir espectrofotometricamente el curso de la reacción de oxidación del DPNH. La reacción de carboxilación del fosfoenolpiruvato requiere ADPe iones Mn^++ y tiene lugar a un pH óptimo de 5.4. El piruvato mas ATP no pueden reemplazar al fosfoenolpiruvato y ADP. La formación de ATP durante dicha reacción y la estequiometria de la mismase estudiaron utilizando un fosfoenolpiruvato marcado con P^32 en el grupo fosfato y llevando a cabo la reacción en presencia de C^14 O2. La determinación de las radioactividades correspondientes al ATP y oxalacetato formadas en esas condiciones permitió comprobar una estricta relación estequiométrica entre ambas. La reacción es especifica para los polifosfatos de la adenosina, siendo la enzima inactiva con derivados de la guanosina, inosina, citidina y uridina ya sea en la fijación directa o en la de intercambio, en cambio los deoxiderivados de la adenosina resultaron parcialmente activos. Si bien los extractos impuros presentan una parcial actividad en ausencia de cationes divalentes, los extractos altamente purificados son sumamente dependientes de los mismos. El ion Mn^++ es el más activo de todos los cationes divalentes ensayados, siguiendole en importancia, el Zn^++, el Co^++, el Mg^++ y el Cd^++. Se estudió la influencia de la concentración de bicarbonato en la reacción de carboxilación pudiéndose determinar la Km(C02) = 9.9 x 10^-3 M y la Km(CO3H^-) = 5 x 10^-3 M. Los reactivos de tioles ejercen acción inhibidora sobre la enzima. El p-cloromercuribenzoato fue el más efectivo pues en concentración 10^-4 M tuvo una acción inhibidora de casi el 100%.En esas condiciones la enzima puede ser reactivada parcialmente por el glutation reducido, dependiendo el grado de reactivación de la duración del período previo de incubación de la enzima con el inhibidor. El melarsen fué menos efectivo (20% de inhibición con una concentración 0.66 x 10^-3 M). El iodosobenzoato y la N-etilmaleimida en concentraciones 7 x 10^-4 y 5 x 10^-4 M respectivamente fueron inactivos. De los inhibidores de la asimilación de anhídrido carbónico por la célula entera, que se ensayaron; 2-4 dinitrofenol, fluoruro y azida sódica, tan solo el último fue capaz de inhibir en forma significativa a la enzima. La enzima ejerce una marcada acción decarboxilante especificamente sobre el oxalacetato, siendo la reacción dependiente de 1a presencia de concentraciones cataliticas de ATP, reemplazable por ADP ó AMP y sus deoxi-derivados. Los otros nucleósido trifosfatos ensayados carecen de acción activadora sobre la misma. Cuando la reacción se realiza en presencia de ATP, los productos de la reacción son piruvato y fosfoenolpiruvato. Este último compuesto se identificó utilizando ATP marcado con P^32 en los grupos fosfatos ɣ y β y aislando un fosfoenolpiruvato radicactivo. En los trabajos de rutina el fosfoenolpiruvato se determinó por el ortofosfato liberable por nitrato mercúrico. Con ADP ó AMP el fosfoenolpiruvato no se forma durante la reacción de decarboxilación. Se debe descartar 1a posibilidad de que el ATP actúe en concentraciones catalitica en 1a reacción. debido a su regeneración continua a traves del sistema de la quinasa pirúvica, porque si bien se determinó la presencia en los extractos utilizados de esta última enzima, la misma requiere estrictamente la presencia de Mg^++ ó Mn^++, en contraste con lo que ocurre con la actividad oxalacético decarboxilante de la enzima de levadura. que es inhibida por cationes divalentes (Mn^++; Zn^++; Cd+^+; Co^++ y Mg^++). También los agentes complejantes de metales tienen acción inhibidora sobre la mencionada actividad decarboxilante. Así el verseno y la o-fenantrolina en concentraciones 6.7 x 10^-6 y 5 x 10-5 M ejercieron una inhibición cercana al 100%.La 8-hidroxiquinolina y el dietilditiocarbamato de amonio presentan una acción inhibidora comparativamente menor. La acción inhibidora del verseno puede ser suprimida por el agregado de un concentración adecuada de iones Mn^++, pero en ese caso se observa la acción inhibitoria propia del Mn^++. A1 igual que la reacción de fijación, la reacción de decarboxilación es inhibida por los reactivos de tioles, siendo el más efectivo el p-cloromercuribenzoato, siguiéndole en importancia el melarsen, N-etilmaleimida, iodosobenzoato y el iodoacetato. Se discute la posibilidad de que ambas actividades (fijación de anhídrido carbónico y decarboxilación del oxalacetato) correspondan a una misma enzima o bién estén relacionadas con entidades proteicas independientes. Además se describen una serie de experimentos realizados con P^32-fosfoenolpiruvato y C^14 02 que pueden interpretarse como un indicio de la formación de un complejo intermediario enzima-sustrato sobre el que se llevaria a cabo la reacción de carboxilación. Finalmente se discuten los posibles mecanismos enzimáticos involucrados en la reacción, en relación a los resultados obtenidos con la enzima de levadura de panaderia y otras enzimas similares.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1962 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1962
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