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Síntesis de glucanos alfa 1,4 unidos a proteína en músculo cardíaco de rata
Marta Liliana Blumenfeld Clara R. Krisman de Fischman
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El glucógeno es el polisacárido de reserva presente en tejidos animales, así como también en algunas plantas superiores, hongos y bacterias. Es un homopolímero ramificado de moléculas de D-glucosa, unidas entre sí por uniones glucosídicas α 1,4, mientras que en los puntos de ramificación presenta uniones α 1,6. En la síntesis del glucógeno intervienen dos enzimas: la glucógeno sintetasa (UDP-Glc: α 1,4-glucan-α 1,4 glucosil transferasa) y la enzima ramificante (α 1,4-glucan-α 1,4 glucan-6 glucosil transferasa). La glucógeno sintetasa cataliza la transferencia de restos glucosilo de un nucleótido-glucosa específico (UDP-Glc ó ADP-Glc según el organismo) al extremo no reductor de una molécula aceptora del tipo del glucógeno que puede llegar a ser tan pequeña como maltotriosa. Una vez sintetizada una cadena glucosídica α 1,4 de largo suficiente, la enzima ramificante produce un reordenamiento de la misma, formando un punto de ramificación α 1,6. Este esquema de síntesis corresponde en realidad a un mecanismo de alargamiento de glucanos α 1,4 preexistentes. El hecho de que la glucógeno sintetasa requiera un "primer" o aceptor para los residuos de glucosa que se van a transferir plantea, por lo tanto, el problema de cómo se lleva a cabo la síntesis "de novo" del glucógeno. Es decir, cómo se sintetiza una molécula de glucógeno cuando en la célula no existe aceptor para la glucógeno sintetasa. Se ha demostrado que fracciones microsomales de hígado de rata y de Escherichia coli carentes de glucógeno transfieren marca radioactiva a partir de nucleótido-(14C)glucosa a un compuesto insoluble en ácido tricloroacético (TCA), que es sensible a la digestión con enzimas amilolíticas o proteolíticas. En base a estos resultados y evidencias adicionales, Krisman ha postulado que la síntesis "de novo" del glucógeno involucraría una etapa inicial de formación de una glucoproteína catalizada por una enzima distinta de la glucógeno sintetasa. Los glucanos así sintetizados, unidos covalentemente a la proteína, servirían a su vez como "primers" para la acción conjunta de la glucógeno sintetasa y la enzima ramificante. Se formarían entonces moléculas de glucógeno unidas a proteína que serían liberadas de la misma por acción de enzimas de tipo amilolítico, proporcionando así aceptores para la síntesis del glucógeno no unido a proteína, según el esquema clásico. Este modelo ha sido apoyado por la demostración de la existencia "in vivo" de glucógeno unido a proteína (desmoglucógeno) en sistemas tales como hígado y corazón de rata. En el caso particular del músculo cardíaco de rata, se ha descripto que alrededor del 50% del glucógeno extraíble por agua a 100°C, es insoluble en TCA, y que 25% del polisacárido sigue precipitando con ácido aún después de digestión con solución alcalina caliente. Por otra parte, el glucógeno insoluble en TCA puede ser solubilizado por proteólisis. Estos resultados, si bien no demuestran la existencia de una unión covalente entre polisacárido y proteína, sugieren una fuerte asociación entre ambos. Con el objeto de ampliar y generalizar las observaciones realizadas en hígado de rata y E. coli, y considerando que el músculo cardíaco de rata constituía un sistema adecuado, se estudió la formación de glucanos α 1,4 unidos a proteína y su probable papel como intermediarios en la síntesis "de novo" del glucógeno. Los resultados obtenidos se resumen a continuación. - Se puso a punto la preparación de fracciones microsomales de músculo cardíaco de rata con muy bajo contenido de glucógeno. - Después de incubar estas preparaciones enzimáticas con UDP-(14C)Glc, se incorporó radioactividad a un aceptor endógeno presente en una fracción insoluble en TCA 10% (fracrión TCApp), y en menor grado a una fracción soluble en ácido e insoluble en alcohol (fracción TCAsol-EtOHpp). La actividad enzimática en ausencia de "primer" se denominó GS-2. La insolubilidad en ácido de la (14C)glucosa incorporada indicó que el producto mayoritario de la reacción GS-2 era un glucoconjugado, y que la aglicona era probablemente una proteína. La radiomarca insoluble en TCA fue precursora de la presente en la fracción TCAsol-EtOHpp. Esto requirió la incorporación previa de restos glucosilo del UDP-Glc. Las curvas de tiempo de la actividad GS-2 presentaron un período "lag" que varió con la concentración de UDP-Glc y con la preparación. Este período de latencia correspondió a la formación de un mejor aceptor para la transferencia de restos glucosilo del UDP-Glc, ya que desapareció al preincubar las mezclas de reacción con nucleótido-azúcar no radioactivo. Las preparaciones enzimáticas presentaron también actividad de glucógeno sintetasa (actividad GS-1), medida como la incorporación de glucosa del UDP-Glc al glucógeno exógeno presente en el precipitado etanólico de la mezcla de reacción digerida con KOH (fracción KOH-EtOHpp). El agregado de glucógeno durante el ensayo GS-2 inhibió la incorporación de (14C)glucosa a la fracción TCApp, pero aumentó la correspondiente a TCAsol-EtOHpp. En este caso, la reacción se llevó a cabo sin período "lag", al igual que lo que ocurrió con el ensayo GS-1. Por lo tanto, el aceptor endógeno era distinto, al menos en parte, que el glucógeno exógeno, el cual era un mejor sustrato para la transferencia de restos glucosilo. Se estudiaron algunas propiedades de la actividad GS-2 (curva de UDP-Glc, efecto de la preincubación, concentración de proteínas y temperatura), así como diversas propiedades comparativas de las actividades GS-1 y GS-2 (efecto del DTT, sales, nucleótidos de uridina y adenina, y otros activadores e inhibidores, PH, y especificidad del nucleótido-azúcar). Se concluyó que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas por la misma enzima, la glucógeno sintetasa, y que las diferencias observadas en algunos casos se debían a la variación del cosustrato aceptor de la reacción: glucógeno exógeno para GS-1 y aglicona endógena para GS-2. Los productos radioactivos insolubles en TCA, sintetizados durante la reacción GS-2 fueron degradados por α- o β-amilasas, amiloglucosidasa o proteasa libre de amilasa. El grado de sensibilidad a la digestión con enzimas amilolíticas correspondió al de una estructura ramificada semejante a la del glucógeno nativo. La radioactividad insoluble en ácido se solubilizó por tratamiento ácido suave (HCl 0,01 ó 0,1 N, 15 min, 100°C). La cinética de ambas hidrólisis sugirió que la (14C)glucosa estaba unida a la aglicona por al menos dos tipos de uniones distintas, cuyos t1/2 eran similares al de la unión ésterfosfato. La permetilación e hidrólisis ácida total de los compuestos liberados por HCl 0,1 N confirmaron que la porción sacarídica del glucoconjugado sintetizado durante la reacción GS-2 tenía la estructura ramificada del glucógeno nativo. Se purificó parcialmente la glucógeno sintetasa, separándose cromatográficamente dos especies enzimáticas: una, que presentaba las actividades GS-1 y GS-2 (fracción D1A), y otra que solo tenía actividad GS-1 (fracción D2A). La actividad GS-2 de D1A fue estimulada por Glc-6-P y, en menor grado, por otros ésteres fosfato. Estos compuestos activaron de forma semejante la actividad GS-1. La fracción D2A, que no presentaba actividad GS-2, también fue activada por estos compuestos. La fracción D1A no fue capaz de sintetizar glucanos insolubles en ácido a partir de aceptores exógenos no unidos a proteína (maltosacáridos o glucógeno), indicando que los aceptores endógenos de la actividad GS-2 no eran de este tipo. Al igual que en el caso de las fracciones microsomales, los compuestos radioactivos insolubles en TCA sintetizados por D1A fueron sensibles a la degradación amilolítica o proteolítica. Se desarrolló un método de detección "in situ" de actividad de glucógeno sintetasa en geles de poliacrilamida en condiciones nativas. Este método permitió determinar que las actividades GS-1 y GS-2 eran catalizadas por una misma proteína. Por otra parte, dado que se pudo detectar actividad en ausencia de "primer" después de una corrida electroforética, se concluyó que la enzima y el aceptor endógeno de la reacción GS-2 estaban fuertemente asociados, ya que migraban juntos en electroforesis. Los productos de reacción de GS-2 sintetizados por D1A se analizaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Se observó migración de (14C)glucosa tanto en condiciones nativas como desnaturalizantes. En este último caso se comprobó que la movilidad de las bandas radioactivas disminuía en función del tiempo de incubación. Por otra parte, la radioactividad desapareció después de incubar las mezclas con α-amilasa. Cuando se estudiaron muestras provenientes de un pulso con UDP-(14C)Glc y posterior "chase" con nucleótido-azúcar no radioactivo, se verificó que las especies radioactivas de mayor movilidad daban lugar, después del "chase" a las de menor migración. Por su parte, las bandas radiomarcadas más móviles se regeneraron por incubación de las mezclas de reacción con amiloglucosidasa. La preincubación de la fracción D1A con α-amilasa insoluble produjo una notable disminución de la actividad GS-2 sin afectar mayormente la actividad GS-1 de la preparación. En consecuencia, se demostró que las preparaciones enzimáticas de músculo cardíaco de rata estudiadas en el presente trabajo de tesis catalizaban la síntesis "in vitro" de glucanos α 1,4 unidos a proteína. El aceptor proteico tenía, en este caso en particular, glucanos presintetizados "in vivo", los que eran alargados por la glucógeno sintetasa durante el ensayo GS-2, y en el caso de las preparaciones microsomales, eran ramificados por la enzima ramificante. Se formaban así moléculas del tipo del glucógeno, unidas a proteína, coincidiendo con lo postulado en el modelo de Krisman para la iniciación de la biosíntesis del glucógeno. Por lo tanto, aún cuando en el caso particular de esta tesis, el ensayo GS-2 no constituyó un sistema de estudio de la iniciación propiamente dicha, la síntesis "in vitro" de los intermediarios (proteoglucanos) apoya fuertemente el modelo antes mencionado.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1986 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1986
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