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Sistema modelo para el estudio de resistencia a bacteriófagos de Lactococcus lactis aislados en Argentina
Susana Marta Valladares de Fabrizio José Luis Parada
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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
Es bien conocido que la presencia de bacteriófagos puede afectar las fermentaciones lacticas causando la lisis de las cepas de lactococos utilizadas como starters y ocasionando perdidas significativas en la producción de quesos y otros productos lácteos. Los principales objetivos del presente trabajo fueron la caracterización de los bacteriófagos de cabeza alargada, aislados en Argentina (fagos ARG)y el desarrollo de un sistena modelo para el estudio de la resistencia a fagos liticos (Lpr), encontrada en las mutantes espontáneas aisladas como resistentes a fagos ARG, además de la implenentación de estrategias conjugativas para la transferencia de Lpr a otras cepas de L. lactis, con el propósito de construir cepas resistentes a fago, de utilidad tecnológica. Por otra parte, se enfocaron estudios comparativos de los fagos ARG en relación a un núlero de fagos aislados en USA (US) y sus correspondientes cepas de propagación, utilizadas como starters por la industria láctea de ese pais. Adicionallente, se dispuso la determinación de la resistencia a antimicrobianos para las cepas del sistema modelo investigando su posible localización cromosomal o ligada a plásmidos y comparando el patrón de resistencia obtenido con el de dos cepas representativas de L. lactis gue suelen utilizarse como starters. Tambien se encararon estudios sobre el efecto del cloro cono agente de control y sobre la inactivación térmica de los fagos ARG y DS determinando los tiempos de reducción decinal a 70°C (valores D70)a traves de distintas metodologias. Los fagos ARG y DS fueron aislados a partir de sueros de queso de Plantas lácteas de Argentina y USA, y sus correspondientes cepas huésped de L. lactis provinieron de starters comerciales tambien utilizados en la industria, excepto L. lactis ssp. lactis C2, cepa de propagación de los fagos ARG, originalmente procedente del laboratorio del Dr. L. McKay. Iniciallente, se verificaron las claves bioquilicas del genero, especie y subespecie para estas cepas, anteriorlente denominadas Streptococcus lactis y Streptococcus cremoris las que, segun lo confirmado de acuerdo con la nueva taxonomía, corresponden a Lactococcus lactis ssp. lactis y ssp. cremoris, respectivalente. Los fagos ARG, únicos fagos de L. lactis descritos en Argentina, resultaron ser fagos de remarcable poder litico y de morfología alargada, en contraposición con la mayoria de los fagos de USA y de otros paises. predominantenente isométricos, lo que motiva que el estudio de estos fagos ARG y la resistencia a los misnos, se torne de particular interés. Desde el punto de vista serológico los fagos ARG pudieron incluirse en uno de los dos grupos serológicos en que han sido clasificados los fagos US. El priner grupo, denominado D59-l/F4-l, en el cual fueron incluidos los fagos ARG, es compartido tanto por fagos de morfologia alargada, como isométrica. Ademas, se observó una marcada homología antigénica entre los fagos ARG y el fago US D59-1, indicando un estrecho grado de relación a pesar de su distinto origen y región geografica. Los estudios sobre inactivación termica en leche revelaron valores D70 entre 20 y 38 min, resultando notablemente mas altos que los obtenidos en caldo M17, los que apenas superaron los 10 min. Se verificó además, la inusual resistencia térmica del fago US F29-1, marcadamente superior a los valores mencionados. El efecto protector de la leche tambien se evidenció en los tratamientos con hipoclorito de sodio necesitándose una concentración de 2000 ppm durante 3 min para reducir en 6 log la población inicial, en tanto que en caldo M17 fueron necesarias sólo 300 ppm para inactivar la misma población en iguales condiciones. Los valores de inactivación han demostrado que las condiciones de higiene y pastenrización en la industria láctea no siempre resultan suficientes para inactivar la totalidad de los fagos e impedlr su proliferación en el ambiente de la Planta. Por otro lado, se deterninaron los tienpos de muerte térmica mediante dos metodologías distintas. A través de la técnica de Daoust modificada, denoninada metodologia 2, se obtuvo una relación lineal entre los tiempos de tratamiento y la destrucción de los fagos, mientras que las misnas graficas obtenidas por la metodologia l, en tubos pequeños sellados, presentaron una típica desviación de la linealidad, frecuentemente bifasica, que es usualleute observada. Esta desviación puede ser explicada en función del fenómeno de agregación que se observa en las suspensiones de fagos inactivados por la metodologia l, aunque no se detectó para las suspensiones de fagos inactivadas por la metodologia 2. No obstante los valores D obtenidos por ambas técnicas presentan una buena correlación (r2 = 0,99), si el valor D es estilado a partir de la primera fase de las curvas. También fueron aisladas mutantes resistentes a fago a partir L. lactis ssp. lactis C2, cepa de propagación de los fagos ARG. La resistencia encontrada resultó estable incluso durante largos periodos de subcultivo y de almacenamiento. Por otra parte, propiedades tecnológicas apreciadas, como la coagulación rapida de la leche a 22°C se mautuvieron intactas en las mutantes. Cuando estas cepas fueron enfrentadas a 13 fagos US de distinto grupo morfológico y serológico se observó que las mutantes de C2 resultaban resistentes a los fagos isométricos, tal como podía esperarse ya que la cepa original C2 también lo era, pero también resultaron resistentes a otros fagos US de cabeza alargada indicando que se estaba en presencia de un mecanismo de resistencia particularmente efectivo contra fagos de este grupo morfológico. Los datos de los parámetros de multiplicación de los fagos ARG obtenidos sobre las mutantes, demostraron que la resistencia detectada se trataba de un mecanismo de interferencia en la adsorción del fago a la célula. Además se llevaron a cabo ensayos adicionales para descartar la existencia de un estado lisogenico, o la posible presencia de algún mecanismo sensible al calor o de modificacion- restricción controlado por el huésped, teniendo en cuenta que algún otro mecanismo de defensa contra fagos alargados pudiera encontrarse activo en estas cepas. Los perfiles de plasmidos de la cepa C2 y de las mutantes resultaron iguales salvo para una de ellas, no viéndose afectada en ningún caso la expresión de Lpr+. El curado sucesivo de los plasmidos de las mutantes tampoco afectó la resistencia a fago, pareciendo indicar una localización cromosomal para Lpr. Con la intención de determinar si el marcador Lpr resultaba movilizado por conjugación se utilizó la cepa LM2302, un derivado libre de plásmidos de C2 con dos marcadores antibióticos, para efectuar cruces con las mutantes quedando constituído un sistema que junto con los fagos ARG, permitió conocer las acerca del mecauismo de resistencia encontrado. Se diseño entonces un sistema modelo para el estudio de la resistencia a fagos ARG utilizando la cepa original C2 (Lpr-) y sus mutantes (Lpr+) C23 y C26, asi como la cepa LM2302 derivada libre de plásmidos de C2. Las experiencias de transconjugación mostraron que si bien el curado de plásmidos no afectaba la expresión de Lpr+, este caracter podia ser co-trausferido por conjugación en un pláslido de 45 kb que codifica la capacidad de fermentar lactosa (Lac+). Para completar el sistema modelo se incorporaron dos transconjugantes representativos de estos cruces eligiéudose a TC26-B por tener el contenido de plásmidos completo, y a TC23-B porque posee como único plásmido el de lactosa (Lac+) de 45 kb, que además codifica la resistencia a fagos liticos alargadas. los resultados sugieren la posibilidad de que la secuencia de DNA que codifica Lpr estuviera inicialmente integrada al cromosoma y, que por reacomodamientos del DNA durante la conjugación, resultara incorporada en forma especifica al plásnido de 45 kb. También es posible que se trate de una transposición de un segmento de DNA que pudiera encontrarse alternativasente en el plásmido de 45 kb o en el cromosoma. Por otro lado, se logró extender el fenotipo Lpr+ por conjugación a otras cepas no isogenicas. Para ello, la cepa TC23-B fue elegida como portadora del plásmido de 45 kb denominado pTC23-B (Lac+ Lpr+) y fue utilizada como dadora del mismo en subsecuentes transferencias por conjugación a otras dos cepas no isogénicas de L. lactis ssp. lactis y ssp. cremoris, representativas de starters utilizados en USA. A este fin, se desarrolló una estrategia de conjugación eludiendo la utilización de marcadores antibióticos para la selección. De esta forma se logró transferir el pTC23-B a cepas de ssp. lactis y ssp. cremoris curadas de su plásmido de lactosa (Lac-) restituyéndoles el fenotipo Lac+ propio de TC23-B y confiriéndoles resistencia a fago a cepas no portadoras de marcadores de resistencia a antibióticos gue resultan aptas para su uso alimentario y de gran utilidad tecnologica. Adicionalmente, se estudio la sensibilidad a antimicrobianos en las cepas del sistema modelo, mutantes y transconjugantes, para investigar si las resistencias halladas eran cromosomales o estaban detersinadas por plásmidos. Además se comparó el patrón de resistencia obtenido, con el de las dos cepas no lisogénicas representativas de los starters, ssp. lactis 37-1 y la ssp. cremoris 59-1. Las cepas tanto de la ssp. lactis como de la ssp. cremoris se mostraron sensibles a la mayoria de los 36 antibióticos ensayados. Esto, resulta esperable, en función de su escaso contacto con antimicrobianos, a diferencia de las cepas de origen clinico, sonetidas a presión selectiva por antibióticos. Entre los 9 antimicrobianos a los que las cepas resultaron resistentes o de sensibilidad intermedia se eligieron 6 como representativos, determinándose su concentración mínima inhibitoria (CIM). Por otro lado, los patrones de sensibilidad antimicrobiana resultaron idénticos para las cepas del sistema modelo tanto para C2 y las mutantes resistentes a fago, como para la cepa libre de plasmidós y las transconjugantes sugiriendo una localización cromosomal de la resistencia a antimicrobianos. Finaluente, se evaluaron en forma preliminar las aptitudes tecnológicas de los starters construidos por conjugación determinando el tiempo de coagulación de la leche a 22°C y la variación del pH por incubación a 30°C, las que sumadas a la eficacia de Lpr contra fagos de alto poder litico y a su estabilidad durante periodos prolongados, determinan la utilidad de estas cepas para su aplicación tecnológica en la industria láctea.Palabras clave – provistas por el repositorio digital
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Disponibilidad
| Institución detectada | Año de publicación | Navegá | Descargá | Solicitá |
|---|---|---|---|---|
| No requiere | 1992 | Biblioteca Digital (FCEN-UBA) (SNRD) |
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Información
Tipo de recurso:
tesis
Idiomas de la publicación
- español castellano
País de edición
Argentina
Fecha de publicación
1992
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