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Rol de los oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en Schizosacchatomyces pombe

Cecilia D’Alessio Armando J. Parodi

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Resumen/Descripción – provisto por el repositorio digital
El retículo endoplasmático (RE) es el compartimiento de varias modificación post-traduccionales y plegamiento de proteínas destinadas a secreción, a membrana plasmática o a organelas del sistema endocítico. Una de las modificaciones post-traduccionales mas frecuentes, la N-glicosilación, está relacionada con el plegamiento de las proteínas ya que sin la adición de N-glicanos, numerosas especies proteicas son incapaces de alcanzar su conformación nativa. Los intermediarios de plegamiento, las proteínas oligoméricas no totalmente ensambladas, las proteínas mal plegadas y los agregados son selectivamente retenidos en el RE. El transporte hacia el aparato de Golgi ocurre solamente cuando las proteínas se han plegado y ensamblado correctamente. El mecanismo que asegura la funcional de las proteínas que salen del RE, ha sido denominado “control de calidad del plegamiento de glicoproteínas". En la mayoría de los eucariotas la N-glicosilación comienza con la transferencia de un oligosacárido de composición Glc3Man9GlcNAc2 desde un intermediario lipídico (dolicol difosfato) a la secuencia Asn-X-Ser/Thr de proteínas nacientes en el RE. Las tres glucosas terminales del oligosacárido transferido son inmediatamente removidas pordos glucosidasas del RE, I y II (GI y GII). Parodi y colaboradores demostraron la existencia de una reglucosilación transitoria de los N-oligosacáridos libres de glucosa dentro del RE por la acción de la enzima luminal UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). Esta enzima glucosila glicoproteínas, en ensayos libres de células, sólo si éstas han sido previamente desnaturalizadas. Por esta característica especial se ha propuesto a la GT como posible sensor del estado conformacional de las glicoproteínas en el RE. Los oligosacáridos monoglucosilados, que se generan por la deglucosilación parcial por la GI (encargada de remover la glucosa más externa) y GII (encargada de remover las dos glucosas más internas) y por la actividad de la GT, permiten la interacción de las glicoproteínas con dos lectinas del RE, la calreticulina (CRT) y/o calnexina (CNX). Esta interacción facilita el plegamiento de las glicoproteínas, evita la formación de agregados, permite la interacción de las glicoproteínas unidas a CNX con otras chaperonas del RE y constituye un mecanismo para retener en el RE las estructuras proteicas mal plegadas. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe existen todos los componentes del modelo de control de calidad de glicoproteínas en el RE, ya que esta levadura expresa actividad GT y posee un homólogo de CNX. Además, el oligosacárido transferido a polipéptidos nacientes es Glc3Man9GlcNAc2 y este compuesto es procesado en el RE a Man9GlcNAc2, indicando la presencia de actividades GI y GII. La disrupción del gen que codifica la CNX en S. pombe ha resultado ser letal para estas células. Sin embargo una mutante deficiente en actividad GT (mutante gpt1) obtenida en nuestro laboratorio no posee ningún fenotipo distintivo. Esto planteó el interrogante de cuál es la importancia y el rol de la formación de oligosacáridos monoglucosilados en el plegamiento de glicoproteínas en estas levaduras. En este trabajo se realizaron además experimentos destinados a analizar si una conformación mal plegada es condición suficiente para para la glucosilación de todos los olgosacáridos N-unidos a proteínas por la GT in vivo, tal como ocurre in vitro. En este trabajo de Tesis se presentan evidencias genéticas de la estructura heterodimérica propuesta para la GII. La GII de S. pombe está compuesta de dos subunidades GIIα y GIIβ. La actividad catalítica está presente en la subunidad GIIα, que carece de señal conocida para permanecer en el RE. La subunidad GIIβ posee en el extremo C-temiinal el tetrapéptido VDEL, homólogo a conocidas señales de retención/recuperación en el lumen del RE. En S. pombe la CNX es esencial para la viabilidad celular. Sin embargo, la disrupción del gen que codifica para GIIα abolió totalmente la formación de oligosacáridos monoglucosilados, tanto por deglucosilación del compuesto transferido a las proteinas como por reglucosilación mediada por la GT. Estas mutantes de S. pombe resultaron viables a todas las temperaturas ensayadas. Esto significa que la CNX y no los oligosacáridos monoglucosilados son esenciales para esta levadura en condiciones normales de crecimiento. Si bien la formación de oligosacáridos monoglucosilados no es esencial para la viabilidad celular, células defectivas total (mutantes GIIα-) o parcialmente (mutantes GIIβ- o GT-) en la formación de oligosacáridos monoglucosilados presentaron una acumulación de proteínas mal plegadas en el RE en ausencia de estrés adicional. Esto se evidenció por la inducción de mensajeros que codifican para chaperonas del RE (respuesta a proteínas mal plegadas o UPR). La acumulación de proteínas mal plegadas en estas mutantes se evidenció además por la presencia en sus glicoproteínas de una mayor proporción de oligosacáridos con estructuras específicas del RE y no del aparato de Golgi. Los glicanos sintetizados por estas mutantes son similares a los obtenidos cuando se agregó a células salvajes un agente reductor que provoca un mal plegamiento en las glicoproteínas que se están sintetizando en el RE. Tal como fue descripto para células de mamifero, en células intactas de S. pombe la formación de oligosacáridos monoglucosilados reduce la velocidad de plegamiento, pero incrementa su eficiencia. Esto fue evidenciado por una comparación de la cantidad de carboxipeptidasa y la velocidad de llegada a la vacuola de esta proteína en células salvajes y GIIα-. Este resultado indicó que los oligosacáridos monoglucosilados están involucrados en la facilitación del plegamiento de las glicoproteínas de S. pombe. La formación de proteínas mal plegadas causada tanto por el agregado de una agente que impide la formación de puentes disulfuro (ditiotreitol) a células intactas, como por un shock de calor, no fueron condiciones suficientes para la glucosilación in vivo mediada por la GT. dichos tratamientos no resultaron en un aumento generalizado de la glucosilación. La explicación para este resultado podría estar en las restricciones de la GT para reconocer sus sustratos: aparentemente la GT sólo glucosilaría glicoproteínas que presentan una estructura parcial o un intermediario del plegamiento con flexibilidad limitada, ausente en las formas completamente desplegadas. Estos resultados sugieren que las glicoproteínas que se pliegan en el RE son sometidas al sistema de control de calidad del plegamiento en las etapas finales del proceso de plegamiento.
Palabras clave – provistas por el repositorio digital

GLUCOSIDASA II; GLUCOSILTRANSFERASA; PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS; SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE; GLUCOSIDASE II; GLUCOSYLTRANSFERASE; GLYCOPROTEIN FOLDING

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